Glas methylen ac awtophagi: AMPK, mTOR, ac arbrofion niwronaidd

Dychmygwch eich bod yn cynnal arbrawf ar gelloedd, yn ychwanegu glas methylen, ac yn gweld band protein o'r enw LC3-II yn tywyllu ar eich blot. Mae'n demtasiwn cyhoeddi bod y cyfansoddyn yn "hybu awtophagi" a symud ymlaen. Mae'r dehongliad hwnnw'n gynamserol. Gall band LC3-II tywyllach olygu bod y gell yn adeiladu mwy o fesiglau glanhau, neu gall olygu bod y fesiglau'n cronni oherwydd bod y cam gwaredu wedi'i rwystro. Mae'r ddau ddehongliad yn pwyntio i gyfeiriadau gwrthgyferbyniol, ac mae'r llenyddiaeth ar las methylen mewn niwronau yn cynnwys enghreifftiau o'r ddau fath o dystiolaeth. Mae'r erthygl hon yn mynd drwy'r hyn a fesurwyd mewn gwirionedd, fesul prawf.

Macroawtophagi, y ffurf a astudir yma, yw proses ailgylchu swmp y gell. Mae sach bilen o'r enw ffagoffor yn tyfu o amgylch proteinau ac organynnau sydd wedi treulio, yn cau i ffurfio awtophagosom, yn ymdoddi â lysosom, ac mae ei chargo'n cael ei ddadelfennu a'i ryddhau i'w ailddefnyddio. Mae niwronau'n dibynnu ar y drefn hon oherwydd nad ydynt yn rhannu ac na allant wanhau'r crynodiad o rannau sydd wedi'u difrodi drwy ymrannu. Pan fydd ailgylchu'n arafu i stop, mae gwastraff yn cronni. Pan fydd yn gweithio, mae'r gell yn adennill blociau adeiladu dan straen.

Beth ddangosodd un arbrawf ar gelloedd hipocampws

Defnyddiodd yr astudiaeth anwytho ganolog gelloedd hipocampws llygoden HT22 dan straen oherwydd amddifadedd serwm am 24 awr, cyflwr sy'n tynnu ffactorau twf a signalau troffig ymaith ac yn sbarduno apoptosis ac awtophagi. Adroddodd yr ymchwilwyr fod glas methylen yn lleihau marwolaeth celloedd mewn modd a oedd yn dibynnu ar y dos, a bod arwyddion o facroawtophagi yn cyd-fynd â'r amddiffyniad hwn.

Roedd patrwm y marcwyr yn benodol. Ailddosbarthwyd staenio LC3B gwasgaredig yn ddotiau o amgylch y cnewyllyn, gan ddechrau tua 20 nM o las methylen, gyda'r ymateb LC3-I ac LC3-II cryfaf yn agos at 1 μM. Cynyddodd LC3B-I a LC3B-II ill dau mewn modd a oedd yn dibynnu ar y dos a'r amser. Yn hollbwysig, aeth y tîm gam ymhellach na blot LC3 statig. Ychwanegasant 10 μM o glorocwin, sy'n rhwystro clirio lysosomaidd, a chanfod LC3-II uwch ynghyd â p62 wedi'i sefydlogi mewn celloedd a gafodd eu trin â glas methylen. Mae'r patrwm hwnnw'n cefnogi trosiant sy'n dibynnu ar lysosomau yn hytrach na chronni yn unig. Dangosasant hefyd fod clorocwin yn gwrthdroi'r effaith gwrth-apoptotig yn rhannol, sy'n cysylltu'r amddiffyniad â'r llwybr awtophagi a lysosomau yn y model hwn.

Y canlyniad o ran signalau yw'r rhan a gamddyfynnir amlaf. Cynyddodd signalau AMPK, a fesurwyd fel AMPK wedi'i ffosfforyleiddio a'i darged i lawr y llwybr, ACC wedi'i ffosfforyleiddio, ar ôl 12 a 24 awr mewn modd a oedd yn dibynnu ar y dos. Fe wnaeth yr atalydd AMPK Compound C, a ddefnyddiwyd ar 20 μM yn ystod y 4 awr olaf, leihau ffosfforyleiddio ACC ac actifadu LC3. Mewn cyferbyniad, ni ddangosodd mTOR wedi'i ffosfforyleiddio unrhyw ataliad canfyddadwy. Felly, mewn celloedd hipocampws dan straen, y canfyddiad oedd anwythiad cysylltiedig ag AMPK drwy lwybr a oedd yn ymddangos yn annibynnol ar mTOR. Ymddangosodd yr un patrwm mewn llygod byw, lle anwythodd triniaeth â glas methylen farcwyr macroawtophagi yn y cortecs a'r hipocampws.

