Pam y defnyddir glas methylen fel gwrthstaen mewn staenio asid-wrthol

Mae technegydd yn archwilio cegiad crachboer ar ôl y dilyniant staenio llawn. Mae ffyn coch yn sefyll allan yn erbyn maes glas, ac anfonir yr adroddiad yn nodi bod basilau asid-wrthol wedi'u gweld. Y diwrnod wedyn, mae sleid wahanol yn dangos maes glas unffurf heb unrhyw ffyn coch, ac fe'i hadroddir yn negyddol am dwbercwlosis. Mae un o'r adroddiadau hyn yn honni mwy nag y mae'r sleid yn ei gefnogi, ac nid yr un cyntaf ydyw.

Mae'r dryswch yn gysyniadol. Roedd y technegydd yn trin y llifyn glas fel rhan o'r cemeg canfod, fel pe bai glas methylen yn helpu i ganfod y mycobacteria. Nid oedd. Erbyn i las methylen gyffwrdd â'r sleid, mae'r prawf eisoes wedi gorffen. Dim ond lliwio'r cefndir y mae'r llifyn, fel bod modd darllen y canlyniad. Mae'r erthygl hon yn esbonio pwrpas glas methylen mewn staenio asid-wrthol, pam mai glas ydyw yn hytrach nag unrhyw liw arall, a pha gasgliadau y gellir eu tynnu o goch yn erbyn glas.

Yr ateb byr

Mae staenio asid-wrthol yn brawf gwahaniaethol sy'n seiliedig ar dri syniad. Gorfodir ffwcsin carbol, y prif staen, i mewn i bob cell, gan gynnwys mycobacteria cwyraidd. Mae asid-alcohol, y dadliwiwr, yn tynnu'r llifyn coch o gelloedd cyffredin ond yn methu â'i dynnu o rai asid-wrthol. Yna mae glas methylen, y gwrthstaen, yn lliwio popeth y tynnodd y dadliwiwr y lliw ohono, fel bod celloedd nad ydynt yn asid-wrthol, celloedd y lletywr, a malurion yn ymddangos yn las tra bo basilau asid-wrthol yn aros yn goch. Mae'r gwrthstaen yn darparu cyferbyniad. Nid yw'n chwarae unrhyw ran yn y cemeg sy'n gwneud cell yn asid-wrthol.

Beth mae pob cam yn ei wneud

Mae'r diagram isod yn dangos sut y rhennir y gwaith. Darllenwch ef o'r chwith i'r dde fel gweithdrefn, a darllenwch y stribed gwaelod fel atgoffa bod pob teulu o ddulliau staenio yn gofyn cwestiwn gwahanol.

Treiddio sy'n dod gyntaf. Mae mycobacteria yn gwrthsefyll llifynnau dyfrllyd cyffredin oherwydd bod eu hamlen yn anarferol o hydroffobig, felly mae'r protocol yn gorfodi'r llifyn i mewn. Yn null Ziehl-Neelsen, mae gwresogi nes bod stêm yn codi yn gyrru ffwcsin carbol sy'n cynnwys ffenol drwy'r wal gwyr. Yn null oer Kinyoun, defnyddir fformiwleiddiad llawer cryfach o'r prif staen yn lle gwres, ac mae rhai fersiynau wedi'u haddasu nad ydynt yn defnyddio gwres yn ychwanegu syrffactyddion. Mae protocolau staenio asid-wrthol Cymdeithas Microbioleg America yn dogfennu'r ddau fformiwleiddiad ochr yn ochr, ac mae'r gwahaniaeth mewn crynodiad yn drawiadol: tua 0.3 g o ffwcsin basig fesul 100 mL ar gyfer y dull wedi'i wresogi, o'i gymharu â thua 4 g ar gyfer y dull oer.

