Glas methylen ac ocsid nitrig: NOS, cGMP, a signalau fasgwlaidd

Mae'r cwestiwn yn swnio'n syml: a yw glas methylen yn atal ocsid nitrig? Yn y labordy, mae'r ateb yn rhannu'n bedwar cwestiwn ar wahân, ac mae gan bob un brawf arbrofol gwahanol. Cymysgu'r rhain yw'r prif reswm pam mae ysgrifennu am las methylen ac ocsid nitrig yn darllen fel rhywbeth hyderus ond amwys.

Meddyliwch am y signal ocsid nitrig fel cadwyn â phedair dolen. Caiff genyn ei drawsgrifio i greu synthas ocsid nitrig. Mae'r ensym yn trosi arginin yn ocsid nitrig. Mae'r nwy yn tryledu at ei darged cyn iddo adweithio â rhywbeth arall. Mae cyclas guanylad hydawdd yn ei ganfod ac yn creu GMP cylchol. Mae effeithiau glas methylen wedi'u cyhoeddi ar bob dolen, ond daw'r dystiolaeth o baratoadau gwahanol, crynodiadau gwahanol, ac isoformau gwahanol. Nid yw canlyniad ar un ddolen yn profi gweithred ar un arall.

Y gadwyn ganonaidd, mewn geiriau plaen

Yn wal pibell waed, mae'r dilyniant safonol yn mynd fel hyn. Mae ysgogiad yn gweithredu ar gell endothelaidd. Mae synthas ocsid nitrig endothelaidd, o'r enw eNOS neu NOS3, yn creu pwls bach o ocsid nitrig. Mae'r nwy yn tryledu i mewn i'r gell cyhyr llyfn gyfagos, yn rhwymo wrth hem haearn rhydwythiedig cyclas guanylad hydawdd, ac yn cyflymu trosi GTP yn GMP cylchol. Mae GMP cylchol yn actifadu cinas protein G, mae'r ffordd y caiff calsiwm ei drin yn newid, ac mae'r cyhyr yn ymlacio.

Mae ail gadwyn sy'n werth ei chadw ar wahân. Yn ystod haint neu amlygiad i gytocinau, mae celloedd yn trawsgrifio ensym gwahanol, synthas ocsid nitrig anwythadwy neu iNOS, a elwir hefyd yn NOS2. Mae'n cynhyrchu llifoedd ocsid nitrig mwy sy'n para'n hirach na rhai eNOS. Mae trydydd isoform, NOS niwronaidd neu nNOS, yn perthyn i gyd-destun arall eto. Pan fydd papur yn dweud synthas ocsid nitrig heb nodi'r isoform, arhoswch a gwiriwch pa un a fesurwyd. Mae'r trosolwg o sut mae glas methylen yn symud electronau yn gwneud yr un pwynt am dargedau rhydocs yn gyffredinol: nid yw'r ras gyfnewid yn gwneud dim ar ei phen ei hun, a'r partner ar bob pen sy'n pennu'r canlyniad.

Mae GMP cylchol a fesurir hefyd yn ddarlleniad integredig, nid yn brawf ensym uniongyrchol. Mae ei lefel yn adlewyrchu synthesis gan y cyclas minws dadelfennu gan ffosffodiesterasau, yn enwedig PDE5 mewn cyhyr llyfn fasgwlaidd. Felly, mae gostyngiad mewn GMP cylchol yn golygu bod llai o signal wedi cyrraedd y synhwyrydd. Nid yw hynny ynddo'i hun yn nodi pa ddolen a fethodd.

Dolen 1: cynhyrchir llai o'r ensym iNOS

Mewn macroffagau llygod a ysgogwyd â lipopolysacarid bacteriol, interfferon gama, neu'r ddau, ataliodd glas methylen y cynnydd disgwyliedig mewn protein iNOS ac atalodd RNA negesydd iNOS yn gryf yn yr arbrofion trawsgrifio mewn macroffagau. Y rhan sy'n taflu goleuni ar y mecanwaith yw'r hyn na newidiodd. Arhosodd dadelfennu'r atalydd I kappa B alpha, ffosfforyleiddio NF kappa B a STAT1, a symudiad y ffactorau hynny i mewn i'r cnewyllyn yn gyfan i raddau helaeth. Yr hyn a ostyngodd oedd eu rhwymiad wrth DNA, a gadarnhawyd gan imiwnowaddodiad cromatin a ddangosodd lai o feddiannaeth ar hyrwyddwr iNOS.

