Метыленавы сіні і ATP: ці азначае большае спажыванне кіслароду больш энергіі?

Ізаляваная мітахондрыя знаходзіцца ў камеры з палівам, але без ADP. Яна павольна спажывае кісларод. Дадайце ADP — і спажыванне кіслароду ўзрасце ў некалькі разоў. Пачакайце, пакуль ADP вычарпаецца, — і спажыванне кіслароду зноў знізіцца. Паліва не змянялася. Змянялася толькі патрэба ў ATP.

Гэтая кароткая паслядоўнасць змяшчае ўсю сутнасць адрознення, якому прысвечаны артыкул. Спажыванне кіслароду паказвае, наколькі хутка электроны рухаюцца па дыхальным ланцугу да кіслароду. Выпрацоўка ATP паказвае, якая частка гэтага патоку ператвараецца ў прыдатную для выкарыстання энергію. Іх звязвае прамежкавы этап — пратонны градыент на ўнутранай мембране мітахондрыі. Усё, што змяняе ступень спалучэння гэтага градыенту з сінтэзам ATP, можа змяняць два канчатковыя паказчыкі ў розных кірунках. Метыленавы сіні тут — карысны настаўнік, бо назіралі абодва яго эфекты: у адных прэпаратах ён павышаў спажыванне кіслароду разам з ATP, а ў іншых — павышаў спажыванне кіслароду, тады як ATP заставаўся нязменным або зніжаўся.

Чытачы, якія хочуць спачатку ўбачыць больш агульную карціну пераносу электронаў, могуць пачаць з таго, як метыленавы сіні пераносіць электроны па дыхальным ланцугу. А тыя, хто хоча разабрацца ў тэрміналогіі ранніх эксперыментаў з кіслародам, могуць прачытаць, што насамрэч паказалі першыя вымярэнні дыхання.

Дыханне, ATP і градыент паміж імі

Электроны ад NADH і FADH2 трапляюць у ланцуг праз комплексы I і II, праходзяць праз комплекс III да цытахрому c, а затым праз комплекс IV — да кіслароду. Энергія, якая вызваляецца ў комплексах I, III і IV, перапампоўвае пратоны з матрыкса ў міжмембранную прастору. Гэтае раздзяленне зарадаў і розніца ў кіслотнасці ствараюць пратон-рухальную сілу, а яе электрычная складальная — мембранны патэнцыял — звычайна пераважае.

ATP-сінтаза дазваляе пратонам вяртацца ў матрыкс і выкарыстоўвае энергію, якая пры гэтым вызваляецца, каб злучыць ADP і фасфат у ATP. Такім чынам, паслядоўнасць такая:

спажыванне кіслароду, затым перапампоўванне пратонаў, затым градыент, затым сінтэз ATP.

Але пратоны могуць вяртацца і іншымі шляхамі. Любое вяртанне ў абыход ATP-сінтазы — гэта ўцечка пратонаў. Уцечка прымушае ланцуг зноў перапампоўваць тыя самыя пратоны, каб падтрымліваць стабільны мембранны патэнцыял. Гэта патрабуе больш кіслароду, але не дае больш ATP. Дастаткова моцная ўцечка азначае раз'яднанне: спажыванне кіслароду расце, а ATP застаецца нязменным або зніжаецца, і страчаная энергія вылучаецца ў выглядзе цяпла.

Стан 3, стан 4 і каэфіцыент дыхальнага кантролю

Класічная тэрміналогія паходзіць з даследаванняў ізаляваных мітахондрый. Стан 3 — гэта дыханне пры наяўнасці субстрату і ADP: ATP-сінтаза памяншае градыент, мембранны патэнцыял зніжаецца, ланцуг паскараецца, каб аднавіць яго, а спажыванне кіслароду высокае, таму што выпрацоўваецца ATP. Стан 4 — гэта дыханне пасля вычарпання ADP: ATP-сінтаза прастойвае, градыент павялічваецца, высокі мембранны патэнцыял перашкаджае далейшаму перапампоўванню, а спажыванне кіслароду падае да ўзроўню, патрэбнага для кампенсацыі ўцечкі.

