Esbonio glas methylen, Nrf2, a biogenesis mitocondriaidd

Mae un frawddeg yn ymddangos yn aml mewn ysgrifennu am las methylen: mae'n actifadu Nrf2 ac yn adeiladu mitocondria newydd. Mae'r frawddeg yn darllen fel un honiad, ond mae'n cynnwys dau gysyniad gwahanol, a astudiwyd mewn systemau gwahanol, gyda mathau gwahanol o dystiolaeth. Llwybr signalau yw'r cyntaf, synhwyrydd sy'n troi genynnau amddiffyn ymlaen. Rhaglen adeiladu yw'r ail, sef cell yn gwneud mwy o beirianwaith mitocondriaidd. Gall signal sbarduno adeiladu, ond nid yw dangos bod y signal wedi gweithredu yr un fath â dangos bod yr adeilad wedi codi, ac nid yw dangos mwy o ddeunydd adeiladu yr un fath â dangos cyflenwad pŵer gwell. Mae'r erthygl hon yn cadw'r tri pheth hynny ar wahân.

Cysyniad Nrf2: synhwyrydd, nid tarian

Mae Nrf2 (ffactor 2 sy'n gysylltiedig â ffactor niwclear erythroid 2) yn ffactor trawsgrifio, sef protein y mae ei waith yn cynnwys troi genynnau ymlaen. Dan amodau gorffwys, caiff ei ddal yn y cytoplasm gan brotein synhwyro o'r enw Keap1, sy'n ei drosglwyddo i beirianwaith gwaredu'r gell i'w ddinistrio'n barhaus. Pan fydd ocsidyddion neu electroffilau yn addasu cysteinau adweithiol ar Keap1, mae'r gwaredu'n dod i ben. Mae Nrf2 newydd ei wneud yn cronni, yn symud i mewn i'r cnewyllyn, yn paru â phroteinau Maf bach, ac yn rhwymo wrth ddilyniannau DNA o'r enw elfennau ymateb gwrthocsidiol. Mae'r rhwymo hwnnw'n troi cyfres o enynnau amddiffyn ymlaen.

Mae dangosyddion canonaidd y llwybr hwn yn benodol. Mae NQO1 (dehydrogenas cwinon NAD(P)H 1) a TrxR1 (rhwydenas thioredocsin 1) ymhlith genynnau targed mwyaf dibynadwy Nrf2. Mae HO-1 (ocsigenas hem-1) yn hawdd iawn i'w anwytho ond mae hefyd yn ymateb i reoleiddwyr eraill. Mae ensymau fel SOD a chatalas yn beirianwaith gwrthocsidiol, ond rheolir eu lefelau gan lawer o ffactorau trawsgrifio, felly nid yw cynnydd mewn SOD ar ei ben ei hun yn profi mai Nrf2 oedd yr achos. Y dystiolaeth agosaf at y digwyddiad signalau yw cronni Nrf2 yn y cnewyllyn, actifadu adroddydd ARE, neu anwytho targedau canonaidd sy'n diflannu pan dynnir Nrf2. Mae popeth arall, lefelau ocsidyddion is, gwell goroesi dan straen, mwy o glwtathion, yn effaith i lawr y llwybr y gall llawer o lwybrau ei chynhyrchu.

Mae'r canlyniad cynharaf ynghylch glas methylen yn y stori hon yn perthyn i ben agos y raddfa honno. Dangosodd ffibroblastau a amlygwyd i las methylen mewn crynodiadau nanomolar heneiddiad cellog gohiriedig ochr yn ochr â chynnwys uwch o gymhlyg IV, defnydd uwch o ocsigen, ac anwytho'r ensymau cam-2 TrxR1 a NQO1, fel yr adroddwyd yn yr astudiaeth a gysylltodd glas methylen gyntaf â gwella mitocondria ac oedi heneiddiad cellog. TrxR1 a NQO1 yw'r union dargedau Nrf2 canonaidd y mae darllenydd gofalus am eu gweld. Yr hyn na ddangosodd yr astudiaeth oedd y digwyddiad signalau ei hun: dim mesuriad o Nrf2 yn y cnewyllyn, dim adroddydd ARE, dim rheolydd â Nrf2 wedi'i ddileu. Felly'r dehongliad gonest yw bod glas methylen yn anwytho genynnau targed hysbys Nrf2 yn y system hon, sy'n gyson ag actifadu Nrf2 ond nad yw'n ynysu Nrf2 fel yr achos. Mae anwytho genyn targed un cam i lawr y llwybr o'r switsh.

