Glas methylen newydd a staenio reticwlocytau: lliw ar wahân a dull celloedd byw

Mae myfyriwr yn paratoi i gyfrif reticwlocytau, yn archebu glas methylen, yn ei gymysgu â gwaed, ac yn gweld bron dim. Mae cyd-fyfyriwr yn defnyddio potel wedi'i labelu glas methylen newydd ac yn cael ffilamentau glas clir mewn cyfran o'r celloedd coch. Mae'r myfyriwr cyntaf yn tybio bod yr ail botel yn fwy ffres neu'n fwy crynodedig. Nid yw'r naill na'r llall. Mae'n cynnwys moleciwl gwahanol.

Dyma'r camgymeriad cysyniadol sydd wrth wraidd y rhan fwyaf o'r dryswch yn y maes hwn. Mae'r enw'n awgrymu bod glas methylen newydd yn swp gwell o las methylen. Mae'r cemeg yn dweud fel arall. Mae glas methylen newydd N yn lliw ffenothiasin ar wahân, gyda'i rif Colour Index ei hun, ei batrwm amnewid ei hun, a'i rôl safonedig ei hun mewn hematoleg. Unwaith y bydd y gwahaniaeth hwnnw'n glir, mae gweddill y dull (pam mae'n rhaid i'r celloedd fod yn fyw wrth eu staenio, beth sy'n cyfrif fel reticwlocyt, sut mae cyrff Heinz yn berthnasol, a phryd mae glas cresyl disglair yn dod i'r darlun) yn dod yn syml.

Yr ateb byr

Yn gyffredinol, nodir glas methylen newydd N, yr adweithydd hematoleg, fel Basic Blue 24 yng nghofnod PubChem ar gyfer glas methylen newydd, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, fformiwla C18H22ClN3S. Glas methylen cyffredin yw methylthioninium clorid, Basic Blue 9, yn ei gofnod PubChem, C.I. 52015, CAS 61-73-4, fformiwla C16H18ClN3S. Yn strwythurol, mae glas methylen newydd yn cynnwys dau grŵp methyl ar y cylch a chadwyni ochr ethylamino lle mae gan las methylen grwpiau dimethylamino. Mae'r gwahaniaeth hwnnw'n newid ei ymddygiad staenio. Mae testunau hematoleg yn disgrifio glas methylen cyffredin fel staen cymharol wael ar gyfer reticwlocytau a glas methylen newydd fel un dyfnach a mwy unffurf, cymhariaeth a grynhoir yn nhudalen bwnc ScienceDirect ar las methylen newydd.

Ydy, mae glas methylen newydd yn staen uwchfywiol. Mae staenio uwchfywiol yn golygu staenio celloedd byw ar ôl eu tynnu o'r corff a chyn eu sefydlogi, fel y'i diffinnir yn adolygiad NCBI o egwyddorion staenio uwchfywiol. Mae glas methylen newydd a glas cresyl disglair ill dau yn perthyn i'r categori hwn, ac mae safon reticwlocytau CLSI yn ymdrin yn benodol â glas methylen newydd fel lliw uwchfywiol. Weithiau mae myfyrwyr yn ei roi yn yr un categori â staenio Romanowsky ar daeniadau wedi'u sefydlogi. Nid yw'r model meddwl hwnnw'n gweithio yma. Sefydlogwch yn gyntaf ac mae'r dull yn peidio â gweithio.

I ddarllenwyr sy'n olrhain enwau lliwiau tebyg, mae glas methyl o'i gymharu â glas methylen yn ymdrin â dryswch gwahanol a mwy rhwng lliw triarylmethan anionig a'r teulu ffenothiasin cationig. Mae'r trosolwg o staenio mewn labordy yn gosod gwaith uwchfywiol ochr yn ochr â dulliau taeniadau sefydlog, ac mae'r canllaw morffoleg celloedd gwaed yn dangos sut mae asesu reticwlocytau yn ffitio i'r cyfrif gwahaniaethol ehangach.

Un rhybudd ynghylch catalogau: mae ffurf halen dwbl sinc clorid ar wahân o las methylen newydd yn bodoli o dan CAS 6586-05-6. Dylai adran dulliau felly enwi ffurf yr halen a'r cyflenwr, nid yr enw cyffredin yn unig.