Такім чынам, каэфіцыент дыхальнага кантролю — стан 3, падзелены на стан 4, — паказвае, наколькі шчыльна спалучаныя працэсы ў прэпараце. Высокі каэфіцыент азначае, што ADP моцна кантралюе дыханне. Зніжэнне каэфіцыента пры росце дыхання ў стане 4 азначае, што ўцечка пачынае пераважаць. Менавіта праз гэтую прызму можна зразумець прыведзеныя ніжэй вынікі даследаванняў метыленавага сіняга.

Варта трымаць у галаве адну мадэль. Высокі мембранны патэнцыял запавольвае ланцуг. Рассейванне патэнцыялу паскарае яго. Ланцуг рэагуе на тое, наколькі цяжкім стала перапампоўванне, а не непасрэдна на тое, ці выпрацоўваецца ATP.

Калі канчатковыя паказчыкі змяняюцца разам

Найбольш выразны прыклад спалучэння паходзіць з даследавання ізаляваных мітахондрый мозгу марской свінкі з блакаванымі дыхальнымі комплексамі. Пры канцэнтрацыі метыленавага сіняга ад 100 нанамаляр да 1 мікрамаляр спажыванне кіслароду ў стане спакою павялічвалася, калі палівам служылі глутамат з малатам, сукцынат або гліцэрафасфат, а дыханне, стымуляванае ADP, заставалася нязменным. У мітахондрыях з таксічна заблакаваным комплексам I або комплексам III фарбавальнік умерана павялічваў выпрацоўку ATP, аднаўляў мембранны патэнцыял і паляпшаў паглынанне кальцыю. Прапанаваны шлях — абыходны: фарбавальнік прымае электроны да месца блакавання і перадае іх цытахрому c, абмінаючы пашкоджаны комплекс.

У другім выпадку сумеснага росту выкарыстоўваецца зусім іншая крыніца ATP. У ізаляваных мітахондрыях мозгу з інгібіраванай ATP-сінтазай метыленавы сіні ўсё роўна стымуляваў дыханне на ўсіх правераных субстратах. Але сінтэз ATP павялічваўся толькі на альфа-кетаглутараце і глутамаце — двух субстратах, з якіх утвараецца сукцыніл-CoA. Калі алігамiцын блакаваў ATP-сінтазу, дадатковы ATP утвараўся дзякуючы субстратнаму фасфарыляванню сукцыніл-CoA-лігазай у цыкле цытрынавай кіслаты, а не дзякуючы акісляльнаму фасфарыляванню. Фарбавальнік таксама аднаўляў мембранны патэнцыял, калі комплекс I і ATP-сінтаза былі інгібіраваныя адначасова. Тут спажыванне кіслароду і ATP змяняліся разам, але толькі там, дзе субстрат дазваляў працаваць другому шляху ўтварэння ATP. На сукцынаце або малаце дыханне ўзмацнялася без дадатковага ATP. Той самы фарбавальнік, тая самая камера, іншае паліва — іншы вынік.

Калі канчатковыя паказчыкі разыходзяцца

Выпадкі разыходжання таксама апублікаваныя і не менш павучальныя. У даследаванні ізаляваных мітахондрый печані пацука 1997 года метыленавы сіні паскараў дыханне ў стане 4 у мітахондрыях з шчыльным спалучэннем, якія дыхалі на сукцынаце. Гэта зніжала каэфіцыент дыхальнага кантролю. Эфект быў бачны пачынаючы з 0.5 мікрамаляр і быў моцным пры 5 мікрамаляр — канцэнтрацыі, блізкай да ўзроўняў у плазме пасля ўнутрывеннага болюснага ўвядзення 100 міліграмаў. Пры 5 мікрамаляр мітахондрыі таксама набракалі, але парушэнне спалучэння спачатку з'яўлялася пры ніжэйшых канцэнтрацыях. Гэта сведчыць, што ўцечка папярэднічала структурнаму пашкоджанню, а не была яго вынікам. У раз'яднаных мітахондрыях фарбавальнік стымуляваў дыханне ў залежнасці ад канцэнтрацыі, прычым эфект дасягаў насычэння. Спажыванне кіслароду расло ў абодвух прэпаратах. Сінтэз ATP на адзінку спажытага кіслароду — не. Гэта класічнае раз'яднанне разам з пераносам электронаў у адной і той самай малекуле.