Gwahaniaethu sy'n dod yn ail. Mae asid-alcohol, fel arfer 3 mL o asid hydroclorig crynodedig mewn 97 mL o ethanol 95 y cant, yn golchi'r llifyn coch o bob cell nad yw ei wal yn cynnig unrhyw wrthwynebiad arbennig. Mae celloedd ag amlen lipid fycobacteraidd gyflawn yn dal gafael ar y llifyn. Dyma'r cam y mae'r dull cyfan yn dibynnu arno, a'r cam sydd fwyaf sensitif i dechneg, fel y trafodir isod.

Cyferbyniad sy'n dod olaf. Bellach mae'r sleid yn cynnwys celloedd asid-wrthol coch ar gefndir bron yn ddi-liw o gelloedd y tynnwyd y lliw ohonynt. Mae glas methylen ar 0.3 y cant w/v yn gwneud y cefndir hwnnw'n weladwy eto mewn lliw sydd mor wahanol â phosibl i goch. Mae gwrthstaenio'n fyr, fel arfer 20 i 30 eiliad yn y dull wedi'i wresogi a hyd at ychydig funudau mewn rhai amrywiadau ar y dull oer, ac mae'r amseru'n dibynnu ar y protocol yn hytrach na bod yn briodwedd i'r llifyn ei hun.

Pam y llifyn hwn, a pham glas

Llifyn basig cationig yw glas methylen, sy'n golygu bod ei ïon lliw yn cario gwefr bositif ac yn rhwymo i arwynebau gwefr negatif bacteria wedi'u dadliwio, celloedd y lletywr, a malurion. Mae Microbioleg OpenStax yn disgrifio'r rhesymeg wefr hon fel yr egwyddor gyffredinol y tu ôl i staeniau basig. Ond nid yw glas methylen yn gemegol unigryw yma. Mae fioled grisial a saffranin yn llifynnau basig hefyd. Dewis optegol ydyw, nid un cemegol.

Mae angen cefndir o liw cyferbyniol ar ffyn coch, ac mae glas yn cyferbynnu â choch yn y ffordd fwyaf defnyddiol ar gyfer microsgopeg maes llachar. Byddai saffranin yn wrthstaen gwael oherwydd bod ei liw pinc-goch terfynol yn rhy agos at liw'r ffwcsin carbol a gedwir, gan ddileu'r union wahaniaeth a greodd y weithdrefn. Byddai fioled grisial yn rhoi cefndir fioled tywyll sy'n cystadlu â basilau coch tenau am sylw. Yr amnewid yw'r dystiolaeth gryfaf mai darparu cyferbyniad, yn hytrach na chyflawni rôl gemegol, yw'r dasg: defnyddir gwrthstaeniau gwyrdd fel gwyrdd malachit a gwyrdd disglair mewn rhai protocolau milfeddygol a phrotocolau wedi'u haddasu, ac mae'r prawf yn dal i weithio, oherwydd bod unrhyw liw amlwg wahanol yn cyflawni'r un dasg.

Mae dau oblygiad ymarferol yn dilyn. Yn gyntaf, nid yw'r rysáit safonol yn nodi unrhyw addasiad pH; peidiwch â chymysgu'r hydoddiant dyfrllyd syml hwn o 0.3 y cant â fformiwleiddiadau alcalïaidd fel glas methylen Loeffler, sy'n perthyn i gysyniad staenio gwahanol. Yn ail, mae defnyddio gormod yn niweidiol. Mae llenyddiaeth histoleg yn rhybuddio'n benodol y gall cefndir glas rhy ddwys guddio basilau prin, felly nid oes dim i'w ennill o orchuddio'r sleid â staen am fwy o amser nag y mae'r protocol yn ei ganiatáu; dim ond ei gwneud yn anoddach i'w darllen.