Effaith ar reoleiddio genynnau yw hon, i fyny'r afon o faint yr ensym sy'n bresennol, nid atal ensym presennol yn acíwt. Mae'n perthyn i signalau llidiol, lle mae'n rhaid i ffactorau trawsgrifio rwymo wrth hyrwyddwr cyn i brotein ymddangos. Nid yw'n dweud dim yn uniongyrchol am eNOS cyfansoddol mewn pibell wrth orffwys, a dylid ei disgrifio yn y termau hynny.

Dolen 2: mae'r ensym NOS presennol yn gweithio'n arafach

Profodd astudiaeth mewn llygod mawr lefel wahanol. Cafodd llygod mawr gwrywaidd ymwybodol lipopolysacarid yn fewnwythiennol, ac yna dair awr yn ddiweddarach naill ai hydoddiant halwynog neu las methylen ar 3 mg fesul kg yn fewnwythiennol. Mesurwyd gweithgarwch synthas ocsid nitrig yn yr hypothalamws gwaelodol canolig drwy drosi arginin wedi'i labelu yn sitrwlîn yn yr astudiaeth o weithgarwch NOS hypothalamig. Roedd straen ynghyd â hydoddiant halwynog yn unig yn anwytho rhywfaint o weithgarwch annibynnol ar galsiwm, a chododd lipopolysacarid hwn i tua deg gwaith y lefel reoli. Dileodd glas methylen y ddwy gydran a anwythwyd. Ni newidiodd gweithgarwch cyfansoddol dibynnol ar galsiwm yn y feinwe honno ar y dos hwnnw a'r pwynt amser hwnnw.

Darllenwch y canlyniad hwnnw yn union fel y'i hysgrifennwyd: ataliwyd gweithgarwch mesuredig o fath iNOS o dan yr amodau hynny. Nid mesuriad o fynegiant genynnau ydyw, ac nid yw'n brawf o ddetholusrwydd parhaol ar gyfer iNOS dros eNOS neu nNOS. Mae gwaith ar ensymau wedi'u puro yn cryfhau'r rheswm dros fod yn ofalus. Mewn profion uniongyrchol o synthas ocsid nitrig wedi'i buro, ataliodd glas methylen ffurfiant sitrwlîn yn llwyr ar 30 micromolar, gyda chrynodiad a ataliodd hanner y gweithgarwch yn agos at 5.3 micromolar heb ddismwtas uwchocsid a 9.2 micromolar gydag ef, fel yr adroddwyd yn y gymhariaeth o NOS wedi'i buro a cyclas guanylad. Roedd astudiaeth ar wahân o nNOS wedi'i buro yn awgrymu bod ocsidiad hem wedi'i rwymo wrth yr ensym yn rhan o'r mecanwaith. Y wers ymarferol yw bod atal NOS yn uniongyrchol yn digwydd mewn systemau ynysig, ond ni ellir ymestyn canlyniad yr hypothalamws yn honiad cyffredinol bod glas methylen yn gadael pob NOS cyfansoddol heb ei effeithio ym mhobman.

Dolen 3: collir ocsid nitrig cyn iddo gyrraedd

Daw'r arddangosiad cliriaf y gall rhywbeth heblaw atal ensym esbonio gostyngiad mewn GMP cylchol o gelloedd cyhyr llyfn rhydwelïau pwlmonaidd cwningod wedi'u meithrin. Roedd y cynllun yn osgoi NOS mewndarddol yn llwyr drwy ychwanegu rhoddwyr ocsid nitrig yn uniongyrchol, ac yna'n gofyn a oedd glas methylen yn dal i atal yr ymateb GMP cylchol yn yr astudiaeth o uwchocsid mewn cyhyr llyfn fasgwlaidd.

