Спектр паглынання метыленавага сіняга і малярны каэфіцыент паглынання: даведнік з указаннем умоў

Спектр метыленавага сіняга здаецца простым, пакуль вы не паспрабуеце выкарыстаць узяты з яго лік у іншым вымярэнні. Адна лабараторыя паведамляе малярны каэфіцыент экстынкцыі каля 82,000. Іншая — 67,000. Трэцяя — больш за 100,000. Усе тры значэнні могуць правільна апісваць адпаведныя вымярэнні, але ніводнае з іх не з'яўляецца ўніверсальнай канстантай для гэтага фарбавальніка.

Блытаніна ўзнікае праз змешванне двух розных паняццяў. Аптычная шчыльнасць — гэта вынік вымярэння канкрэтнага раствору ў канкрэтнай кювеце. Малярны каэфіцыент паглынання, які часта абазначаюць як эпсілон, — гэта параметр мадэлі гэтага раствору. Калі метыленавы сіні змяняе свой стан асацыяцыі, змяняецца мадэль, а разам з ёй і параметр. Карысна разглядаць кожны каэфіцыент як значэнне з указаннем умоў: разам з лікам павінны быць прыведзены даўжыня хвалі, растваральнік, pH або буфер, тэмпература, дыяпазон канцэнтрацый і даўжыня аптычнага шляху.

Паласа манамера ў разбаўленым водным растворы

У разбаўленым водным растворы асноўная паласа катыёна метыленавага сіняга знаходзіцца каля 664–665 nm; у залежнасці ад прыбора і спосабу каліброўкі звычайна прыводзяць значэнні ў межах 664–668 nm. Гэтая паласа падыходзіць для колькаснага вызначэння, калі раствор дастаткова разбаўлены і большая частка фарбавальніка знаходзіцца ў манамернай форме.

Тры літаратурныя значэнні паказваюць, чаму ўмовы важнейшыя за сам лік. Даследчыкі глін, якія падтрымлівалі канцэнтрацыю водных узораў ніжэй за прыблізна 7 мікрамаляр і выкарыстоўвалі кюветы 1 cm, паведамілі значэнне эпсілон каля 82,000 M-1 cm-1 пры 665 nm. Гэтае значэнне незвычайна добра задакументавана як эмпірычны нахіл калібровачнай прамой для вельмі разбаўленых водных узораў. Пазнейшая першасная каліброўка ў дэіянізаванай вадзе пры канцэнтрацыях ад 2.34 да 37.52 мікрамаляр і аптычным шляху 1 cm дала каля 67,100 M-1 cm-1 пры 665 nm для агульнай канцэнтрацыі фарбавальніка. Ніжэйшы вынік чаканы і не супярэчыць папярэдняму, бо верхняя палова гэтага калібровачнага дыяпазону ўжо ўтрымлівае прыкметную долю дымера. Трэцяе значэнне, каля 73,460 M-1 cm-1 пры 664 nm, атрымана ў працы пры pH 6.86 і 293 K, дзе назіраны спектр расклалі на манамерную і дымерную складнікі, як апісана ў нядаўнім крытычным аглядзе фотафізікі метыленавага сіняга. Гэты лік адносіцца да манамернай складнікі, вылучанай шляхам дэканвалюцыі, а не да непасрэднага нахілу залежнасці аптычнай шчыльнасці ад агульнай канцэнтрацыі фарбавальніка.

Практычная выснова: выбірайце каэфіцыент, умовы вызначэння якога адпавядаюць вашым узорам, або выконвайце ўласную каліброўку. Не пераносіце значэнне 82,000 на аналіз у фасфатным буферы пры канцэнтрацыі 30 мікрамаляр, мяркуючы, што лінейнасць усё яшчэ захоўваецца.

Кароткахвалевае плячо — гэта сумесь складнікаў

З павелічэннем канцэнтрацыі плячо каля 600–615 nm узрастае адносна піка пры 664 nm. У сучасных працах уклад дымера H-тыпу звычайна размяшчаюць каля 605–610 nm. Глабальны спектральны аналіз метыленавага сіняга ў вадзе вылучае максімум дымера пры 607 nm і максімум вышэйшага агрэгата пры 600 nm, а таксама рэзанансныя складнікі манамера пры 664 і 650 nm. Поўны тэкст даступны праз запіс адкрытага доступу для PMID 33251415.