Cemeg y wal sy'n gwneud y prawf yn bosibl

Amlen y mycobacteria yw'r rheswm pam mae asid-alcohol yn gwahaniaethu. Ei chraidd strwythurol yw'r cymhlyg mycolyl-arabinogalactan-peptidoglycan: peptidoglycan wedi'i gysylltu ag arabinogalactan y mae ei bennau allanol yn cario asidau mycolig â chadwyni hir iawn, gan ffurfio mycomembran allanol sy'n gyfoethog mewn lipidau ac sydd â threiddedd anarferol o isel. Mae'r adolygiad o bilen allanol mycobacteria yn manylu ar y bensaernïaeth hon. Mae'r rhwystr yn gweithio i'r ddau gyfeiriad. Mae'n gwrthsefyll mynediad y llifyn, a dyna pam mae angen gwres neu brif staen cryfach er mwyn treiddio, ac mae'n gwrthsefyll tynnu'r llifyn allan, a dyna pam mae asid-alcohol yn methu â thynnu ffwcsin carbol ar ôl iddo fynd i mewn. Nid oes gan facteria cyffredin yr amlen hon ac maent yn colli'r llifyn. Felly, y ffordd orau o ddeall gwrthiant i asid mewn staenio yw fel ffenomen rhwystr lipid, nid fel ffwcsin yn rhwymo'n gemegol i asid mycolig.

Mae'r cemeg hon hefyd yn esbonio pos cyffredin: mae mycobacteria yn staenio'n wael ac yn anrhagweladwy drwy ddull Gram, gan ymddangos weithiau fel ffurfiau gleiniog gwan neu gysgodion heb eu staenio. Mae eu wal hydroffobig yn cyfyngu ar dreiddiad fioled grisial. Nid yw staenio asid-wrthol yn staen Gram wedi'i addasu. Mae'n egwyddor wahaniaethol wahanol sy'n seiliedig ar briodwedd wahanol i'r wal, fel y mae y gymhariaeth rhwng staen syml a staen Gram yn dangos ar gyfer y ddau ddull arall.

Tri dull, tri chwestiwn

Am y teulu ehangach o ddulliau bacteriol sy'n defnyddio un llifyn, gweler yr atlas staenio microsgopeg.

Beth na all coch yn erbyn glas ei brofi

Mae ffyn coch yn golygu bod yr organebau wedi cadw ffwcsin carbol drwy'r cam asid-alcohol. Mae'r canfyddiad hwnnw'n gyson â Mycobacterium tuberculosis, ond mae canllawiau diagnostig twbercwlosis y CDC yn nodi'n benodol bod mycobacteria eraill hefyd yn asid-wrthol, felly mae adnabod rhywogaeth yn gofyn am feithriniad a phrofion asid niwclëig, nid lliw.

Mae gwallau technegol yn clystyru o amgylch y ddau gam golchi. Mae dadliwio annigonol yn gadael deunydd cefndir yn goch ac yn annog darlleniadau positif ffug. Mae gorddadliwio yn tynnu prif staen nad yw wedi'i gadw'n gryf ac yn cyfrannu at ganlyniadau negatif ffug. Mae gwrthstaen a ddefnyddir yn rhy drwm yn claddu basilau prin mewn glas. Mae cegiadau trwchus, adweithyddion wedi'u gwaddodi, a dŵr rinsio halogedig yn ychwanegu eu harteffactau eu hunain.

Mae sensitifrwydd wedi'i gyfyngu gan nifer yr organebau, waeth pa mor dda yw'r dechneg. Mae angen tua 5,000 i 10,000 o fasilau fesul mililitr o grachboer ar ficrosgopeg cegiadau confensiynol, ac roedd adolygiadau tystiolaeth hŷn y CDC yn gosod sensitifrwydd cegiadau ar tua 45 i 80 y cant ymhlith achosion ysgyfeiniol a gadarnhawyd drwy feithriniad. Felly, nid yw cegiad negatif byth yn diystyru twbercwlosis. Mae canllawiau cyfredol y CDC yn cadw meithriniad ochr yn ochr â phob cegiad ac yn argymell profion mwyhau asid niwclëig ar o leiaf un sbesimen anadlol pan fo twbercwlosis ysgyfeiniol yn cael ei ystyried a byddai'r canlyniad yn newid sut y rheolir yr achos.