Cysyniad biogenesis: rhaglen â thri phwynt gwirio

Biogenesis mitocondriaidd yw'r rhaglen y mae cell yn ei defnyddio i greu mwy o gapasiti mitocondriaidd. Mae ei hierarchaeth, fel y'i disgrifir mewn gwerslyfrau, yn mynd drwy dri phwynt gwirio. Yn gyntaf, mae'r cyd-actifadydd PGC-1alpha yn troi'r rhaglen ymlaen. Yn ail, mae ffactorau trawsgrifio niwclear (yn ddryslyd, enw un yw NRF1, ffactor anadlu niwclear 1, protein gwahanol i Nrf2) yn sbarduno mynegiant genynnau mitocondriaidd, gan gynnwys TFAM, sy'n cynnal ac yn atgynhyrchu DNA mitocondriaidd. Yn drydydd, mae gan y gell fwy o genomau mitocondriaidd a mwy o beirianwaith anadlu yn y pen draw, y gellir eu mesur fel nifer y copïau mtDNA, gweithgarwch synthas sitrad, neu helaethrwydd a gweithgarwch cymhlygion anadlu.

Mae pob pwynt gwirio yn cynrychioli honiad gwannach neu gryfach na'r un blaenorol. Mae mwy o RNA negesydd PGC-1alpha neu TFAM yn dangos bod cais wedi'i wneud am y rhaglen, nid ei bod wedi'i chwblhau. Mae mwy o mtDNA neu fwy o brotein cymhlyg IV yn dangos mwy o ddeunydd, ond gall mitocondria sydd wedi'u hailfodelu edrych yr un fath. Mae gwell anadlu, mwy o ddefnydd o ocsigen neu fwy o weithgarwch cymhlygion, yn dangos bod gweithrediad wedi newid, ond gall gweithrediad wella heb unrhyw fitocondria newydd o gwbl. Mae honiad cryf o fiogenesis yn cyfuno'r tri: rheoleiddiwr, cynnwys, a gweithrediad.

Aeth yr astudiaeth ddilynol ar ffibroblastau drwy'r rhan fwyaf o'r gadwyn honno. Mewn celloedd IMR90 dynol a driniwyd â 100 nanomolar o las methylen, cododd y gymhareb NAD i NADH dros dro o fewn 15 munud a dychwelodd i'r llinell sylfaen o fewn diwrnod. Dilynwyd y signal egni dros dro hwnnw gan ffosfforyleiddiad dros dro o'r synhwyrydd egni AMPK, ac yna gan anwytho PGC-1alpha a SURF1, protein sydd ei angen i gydosod cymhlyg IV gweithredol. Dyblodd gweithgarwch cymhlyg IV fwy neu lai, gostyngodd ocsidyddion cellog tua 28 y cant, ac erydodd telomerau yn arafach. Nodir y dilyniant llawn yn y papur sy'n cysylltu gweithgarwch rhydocs glas methylen ag AMPK a biogenesis mitocondriaidd.

Mae dau fanylyn yn y papur hwnnw'n haeddu sylw oherwydd eu bod y math o fanylion a hepgorir fel arfer. Yn gyntaf, roedd y patrwm yn bwysicach na'r presenoldeb: trodd glas methylen AMPK ymlaen dros dro, tra trodd y cyffur cyfeirio AICAR ef ymlaen yn gronig, ac roedd yr actifadydd dros dro tua wyth gwaith yn fwy effeithiol wrth oedi heneiddiad cellog. Felly mae honiad ar ffurf "mae glas methylen yn actifadu AMPK" yn anghyflawn; yr honiad perthnasol yw ei fod yn actifadu AMPK dros dro, ac mae'r gymhariaeth yn awgrymu nad yw actifadu cronig yn gwneud yr un gwaith. Yn ail, ni newidiodd glas methylen y cylch celloedd, sy'n diystyru'r esboniad amgen mwyaf di-nod, sef bod y celloedd yn syml yn rhannu'n arafach ac yn edrych yn iau o ganlyniad.