Profwyd tri rhoddwr o 1 i 100 micromolar: S nitroso L cystein, nitroprwsid sodiwm, ac analog sefydlog wedi'i ddiamineiddio o'r enw MPANO. Cododd pob un GMP cylchol i rhwng tua 1.5 gwaith a 12 gwaith y lefel wreiddiol. Ataliodd glas methylen ar 10 micromolar y ddau gyntaf o 51 i 100 y cant a gadawodd ymateb MPANO heb ei newid. Pe bai glas methylen yn syml yn blocio safle catalytig y cyclas, byddai'r detholusrwydd hwn rhwng rhoddwyr yn anodd ei esbonio, oherwydd bod y tri yn cydgyfeirio ar yr un ensym i lawr yr afon.

Yna nododd tri phrawf rheoli mai uwchocsid oedd yn gyfrifol am y mecanwaith. Yn gyntaf, roedd cynhyrchu uwchocsid allgellog gyda santhin ynghyd ag ocsidas santhin yn ail-greu'r un patrwm: ataliwyd CYSNO a nitroprwsid, ond ni effeithiwyd ar MPANO. Yn ail, achosodd glas methylen gynhyrchu uwchocsid gan y celloedd cyhyr llyfn mewn ffordd a oedd yn dibynnu ar ddos ac amser, a fesurwyd drwy rydwythiad cytocrom c. Yn drydydd, ataliodd dismwtas uwchocsid yr effaith ataliol yn llwyr, ond ni wnaeth catalas hynny, sy'n pwyntio at uwchocsid yn hytrach na hydrogen perocsid fel y rhywogaeth uniongyrchol gyfrifol yn y paratoad hwnnw.

Mae'n werth disgrifio fersiwn cyd-feithrin yr arbrawf oherwydd ei bod yn lleoli'r effaith yn ofodol. Cyd-feithrinwyd celloedd endothelaidd ar wydrau gorchudd am gyfnod byr â chelloedd cyhyr llyfn, fel bod ffactor endothelaidd a ryddhawyd ar y lefel waelodol yn codi GMP cylchol y cyhyr llyfn i dair i wyth gwaith y lefel wreiddiol. Roedd rhagdrin y naill adran neu'r llall â glas methylen yn lleihau'r signal hwnnw, ac roedd dismwtas uwchocsid yn adfer yn rhannol yr effaith a achoswyd gan ragdrin y celloedd endothelaidd. Mewn geiriau eraill, nid oes angen i las methylen weithredu y tu mewn i'r gell cyhyr llyfn sy'n synhwyro'r signal o gwbl. Gall leihau'r signal drwy dynnu'r negesydd wrth iddo deithio. Mae'r canllaw i ddarllen ymchwil ar las methylen yn trin hyn fel rheol gyffredinol: enwch yr adran lle digwyddodd yr ymyriad cyn enwi targed moleciwlaidd.

Byddai galw hyn yn atal NOS yn anghywir. Nid oedd angen cam synthas i'r rhoddwyr weithio, ac eto gostyngodd y signal.

Dolen 4: mae'r synhwyrydd ei hun yn ymateb yn llai

Mae effeithiau uniongyrchol ar cyclas guanylad hydawdd yn bodoli, ond mae'r crynodiadau'n bwysig. Yn y gymhariaeth o ensymau wedi'u puro a ddyfynnwyd uchod, roedd angen tua 60 micromolar o las methylen i atal hanner gweithgarwch y cyclas a ysgogwyd gan ocsid nitrig, o'i gymharu ag atal hanner gweithgarwch NOS yn agos at 5 i 9 micromolar, a hyd yn oed ar 1 millimolar dim ond ataliad rhannol a gafwyd ar y mwyaf. Mae hynny'n wahaniaeth o tua chwe gwaith i un ar ddeg gwaith. Felly ni ellir labelu arbrawf mewn celloedd ar grynodiad micromolar isel sy'n gostwng GMP cylchol fel atal cyclas yn ddetholus ar sail y gwerth GMP cylchol yn unig.