Nid yw anwythiad yn golygu fflwcs cyflawn

Yma y mae'r gwahaniaeth rhwng y cysyniadau bwysicaf. Mae anwythiad yn golygu bod y peirianwaith ar ddechrau'r llwybr yn gwneud mwy o awtophagosomau. Mae fflwcs yn golygu bod cargo'n teithio'r llwybr cyfan: ynysu, aeddfedu, ymdoddi â lysosomau, dadelfennu, ailgylchu. Mae pob cynnydd mewn LC3-II yn honiad am anwythiad nes bod prawf fflwcs yn cadarnhau gweddill y daith.

Mae'r prawf fflwcs safonol yn mesur LC3-II gyda rhwystr lysosomaidd byr, megis bafilomycin A1 neu glorocwin, a hebddo. Os yw'r driniaeth yn cyflymu cynhyrchu mewn gwirionedd, dylai rhwystro dinistrio wthio LC3-II yn uwch fyth. Mae adroddydd tandem mCherry-GFP-LC3 yn ychwanegu ail safbwynt: mae strwythurau'n disgleirio'n felyn cyn ymdoddi â lysosomau ac yn goch yn unig ar ôl i asid ddiffodd y signal GFP, felly mae mwy o ddotiau coch yn unig yn cefnogi cynnydd i awtolysosomau asidig. Gall gostyngiad mewn protein p62 ategu tystiolaeth o drosiant cargo, gyda'r cafeat bod trawsgrifio p62 ei hun yn ymateb i straen ac y dylid ei wirio ar lefel mRNA.

Mae'r rhestr wirio isod yn cysylltu pob prawf a ddefnyddir yn y llenyddiaeth hon â'r hyn y mae'n ei fesur a'r hyn na all ei brofi ar ei ben ei hun. Gall darllenwyr ei hailddefnyddio ar gyfer unrhyw honiad am facroawtophagi yn y dyfodol, gan gynnwys dadleuon am ymprydio a hirhoedledd sy'n benthyg y marcwyr hyn.

Sylwch ar un fagl geiriad y mae'r tabl yn gwarchod rhagddi. ACC wedi'i ffosfforyleiddio yw'r ffurf sydd wedi'i hatal yn ensymatig. Mae ei gynnydd yn dangos allbwn AMPK, nid actifadu ACC.

Mae'r ymadrodd "diddymodd atal macroawtophagi yr amddiffyniad niwronaidd" yn haeddu'r un manylder. Yn y model HT22 mae'n golygu bod ymyrryd â'r llwybr awtophagi a lysosomau wedi dileu mantais glas methylen o ran goroesi dan amddifadedd serwm. Mae'n cefnogi awtophagi fel proses angenrheidiol neu gyfrannol yn y ddysgl honno. Nid yw'n sefydlu mai awtophagi yw unig fecanwaith amddiffynnol y cyfansoddyn, nid yw'n profi bod clorocwin yn gweithredu drwy awtophagi yn unig, a byddai angen ymyrryd yn enetig ag ATG5, ATG7, neu ULK1 i gryfhau'r honiad achosol.

Dau lwybr i'r un peirianwaith

Mae map syml yn helpu. Mae straen egni yn cynyddu AMPK, mae AMPK yn actifadu'r cymhlygyn ULK1, ac mae awtophagi yn dechrau. Mae ffactorau twf a maetholion yn cynyddu mTORC1, mae mTORC1 yn atal ULK1, ac mae awtophagi yn aros yn anweithredol. I lawr y llwybr o ULK1, mae'r cymhlygyn Beclin-1 a VPS34 yn cychwyn ffurfio'r ffagoffor, mae LC3-I yn cael ei lipidoli i LC3-II, mae'r awtophagosom yn cau, yn ymdoddi â'r lysosom, ac mae cargo'n cael ei ddadelfennu wrth i p62 gael ei drosi.

Mae'r diagram yn gosod pob canfyddiad am las methylen ar y map hwn: canlyniad y celloedd hipocampws wrth ymyl cangen AMPK, a chanlyniad y celloedd rhagflaenol wrth ymyl cangen mTOR.