Y gangen llygod: ymddygiad, genomau, a sbardun sy'n baradocsaidd yn fwriadol

Estynnwyd y gwaith ar feithriniadau celloedd i anifeiliaid gan grŵp a oedd yn astudio llygod canol oed. Ar ôl 60 diwrnod o las methylen drwy'r geg, cadwodd y llygod a driniwyd fwy o'u dygnwch corfforol a'u hymddygiad archwiliadol a dangoswyd llai o ymddygiad tebyg i orbryder nag mewn llygod hŷn heb eu trin. Ym meinwe'r ymennydd, adferwyd genynnau yr oedd heneiddio wedi'u hatal, NRF1, TFAM, SOD2, ac is-uned cymhlyg IV COX1, tuag at lefelau oedolion, a chododd nifer y copïau mtDNA. Adroddir y canlyniadau hynny, ymddygiad ynghyd â rheoleiddiwr a helaethrwydd genomau, yn yr astudiaeth ar lygod canol oed ynghylch glas methylen a biogenesis mitocondriaidd yr ymennydd.

Y sbardun arfaethedig yw'r rhan ddiddorol, oherwydd ei fod yn mynd yn groes i'r stori syml bod glas methylen yn wrthocsidydd. Dangosodd y llygod a driniwyd fwy o gynhyrchu rhywogaethau ocsigen adweithiol ym mitocondria'r ymennydd, yn benodol hydrogen perocsid. Cynnig yr awduron: signal perocsid ysgafn sy'n actifadu llwybr Nrf2, sydd wedyn yn sbarduno'r rhaglen biogenesis. Yn y model hwn, mae glas methylen yn bro-ocsidydd yn y cam sbarduno ac yn wrthocsidydd yn y cam canlyniad, patrwm y mae ffarmacolegwyr yn ei alw'n hormesis, lle mae straen bach yn ysgogi amddiffyniad sy'n fwy na'r straen ei hun. Ni phrofwyd yn uniongyrchol a yw'r cynnydd hwnnw mewn perocsid yn achosi actifadu Nrf2 mewn gwirionedd; dyma'r bont arfaethedig, nid cysylltiad mesuredig.

Profodd astudiaeth ategol gan yr un grŵp ochr diogelwch y cynnig hwnnw dan straen. Mewn mitocondria ymennydd wedi'u hynysu, cododd glas methylen gynhyrchiant hydrogen perocsid ar grynodiadau mor isel â 50 nanomolar, ond ni achosodd crynodiadau therapiwtig unrhyw niwed canfyddadwy i DNA mitocondriaidd. Dim ond ar 100 micromolar, ymhell uwchlaw lefelau therapiwtig, y dangosodd darnau dethol o mtDNA niwed, a chynhyrchodd y cyfuniad o 20 micromolar o'r llifyn â golau coch ocsigen sengled a niweidiodd mtDNA yn eang, sef ymddygiad hysbys y llifyn fel ffotosensiteiddiwr yn hytrach na'i ffarmacoleg yn y tywyllwch. Roedd rhagdriniaeth hyd yn oed yn amddiffyn mitocondria rhan fentrol y canolymennydd rhag briwiau mtDNA a achoswyd gan rotenon. Manylir ar yr ymateb i ddos a'r rheolaethau genowenwyndra yn yr astudiaeth ar gynhyrchiant perocsid nad yw'n enowenwynig gan las methylen.

Yr hyn a fesurwyd a'r hyn a gynigiwyd: darllen y diagram

Lluniwyd y diagram llwybr isod ar gyfer yr erthygl hon i sicrhau'r gwahaniaeth y mae'r testun wedi bod yn ei wneud. Mae blychau â ffiniau solet yn gamau â chefnogaeth arbrofol uniongyrchol yn y llenyddiaeth ar las methylen: cylchu rhydocs sy'n newid NAD/NADH, ffosfforyleiddiad AMPK dros dro, anwytho PGC-1alpha a SURF1, gweithgarwch uwch cymhlyg IV, anwytho NQO1 a TrxR1, adfer mynegiant genynnau biogenesis a nifer y copïau mtDNA yn ymennydd llygod, a chynnydd mewn perocsid heb niwed i mtDNA ar ddosau therapiwtig. Mae blychau â ffiniau toredig yn gysylltiadau arfaethedig: Keap1 yn synhwyro'r signal perocsid, cronni Nrf2 yn y cnewyllyn yn sbarduno'r genynnau amddiffyn, a'r saeth achosol o actifadu Nrf2 i'r rhaglen biogenesis. Mae'r camau toredig hynny'n gredadwy, yn gyson â'r data, ac yn fioleg safonol gwerslyfrau, ond yn y papurau hyn ni chawsant eu mesur â'r rheolaethau (Nrf2 yn y cnewyllyn, adroddyddion ARE, dileu Nrf2) a fyddai'n eu dyrchafu i flychau solet.