Mae gwaith ymarferol yn perthyn i brotocolau awdurdodedig

Nid yw disgrifiadau addysgol, gan gynnwys yr erthygl hon, yn awdurdodi gwaith clinigol. Ar gyfer gwaith wrth y fainc, dilynwch weithdrefn weithredu safonol ddilysedig y labordy sy'n cyd-fynd â dogfennau cyfredol y CDC, APHL, neu CLSI; mae cyfeirnod staenio asid-wrthol y CDC a gedwir yn ei archif Stacks yn dangos sut mae gweithdrefnau o'r fath yn pennu adweithyddion a darlleniadau. Mae angen cyfyngiant wrth weithio â sbesimenau twbercwlosis: paratoir cegiadau mewn cabinet diogelwch biolegol oherwydd bod y gwaith paratoi yn cynhyrchu aerosolau a sblashiadau, ac mae canllawiau diogelwch labordy y CDC yn nodi y gall hyd yn oed cegiadau sydd wedi'u sefydlogi â gwres gynnwys basilau twbercwlosis hyfyw a bod rhaid parhau i'w trin fel deunydd halogedig. Mae cofnod Llyfrgell Delweddau Iechyd Cyhoeddus y CDC am gegiad ffwcsin carbol a glas methylen a archwiliwyd am M. leprae yn atgoffa defnyddiol o gwmpas y dull y tu hwnt i dwbercwlosis: mae'r un cyferbyniad coch ar las yn ddefnyddiol lle bynnag y chwilir am organebau asid-wrthol, ac mae darlleniad negatif gofalus ynddo'i hun yn ganlyniad sy'n werth ei gofnodi.

Darllen y sleid orffenedig

Mae'r gwrthstaen yn profi ei werth wrth sgrinio. Mae microsgopydd sy'n sganio ar chwyddhad isel yn defnyddio'r cefndir glas yn gyntaf i farnu ansawdd y cegiad: dosbarthiad cyfartal o gelloedd, celloedd cyflawn y lletywr i ganolbwyntio arnynt, dim gwaddod trwm. Yna mae gwrthrychau coch posibl yn tynnu'r llygad yn union oherwydd nad oes dim arall ar y sleid yn goch. Gwneir y cadarnhau drwy drochi mewn olew, lle mae basilau gwirioneddol yn dangos y ffyn tenau disgwyliedig, sydd weithiau ychydig yn grwm neu'n gleiniog, yn hytrach na malurion llifyn unffurf.

Mae staenio'r cefndir hefyd yn pennu geirfa'r adroddiad. Adroddir sleid â basilau coch fel un lle gwelwyd basilau asid-wrthol, yn aml gyda gradd led-feintiol yn ôl graddfa'r labordy. Adroddir sleid heb organebau coch fel un lle na welwyd basilau asid-wrthol, byth fel un sy'n negyddol am dwbercwlosis. Mae'r gwahaniaeth yn bwysig oherwydd bod y maes glas yn profi bod y staen wedi gweithio, bod celloedd wedi cymryd y gwrthstaen a bod yr opteg yn ddigonol, ond nid yw'n dweud dim am organebau islaw'r terfyn canfod. Mae maes glas gwag yn ganlyniad dilys am y sleid, nid yn ddyfarniad am y claf.

Cofiwch sut y rhennir y gwaith a bydd yr adroddiadau'n ysgrifennu eu hunain. Mae ffwcsin carbol yn canfod ymgeiswyr. Mae asid-alcohol yn cyflawni'r prawf. Dim ond gwneud yr ateb yn ddarllenadwy y mae glas methylen: cadwodd coch y llifyn yn erbyn asid, collodd glas ef. Daw popeth arall, y rhywogaeth, nifer yr organebau, a'r ystyr clinigol, o waith y tu hwnt i'r sleid.