Ychwanegodd astudiaeth rhydocs ddiweddarach ail reswm dros fod yn ofalus: roedd glas methylen yn dadactifadu cyclas a actifwyd gan ocsid nitrig drwy fecanwaith gwahanol i ocsidiad syml haearn yr hem gan aer. Felly gall gweithrediad y synhwyrydd gael ei amharu, ond nid yw'r cemeg wedi'i setlo, ac mae'r bwlch rhwng y crynodiadau'n golygu y dylid diystyru effeithiau uwchocsid a NOS yn gyntaf ar amlygiadau micromolar isel. Dyma hefyd lle mae rheoli ffosffodiesterasau yn berthnasol. Oni bai bod dadelfennu wedi'i fesur neu ei atal, mae llai o GMP cylchol yn cronni yn gyson â llai o synthesis, dadelfennu cyflymach, neu'r ddau.

Pam na ellir crynhoi hyn yn un honiad am bwysedd gwaed

Sefydlwyd pob dolen mewn system wahanol. Nid yr un peth yw trawsgrifio mewn macroffagau a gweithgarwch ensymau yn yr hypothalamws. Nid yr un peth yw gweithgarwch hypothalamig ar ôl lipopolysacarid a thôn endothelaidd wrth orffwys. Nid yr un peth yw ffactor endothelaidd a ryddheir ar y lefel waelodol mewn cyd-feithriniad ac ymledu fasgwlaidd a ysgogir gan agonydd. Nid cylchrediad dynol yw celloedd rhydwelïau pwlmonaidd wedi'u meithrin ar 10 micromolar o las methylen. Mae eu cyfuno'n ddatganiad fel bod glas methylen yn codi pwysedd gwaed drwy atal ocsid nitrig yn taflu ymaith yr union wahaniaethau y cynlluniwyd y profion rheoli i'w cadw.

Mae tri gwiriad yn cadw'r esboniad yn onest. Yn gyntaf, enwch yr isoform: eNOS ar gyfer tôn fasgwlaidd wrth orffwys, iNOS ar gyfer llif llidiol a anwythir, nNOS ar gyfer cyd-destunau niwronaidd a rhai cyd-destunau ensymau wedi'u puro. Yn ail, enwch sut y darperir y signal ocsid nitrig: synthesis mewndarddol, rhyddhau endothelaidd gwaelodol, neu roddwr penodol fel CYSNO, nitroprwsid, neu MPANO, gan fod y rhoddwr sefydlog yn gwrthsefyll glas methylen ond nad oedd y rhai ansefydlog yn gwneud hynny. Yn drydydd, enwch y crynodiad a'r adferiad: mae adferiad gyda dismwtas uwchocsid yn awgrymu bod uwchocsid yn gyfrifol, mae methiant catalas yn dadlau yn erbyn hydrogen perocsid yn y paratoad hwnnw, mae efelychiad gan ocsidas santhin yn dangos bod y mecanwaith yn ddigonol, ac mae profion ensymau wedi'u puro yn gwahanu effeithiau uniongyrchol ar gatalysis oddi wrth golledion wrth deithio.

Dyma'r crynodeb cryno. Mae'n well trin glas methylen fel sylwedd sy'n amharu ar sawl safle yn y broses signalau o ocsid nitrig i GMP cylchol nag fel atalydd cyclas detholus. Yn dibynnu ar y paratoad a'r crynodiad, gall leihau rhwymiad ffactorau trawsgrifio iNOS, atal ensymau NOS yn uniongyrchol, lleihau argaeledd ocsid nitrig drwy gynhyrchu uwchocsid, ac amharu ar cyclas a actifwyd gan ocsid nitrig. Mae rôl signalau GMP cylchol mewn astudiaethau fasgwlaidd a'r gymhariaeth o roddwyr ocsid nitrig a ddefnyddir mewn profion celloedd ill dau yn ymdrin ag un o'r canghennau hynny'n fanylach, ac mae'r dulliau a ddefnyddir i wahanu effeithiau rhydocs oddi wrth effeithiau ar ensymau yn esbonio pam mae dismwtas uwchocsid ynghyd â chatalas a phrawf rheoli â rhoddwr sefydlog yn ymddangos mor aml yn y llenyddiaeth hon.

Mae gwerth GMP cylchol isel ar ôl glas methylen yn nodi cadwyn sydd wedi torri. Dim ond y profion rheoli sy'n dweud pa ddolen a dorrodd.