Гэтае плячо не варта пазначаць як аптычную шчыльнасць чыстага дымера. Вібрацыйна-электронная структура манамера таксама ўносіць уклад у той жа вобласці, таму вымераная вышыня з'яўляецца сумай накладзеных укладаў. Адна глабальная падгонка паказала, што мадэль з манамерам і дымерам не апісвала ўвесь дыяпазон ад 1.1 мікрамаляр да 3.4 мілімаляр, а даданне тэтрамера дало найлепшую адпаведнасць; пры гэтым сігнал тэтрамера ўжо выяўляўся ніжэй за 34 мікрамаляр. Атрыманыя пры падгонцы каэфіцыенты складнікаў былі вялікімі: каля 107,800 M-1 cm-1 пры 664 nm для асноўнай манамернай складнікі, каля 101,400 для дымера пры 607 nm і каля 138,500 для тэтрамера пры 600 nm у дэіянізаванай вадзе без буфера з канцэнтрацыяй хларыду натрыю ад 0 да 0.15 M і пры тэмпературах ад 282 да 333 K. Гэта складнікі, вылучаныя з дапамогай мадэлі, таму імі нельга замяняць эмпірычны нахіл паводле закона Бера — Ламберта.

Ступень дымерызацыі быў колькасна вызначаны непасрэдна. Пры pH 6.86 і 293 K адно даследаванне атрымала канстанту дымерызацыі каля 3,900 M-1. Такая велічыня тлумачыць, чаму рабочы раствор з канцэнтрацыяй 5 мікрамаляр паводзіць сябе амаль лінейна, а зыходны раствор з канцэнтрацыяй 50 мікрамаляр — не. Пры распрацоўцы метаду карысна правяраць адносіну аптычнай шчыльнасці каля 610 nm да аптычнай шчыльнасці каля 665 nm. Калі гэтая адносіна расце з канцэнтрацыяй, эпсілон пры 664 nm ужо не апісвае адну нязменную форму.

У інтэрвале канцэнтрацый, дзе пераважае адна пара форм, якія пераходзяць адна ў адну, спектры могуць мець агульны ізасбестычны пункт; у водных серыях яго эксперыментальна назіраюць каля 625 nm. Выразны нерухомы пункт узгадняецца з наяўнасцю дзвюх асноўных форм. Калі з павелічэннем канцэнтрацыі пункт зрушваецца або знікае, разглядайце гэта як папярэджанне пра з'яўленне вышэйшых агрэгатаў або зрушэнне раўнаваг, а не як памылку прыбора.

Растваральнік, pH і тэмпература змяняюць спектр

Вада спрыяе асацыяцыі. Даданне дыметылсульфаксіду прыгнятае дымерызацыю, зрушвае максімумы паглынання і флуарэсцэнцыі ў бок даўжэйшых хваль і павялічвае квантавы выхад флуарэсцэнцыі прыкладна ў чатыры разы, паводле даследавання ўплыву растваральніка на метыленавы сіні ў вадзе і сумесях з DMSO, праіндэксаванага як PMID 30933781. У гэтай працы водныя спектры разглядаюцца як раўнавага паміж манамерам і дымерам з паглынаннем манамера каля 650–670 nm і дымера каля 580–615 nm; канстанты дымерызацыі выводзяцца са спектраў пры 293.15 K.

Спірты змяняюць і становішча паласы, і яе ўяўную інтэнсіўнасць, але не ліквідуюць агрэгацыю. У адным першасным параўнанні пры канцэнтрацыі 31.3 мікрамаляр і пакаёвай тэмпературы, апісаным у даследаванні ўплыву растваральніка на метыленавы сіні, даўгахвалевы максімум знаходзіўся пры 665 nm у вадзе і пры 655 nm у метаноле, а ўяўныя значэнні для раствору ў цэлым складалі каля 37,100 у вадзе і 60,800 у метаноле. Асобная валідацыя ў абсалютным этаноле пры 298 K дала максімум пры 655 nm з эпсілон каля 68,000.