Daw tri chamddealltwriaeth i'r amlwg unwaith y mae'r diagram o'ch blaen. Yn gyntaf, mae NRF1 a Nrf2 yn broteinau gwahanol ag enwau sydd bron yn union yr un fath; mesurodd yr astudiaeth ar lygod ffactor anadlu niwclear 1, rheoleiddiwr biogenesis, nid y ffactor trawsgrifio gwrthocsidiol, ac mae eu cymysgu yn cywasgu'r diagram cyfan i un nod. Yn ail, dechrau'r stori yw mynegiant genynnau, nid ei diwedd; mae adfer negeseuon TFAM neu COX1 yn cefnogi cais am fiogenesis, tra mai nifer y copïau mtDNA a gweithgarwch cymhlyg IV yw'r dystiolaeth bod y cais wedi'i gyflawni. Yn drydydd, nid yw'r canlyniad gwrthocsidiol yn profi llwybr Nrf2; mae'r gostyngiad o 28 y cant mewn ocsidyddion mewn ffibroblastau a'r amddiffyniad rhag rotenon mewn llygod yn effeithiau gwirioneddol i lawr y llwybr, ond mae sawl llwybr yn cydgyfeirio arnynt.

Beth fyddai'n dyrchafu blwch toredig i un solet

Mae'r arbrofion sydd ar goll yn rhai safonol. Byddai mesur protein Nrf2 yn y cnewyllyn ar ôl amlygiad i las methylen, gyda dilyniant amser wedi'i gysoni â'r signal AMPK dros dro, yn profi a yw'r ddwy gangen yn gweithredu gyda'i gilydd mewn gwirionedd, fel y mae'r ddamcaniaeth actifadu cydamserol yn honni. Byddai adroddydd a yrrir gan ARE yn cadarnhau gweithgarwch trawsgrifio yn hytrach na'i gasglu o enynnau targed. Byddai ailadrodd y mesuriadau biogenesis gyda mynegiant Nrf2 wedi'i leihau neu â Nrf2 wedi'i ddileu yn profi'r saeth achosol yn uniongyrchol: os yw anwytho cymhlyg IV a chynnydd mewn mtDNA yn parhau heb Nrf2, mae'r bont yn anghywir a changen AMPK sy'n gyfrifol am yr effaith ar ei phen ei hun. Ar ochr yr anifeiliaid, byddai astudiaeth dosio cronig gyda'r un tri phwynt gwirio, rheoleiddiwr, cynnwys, gweithrediad, yn profi a yw'r rhaglen yn aros ymlaen neu'n addasu. Tan hynny, mae actifadu cydamserol y llwybrau egni ac amddiffyn yn parhau i fod yr hyn y galwodd ei awduron ef: ffactor allweddol posibl, nid mecanwaith sefydledig.

Efallai y bydd darllenwyr sy'n dod o'r ffarmacoleg ehangach am weld y cyd-destun o'i amgylch: sut mae glas methylen yn cludo electronau ar y lefel fitocondriaidd, beth arall y mae'n ei wneud i fitocondria ac egni cellog, lle mae'r canfyddiadau ar heneiddiad cellog yn perthyn mewn ymchwil heneiddio, sut mae honiadau biogenesis yn ymwneud â pherfformiad gwybyddol, a'r cofnod diogelwch sy'n gosod terfynau ar bob trafodaeth am ddosio. Mae pob un o'r rhain yn gysyniad ar wahân â'i dystiolaeth ei hun, ac mae pob un yn haeddu'r un ymdriniaeth sy'n gwahaniaethu rhwng yr hyn a fesurwyd a'r hyn a gynigiwyd ag a roddodd yr erthygl hon i Nrf2.