Mae'r fframwaith hwn yn datrys y tensiwn ymddangosiadol ag ail astudiaeth Xie. Mewn celloedd rhagflaenol niwral llygod mawr a oedd yn amlhau, canfu arbrawf ar wahân fod 5 μM o las methylen yn atal amlhau ac yn hyrwyddo cyflwr segur, gyda nifer y celloedd positif am Ki67 yn gostwng ar ddiwrnodau 1 a 3, tra bod gwahaniaethu niwronaidd ymrwymedig yn aros yn gyfan. Yno, roedd y mecanwaith yn gweithredu drwy atal signalau mTOR: gostyngiad yng nghyfanswm mTOR ac mTOR wedi'i ffosfforyleiddio ochr yn ochr â mynegiant is o p70S6K a 4EBP1, ynghyd ag is-reoleiddio cyclinau E1, B1, D1, a D2. Y ffenoteip amlycaf oedd cyflwr segur y celloedd rhagflaenol, a gysylltodd yr awduron â gohirio heneiddio celloedd, nid achub celloedd hipocampws dan straen.

Nid oes gwrthddywediad rhwng y ddau bapur. Integreiddwyr sy'n ymateb i'r cyd-destun yw AMPK ac mTOR, nid switshis sefydlog. Gall cell debyg i niwron dan straen ymgysylltu ag AMPK heb ataliad mesuradwy ar mTOR, tra gall cell ragflaenol a ysgogir gan fitogen ymateb i'r un cyfansoddyn drwy gyfyngu ar beirianwaith twf sy'n dibynnu ar mTOR. Math y gell, cyd-destun y straen, y crynodiad, a'r adeg fesur sy'n penderfynu pa gangen sy'n dominyddu. Dyna hefyd pam mae effeithiau glas methylen ar egni mitocondriaidd a rhydocs yn perthyn i'r un darlun: fel y mae adolygiad mecanistig o amddiffyniad niwronaidd yn ei ddisgrifio, mae'r cyfansoddyn yn gweithredu fel cludydd electronau amgen, yn ymgysylltu â signalau gwrthocsidiol a gwrth-apoptotig, yn atal MAO a NOS, ac yn cysylltu ag adnewyddu mitocondriaidd drwy fiogenesis ac awtophagi. Un gangen o broffil pleiotropig yw awtophagi, nid y stori gyfan.

Beth nad yw'r arbrofion yn ei ddangos

Mae amddifadedd serwm yn modelu straen troffig a metabolaidd mewn dysgl. Nid yw'n modelu ymprydio organeb gyfan: mae glwcos, asidau amino, a halwynau yn aros yn y cyfrwng sylfaenol, ac nid oes ymddygiad bwydo. Ni ellir trosi crynodiadau meithrin o 20 nM i 5 μM yn ddosau i bobl drwy rifyddeg, oherwydd bod amsugno, rhwymo i broteinau, cyflwr rhydocs, metaboledd, cronni mewn meinweoedd, ac amser amlygiad oll yn wahanol.

Nid oes unrhyw dreial mewn pobl wedi'i gynllunio i ddangos fflwcs awtophagig a anwythir gan las methylen mewn cleifion. Mae'r dystiolaeth fecanistig yn dal i fod yn waith ar gelloedd, ex vivo, ac anifeiliaid, ac mae adolygiadau'n dal i ddisgrifio'r dystiolaeth dros drosglwyddo'r canfyddiadau i ddefnydd clinigol fel tystiolaeth ragarweiniol. Felly nid yw'r astudiaethau hyn yn dangos bod glas methylen yn efelychu ymprydio, yn ymestyn hyd oes pobl drwy awtophagi, nac yn cwblhau fflwcs awtophagig yn ymennydd pobl. Mae angen tystiolaeth glinigol benodol ar honiadau am efelychu ymprydio a hirhoedledd, ac nid yw treialon glas methylen mewn pobl ar gyfer dibenion eraill yn dod yn dreialon awtophagi drwy gysylltiad yn unig. Dylid darllen ymchwil ar fodelau straen maethol a hirhoedledd gan gadw'r ffin honno mewn cof.

Ar gyfer y papur nesaf y byddwch yn ei ddarllen, defnyddiwch y rhestr wirio yn ei threfn. Yn gyntaf, gofynnwch pa gangen a newidiodd: AMPK, mTOR, neu'r naill na'r llall. Yna gofynnwch a oedd prawf fflwcs yn cyd-fynd â chanlyniad LC3 neu a yw'n sefyll ar ei ben ei hun. Yna gwiriwch a wnaeth rhwystro'r llwybr ddileu'r budd, a thrwy ba ddull. Mae astudiaeth sy'n ateb y tri chwestiwn wedi ennill yr hawl i wneud honiad mecanistig cryf. Mae un sy'n ateb y cyntaf yn unig wedi dangos signal caniatâd, ac mae gweddill y daith yn dal heb ei fapio.