Beth mae staenio uwchfywiol yn ei wneud mewn gwirionedd

Cell goch ifanc yw reticwlocyt sydd wedi colli ei chnewyllyn ond sy'n cadw RNA ribosomaidd gweddilliol. Mewn paratoad gwlyb heb ei staenio, mae'r RNA hwnnw'n anweledig. Mae lliw uwchfywiol yn mynd i mewn i'r gell fyw ac yn gwaddodi neu'n agregu'r RNA hwnnw'n ronynnau a ffilamentau glas, sef y deunydd rhwydwaith ffilamentaidd a welir o dan drochiad olew. Felly, cynnyrch y staenio yw'r rhwydwaith, nid sgerbwd a ffurfiwyd ymlaen llaw sy'n aros am liw. Dyma pam mae newidynnau'r protocol (crynodiad y lliw, y byffer, y gymhareb gwaed i liw, tymheredd, amser) yr un mor bwysig ag enw'r lliw.

Y canlyniad ymarferol yw trefn weithredu lem: cymysgu gwaed sydd wedi'i drin â gwrthgeulydd â'r lliw yn gyntaf, deori, yna gwneud taeniadau a'u harchwilio heb eu sefydlogi a heb wrthstaen. Mae sefydlogi cyn staenio, neu wrthstaen sy'n cuddio ffilamentau gwan, yn dinistrio'r wybodaeth y mae'r cyfrif yn dibynnu arni.

Protocol ymarferol ar gyfer reticwlocytau â glas methylen newydd

Nid oes un fformiwleiddiad cyffredinol, felly cofnodwch yr un a ddefnyddiwyd. Mae tri amrywiad wedi'u dogfennu yn dangos yr ystod.

Mae'r weithdrefn glasurol o fath Brecher yn defnyddio tua 0.5 y cant o las methylen newydd gydag ocsalad potasiwm, wedi'i gymysgu mewn cyfeintiau cyfartal â gwaed EDTA wedi'i gymysgu'n dda, a'i ddeori am tua 10 i 15 munud ar dymheredd ystafell. Ar ôl ailgymysgu'n ysgafn, paratoir taeniadau lletem tenau, cânt eu sychu yn yr aer, a'u harchwilio heb eu sefydlogi o dan yr amcanlens olew 100x. Mae gweithdrefn NCBI ar gyfer cyfrif reticwlocytau yn disgrifio'r llif gwaith hwn a'r ffrâm gyfrif a ddefnyddir gydag ef.

Mae amrywiad Dacie a Lewis yn defnyddio 1.0 y cant o las methylen newydd mewn hydoddiant halwynog sitrad, wedi'i gymysgu â 2 i 4 cyfaint o waed a'i gadw ar 37 C am 15 i 20 munud cyn gwneud taeniadau. Defnyddiodd gweithrediad cysoni diweddar ar gyfer gweithdrefn CLSI H44 hydoddiant mwy gwan o 0.1 y cant mewn hydoddiant halwynog wedi'i fyffro â ffosffad ar pH 7.4, gyda deori ar 20 C am 10 munud a dim sefydlogi, fel yr adroddwyd yn astudiaeth cysoni NMB 2026.

Mae'r rheolau cyfrif yn gyffredin i'r amrywiadau. Cofnodwch gell fel reticwlocyt pan fydd yn cynnwys o leiaf ddau ronyn glas ar wahân sydd wedi'u staenio neu ddwy ran o ffilament, sy'n eithrio dyddodiad staen ynysig. Cyfrifwch o leiaf 1,000 o gelloedd coch mewn gwaith arferol a chofnodwch reticwlocytau fel canran. Ar ganrannau isel, mae'r ystadegau'n mynnu mwy o gelloedd. Mae adolygiad o fethodoleg CLSI H44 yn nodi, ger 1 y cant o reticwlocytau, fod angen tua 4,400 o gelloedd i ostwng yr amrywiad cyfrif i 5 y cant, yn adolygiad CLSI H44 yn De Gruyter. Mae disg sylladur Miller yn gwneud cyfrifon mawr yn ymarferol. Hidlwch y lliw neu ei baratoi'n ffres, oherwydd bod gwaddod yn dynwared cynhwysion gronynnog.

Cyrff Heinz yn yr un paratoad

Gall yr un taeniad uwchfywiol hefyd ddangos cyrff Heinz, sef agregau o haemoglobin wedi'i ocsidio a'i ddadnatureiddio yn hytrach nag RNA gweddilliol. Mewn paratoadau glas methylen newydd, maent yn ymddangos fel cyrff crwn, yn aml yn unigol ac yn agos at y bilen, wedi'u staenio'n las ysgafnach na'r deunydd rhwydwaith ffilamentaidd. Nid ydynt yn goroesi sefydlogi a gwrthstaenio'n dda, felly archwiliwch y taeniad heb ei sefydlogi. Fe wnaeth protocol diweddar a ddefnyddiodd 20 microlitr o waed EDTA gyda 20 microlitr o las methylen newydd 1 y cant a deori am 15 munud feintioli celloedd positif am gyrff Heinz ymhlith 250 o erythrocytau, yn astudiaeth PMC sy'n adrodd y weithdrefn honno.