Найбольш выразнае разыходжанне назіралася ў сятчатцы. У мышэй з дэфіцытам AIF і ў фотарэцэптарных клетках, апрацаваных ратэнонам, метыленавы сіні захоўваў таўшчыню сятчаткі, маркеры фотарэцэптараў і структуру мітахондрый, зніжаў суадносіны NADH да NAD і аслабляў стрэсавыя сігнальныя шляхі, у тым ліку адказ на няправільна згорнутыя бялкі і мітафагію. Пры гэтым ён не ліквідаваў дэфіцыт ATP. Абарона без аднаўлення энергіі азначае, што станоўчы эфект быў звязаны з акісляльна-аднаўленчым балансам і цэласнасцю мітахондрый, а не з дадатковым ATP. Той, хто прыраўняў бы захаванне тканкі да аднаўлення выпрацоўкі энергіі, цалкам няправільна зразумеў бы гэты эксперымент.

Даследаванне мітахондрый мозгу дадае да гэтага балансу графу выдаткаў. Тыя самыя нізкія канцэнтрацыі, якія паляпшалі біяэнергетыку, таксама павялічвалі ўтварэнне перакісу вадароду ва ўсіх правераных умовах і запавольвалі яго выдаленне. Гэта вымяралі калібраваным аналізам Amplex, а не неспецыфічным фарбавальнікам. Больш ATP і больш акісляльніка з'яўляліся разам.

Практычны спіс пытанняў для чытання

Чатыры пытанні дапамагаюць адрозніць вынік са спалучэннем ад выніку з раз'яднаннем.

Па-першае, які канчатковы паказчык насамрэч вымяралі. Само па сабе спажыванне кіслароду не паказвае ATP. Сінтэз ATP, мембранны патэнцыял і каэфіцыент дыхальнага кантролю дадаюць кожны сваю частку інфармацыі, якую кіслародны электрод не бачыць. Дапаможнік па чытанні сцвярджэнняў з даследаванняў метыленавага сіняга падрабязна разбірае гэты падыход да канчатковых паказчыкаў.

Па-другое, які субстрат сілкаваў мітахондрыі. Вынік з сукцыніл-CoA паказвае, што выбар паліва можа вызначаць, ці здольнае дадатковае дыханне ўвогуле даць дадатковы ATP.

Па-трэцяе, якую канцэнтрацыю выкарыстоўвалі. У мітахондрыях мозгу метыленавы сіні ў нанамалярных і нізкіх мікрамалярных канцэнтрацыях даваў умеранае паляпшэнне біяэнергетыкі цаной павелічэння колькасці акісляльніка; у мітахондрыях печані канцэнтрацыі ад паловы мікрамаляра і вышэй аслаблялі спалучэнне; пры 5 мікрамаляр дадавалася набраканне. Канцэнтрацыя — частка механізму, а не фонавая дэталь.

Па-чацвёртае, у якой мадэлі атрымалі вынік. Ізаляваныя мітахондрыі раскрываюць схему сувязяў, але ў цэлых клетках і тканках дадаюцца транспарт, аднаўленне да бясколернай формы і канкуруючыя шляхі адтоку электронаў. Лабараторныя даследаванні дазавання, у тым ліку таго, як канцэнтрацыя і пратакол вызначаюць эфекты метыленавага сіняга, — гэта мост паміж паказчыкамі ў камеры і любым сцвярджэннем пра чалавека.

Спажыванне кіслароду паказвае паток электронаў. ATP паказвае, якая частка гэтага патоку была ператвораная ў назапашаную энергію. Метыленавы сіні можа змяняць любы з гэтых паказчыкаў, а прыведзеныя эксперыменты дэманструюць усе чатыры варыянты: абодва растуць; дыханне ўзмацняецца толькі там, дзе дазваляе субстрат; дыханне ўзмацняецца, а спалучэнне слабее; тканка захоўваецца, а ATP застаецца нязменным. Лічба на кіслародным электродзе — гэта пачатак інтэрпрэтацыі, а не яе завяршэнне.