Звычайныя змены pH зрушваюць спектр менш, чым мяркуецца ў многіх пратаколах. У згаданым вышэй крытычным аглядзе паведамляецца, што прыкладна ад pH 2 да pH 12 максімум заставаўся каля 665 nm, а інтэнсіўнасць да pH 11 змянялася толькі нязначна. Тып буфера і іонная сіла могуць уплываць на вынікі не менш, чым намінальны pH, таму запісвайце канкрэтныя буфер і соль, а не толькі паказанне pH-метра. Моцная кіслата або моцная шчолач — асобны выпадак, бо фарбавальнік можа зазнаваць хімічныя змены, а не зварачальную асацыяцыю. Тэмпература і соль таксама зрушваюць раўнавагу, таму ў даследаванні водных раствораў 2020 года абодва фактары змянялі мэтанакіравана.

Як вымяраць, каб значэнне заставалася сапраўдным

Колькасныя вымярэнні абапіраюцца на суадносіны Бера — Ламберта: аптычная шчыльнасць роўная здабытку эпсілон, канцэнтрацыі і даўжыні аптычнага шляху. Акрамя таго, неабходна пацвердзіць, што ў вашых умовах лінейны інтэрвал сапраўды захоўваецца.

Для нізкіх мікрамалярных канцэнтрацый выкарыстоўвайце кювету 1 cm. Пры эпсілон каля 82,000 канцэнтрацыя 5 мікрамаляр дае аптычную шчыльнасць каля 0.41, а 10 мікрамаляр — каля 0.82. Для вымярэння пераважна манамера ў чыстай вадзе бяспечней трымацца каля або ніжэй за прыблізна 5–7 мікрамаляр, чым будаваць каліброўку далёка ў вобласці дзясяткаў мікрамаляр. Для канцэнтраваных зыходных раствораў скарачайце аптычны шлях замест таго, каб прымаць аптычную шчыльнасць, значна большую за 1.

Выкарыстоўвайце ідэнтычную матрыцу для халастога ўзору: ваду той жа ступені чысціні, тую ж долю сурастваральніка, той жа буфер і солі, але без фарбавальніка. Рыхтуйце калібровачныя растворы ў той жа матрыцы і пры той жа тэмпературы. Пры распрацоўцы скануйце ўвесь бачны дыяпазон, пажадана прыкладна ад 550 да 750 nm, а не вымярайце толькі на адной даўжыні хвалі. Сачыце за формай, а не толькі за вышынёй. Калі паслядоўнае развядзенне змяняе нармалізаваную форму спектра, хімічны стан сістэмы залежыць ад канцэнтрацыі. Стабільны максімум і стабільная адносіна аптычнай шчыльнасці пры 610 і 665 nm — больш пераканаўчыя сведчанні прымальнага дыяпазону, чым адно толькі высокае значэнне R у квадраце.

Дакументуйце форму рэагенту. Камерцыйны матэрыял можа быць бязводным хларыдам метылтыянінію або гідратам, напрыклад трыгідратам, таму малярная маса, выкарыстаная для разлікаў зыходнага раствору, павінна адпавядаць фактычнаму змесціву ёмістасці. Ужо адзін гэты крок тлумачыць частку разыходжанняў паміж намінальнымі малярнымі канцэнтрацыямі ў розных лабараторыях. Такая ж дысцыпліна патрэбная, калі вынікі выкарыстоўваюцца ў разліках колькаснага аналізу, калі спектры дапамагаюць правяраць стабільнасць рэцэптуры і калі профілі прымесей патрабуюць праверкі чысціні і спецыфікацый.

Зводка з указаннем умоў

Выкарыстоўвайце гэтую табліцу як пачатковы шаблон для лабараторнага запісу, а не як крыніцу ўзаемазамяняльных канстант.

Такім чынам, адказ на пытанне пра даўжыню хвалі паглынання метыленавага сіняга кароткі, але патрабуе доўгай заўвагі. Паведамляйце пік, які вы вымералі, у тым растворы і пры той канцэнтрацыі, якія вы вымяралі. Гэтая звычка не дазволіць аднаму значэнню каля 664 nm для разбаўленага воднага раствору ператварыцца ў ілжывую ўніверсальную канстанту.