Mae dau wahaniaeth yn atal camddehongli. Yn gyntaf, mae fioled methyl a fioled grisial yn staenio cyrff Heinz yn fwy dwys na glas methylen newydd, fel y nodir yn nhudalen bwnc ScienceDirect ar gyrff Heinz. Glas methylen newydd yw'r dewis cyfleus pan asesir reticwlocytau a chyrff Heinz gyda'i gilydd, nid y lliw pwrpasol cryfaf ar gyfer cyrff Heinz. Yn ail, mae cynhwysion HbH yn nodwedd thalasaemia alffa yn cynhyrchu llawer o ddotiau mân ar draws y gell ar ôl staenio uwchfywiol, tra bo cyrff Heinz clasurol yn llai niferus, yn fwy, ac yn aml yn gysylltiedig â'r bilen. Dyddodiad staen yw'r trydydd dynwarediad: mae'n gorwedd y tu allan i blân ffocal y celloedd ac yn amrywio rhwng meysydd.

Glas cresyl disglair o'i gymharu â glas methylen newydd

Mae'r ddau liw yn staeniau uwchfywiol ar gyfer reticwlocytau, ond mae safoni'n ffafrio un ohonynt. Mae dull reticwlocytau CLSI H44-A2, a ddatblygwyd ar y cyd â'r Cyngor Rhyngwladol ar gyfer Safoni mewn Hematoleg ac a restrir ar dudalen safon CLSI H44, yn dynodi staenio gwaed EDTA â glas methylen newydd fel y dull cymharol â llaw. Mae addysgu hematoleg clasurol yn cytuno ar yr ymddangosiad: mae glas methylen newydd yn rhoi staenio dyfnach a mwy unffurf ar ffilamentau, tra bo glas cresyl disglair yn amrywio mwy rhwng sypiau a samplau.

Mae angen amod ar y statws hwnnw. Mae canllaw gwerthuso dadansoddwyr ICSH yn derbyn microsgopeg â llaw gyda glas methylen newydd fel dull cymharu cyfeirio, ond yn ei ddisgrifio fel un goddrychol a chymharol anghywir, gan ffafrio gweithdrefnau cyfeirio cytometreg llif lle maent ar gael. Canfu cymhariaeth yn 2022 o 100 o sbesimenau lai o duedd o'i gymharu â'i dadansoddwr gyda glas cresyl disglair na gyda glas methylen newydd, fel yr adroddwyd yn nghymhariaeth PMC o ddulliau staenio. Y crynodeb y gellir ei gyfiawnhau i fyfyrwyr: defnyddiwch las methylen newydd fel y cymharydd safonedig â llaw, gwiriwch unrhyw ddull lleol â glas cresyl disglair yn ei erbyn neu yn erbyn dull awtomataidd, a disgwyliwch fwy o wasgariad gyda microsgopeg â llaw yn y naill achos a'r llall. Roedd llenyddiaeth safoni hŷn hefyd yn argymell Azure B wedi'i buro fel dewis amgen glanach yn gemegol oherwydd bod sypiau lliw masnachol yn amrywio, yn astudiaeth Marshall ar Azure B, sy'n esbonio pam mae gradd yr adweithydd yn dal i ymddangos mewn trafodaethau am ddulliau.

Osgoi'r camgymeriadau arferol

Mae pedwar camgymeriad yn gyfrifol am y rhan fwyaf o baratoadau sy'n methu. Mae archebu glas methylen cyffredin yn lle glas methylen newydd N yn cynhyrchu staenio gwan oherwydd y cemeg, nid y dechneg. Mae sefydlogi neu wrthstaenio cyn darllen yn dileu'r signal uwchfywiol. Mae cyfrif gwaddod staen fel gronynnau yn chwyddo'r canlyniad, a chaiff hyn ei atal gan y rheol dau ronyn a lliw wedi'i hidlo. Mae cyfrif rhy ychydig o gelloedd pan fo canran y reticwlocytau'n isel yn cynhyrchu rhif sy'n edrych yn fanwl gywir ond sydd â therfynau hyder eang. Mae gan bob camgymeriad yr un nodwedd: mae'r microsgopydd yn beio'r microsgop am rywbeth a benderfynwyd ar gam yr adweithydd.