Метыленавы сіні ў даследаваннях інсульту і цэрэбральнай гіпаперфузіі: што насамрэч паказваюць тры мадэлі

Закаркаваная артэрыя, культура клетак без пажыўных рэчываў і пацук са звужанымі артэрыямі шыі могуць здавацца трыма варыянтамі аднаго эксперыменту. Але гэта не так. Кожны з іх ставіць сваё пытанне, і метыленавы сіні ў кожным дае іншы адказ. Калі іх змяшаць, навуковая літаратура выглядае супярэчлівай. Калі разглядаць асобна, выяўляецца выразная заканамернасць, якая ў асноўным залежыць ад часу ўвядзення.

Менавіта гэтае размежаванне і ёсць галоўная мэта агляду. Тры мадэлі — гэта востры факальны інсульт, кіслародна-глюкозная дэпрывацыя з рэаксігенацыяй у культуры клетак і хранічная цэрэбральная гіпаперфузія на працягу тыдняў. Меркаваны механізм, які іх звязвае, — мітахандрыяльны, але вынікі адрозніваюцца, бо адрозніваюцца метабалічныя ўмовы.

Тры мадэлі адказваюць на розныя пытанні

Востры факальны інсульт у пацукоў звычайна выклікаюць аклюзіяй сярэдняй мазгавой артэрыі, скарочана MCAO. Закаркаванне, падобнае да тромба, стварае ішэмічнае ядро, акружанае пенумбрай — тканкай, якая знаходзіцца пад пагрозай, але якую патэнцыйна можна выратаваць, калі крывацёк адновіцца. Пытанне тут у тым, ці запавольвае ўмяшанне рост інфаркту або захоўвае функцыю ў перыяд рэперфузіі.

Кіслародна-глюкозная дэпрывацыя, скарочана OGD, дзейнічае ў зусім іншым маштабе. Культываваныя клеткі мозгу змяшчаюць ва ўмовы амаль нулявога ўтрымання кіслароду без глюкозы, а затым вяртаюць у звычайнае асяроддзе. Тут няма ні тромба, ні калатэральнага кровазвароту, ні артэрыяльнага ціску, ні імуннай сістэмы. Пытанне выключна клетачнае: што адбываецца з дыханнем, АТФ і выжываннем, калі субстраты знікаюць, а потым вяртаюцца.

Для мадэлявання хранічнай цэрэбральнай гіпаперфузіі ў пацукоў выкарыстоўваюць пастаянную двухбаковую аклюзію сонных артэрый — мадэль 2VO. Крывацёк да пярэдняга мозгу зніжаецца і застаецца нізкім на працягу тыдняў. Няма раптоўнага факальнага інфаркту і няма неадкладнай рэперфузіі. Пытанне ў тым, ці захоўвае метабалічная падтрымка на працягу тыдняў сасуды, мітахондрыі і памяць пры працяглым зніжэнні крывацёку.

Таму паляпшэнне памяці пасля аднаго месяца лячэння ў мадэлі 2VO нічога непасрэдна не кажа пра выратаванне мозгу чалавека падчас неадкладнай тромбэктаміі. Гэтае адрозненне важнае, бо большасць аптымістычных аглядаў яго абмінае.

Востры інсульт: абарона пры рэперфузіі, запавольванне без яе

Найбольш выразны вынік пры вострым інсульце атрыманы ў мадэлі часовай MCAO з рэперфузіяй. У пацукоў выклікалі аклюзію на 60 хвілін, затым пачыналі нутравенна ўводзіць метыленавы сіні ў нізкай дозе ў момант рэперфузіі, з дадатковымі дозамі праз 3 гадзіны і на 2-і дзень. МРТ паказала, што да 2-га дня ачаг паражэння ў групе, якая атрымлівала носьбіт, павялічыўся прыкладна на 19 працэнтаў, а ў групе лячэння зменшыўся прыкладна на 17 працэнтаў. Канчатковыя інфаркты былі прыкладна на 30 працэнтаў меншыя, а неўралагічныя паказчыкі — лепшыя на 2-і і 7-ы дні. Паводле візуалізацыі, захаванасць тканкі палепшылася як у ядры, так і ў пенумбры. Больш шырокая літаратура пра нейрапратэкцыю разглядае гэтую абарону, прымеркаваную да рэперфузіі, разам з вынікамі пры глабальнай ішэміі і траўме.

Карціна змяняецца, калі артэрыя застаецца закаркаванай. У эксперыменце з пастаяннай MCAO метыленавы сіні, уведзены падчас ішэміі, якая працягвалася, запавольваў пашырэнне ачага на дыфузійных выявах і ненадоўга падаўжаў перфузійна-дыфузійную неадпаведнасць, крыху паляпшаючы мясцовы крывацёк. Аднак канчатковы аб’ём інфаркту праз 24 гадзіны істотна не адрозніваўся. Ён затрымліваў пераход тканкі пад пагрозай у інфаркт, але не замяняў аднаўлення праходнасці сасуда.

Трэцяе даследаванне вострага інсульту дадае нюансы механізму і дозы. Аднаразовая ўнутрыбрушынная доза адразу пасля аклюзіі дала найбольшае памяншэнне інфаркту, прыкладна на 50 працэнтаў, пры прамежкавай дозе 5 mg/kg, а не пры 1 або 10 mg/kg, разам з лепшымі сенсаматорнымі паказчыкамі. Аўтары звязалі гэта з захаваннем структуры мітахондрый і ўзмацненнем мітафагіі — выбарачнага выдалення пашкоджаных мітахондрый. Такім чынам, доза, шлях і графік увядзення маюць значэнне, а значэнні ў mg/kg для пацукоў не з’яўляюцца дозамі для лячэння інсульту ў людзей.

Культура клетак: той самы прэпарат дапамагае або шкодзіць у залежнасці ад часу ўвядзення

Эксперымент з астрацытамі — найбольш паказальны і той, які часцей за ўсё цытуюць недакладна. Першасныя астрацыты кары мозгу мышэй на 6 гадзін змяшчалі ва ўмовы цяжкай дэпрывацыі пры 0.1 працэнта кіслароду ў асяроддзі без глюкозы, пірувату і сыроваткі, пасля чаго праводзілі 24 гадзіны рэаксігенацыі з адноўленымі субстратамі. Каля паловы клетак загінула, што дазваляла выявіць эфект у абодвух напрамках.

Калі метыленавы сіні прысутнічаў падчас фазы дэпрывацыі, выжыванне пагаршалася, а не паляпшалася. Калі ж яго ўводзілі пры рэаксігенацыі, нізкія мікрамалярныя канцэнтрацыі паляпшалі жыццяздольнасць і павялічвалі спажыванне кіслароду, паглынанне глюкозы і выпрацоўку АТФ. У звычайных умовах тыя самыя канцэнтрацыі павялічвалі паглынанне глюкозы прыкладна на 89 працэнтаў пры 0.1 мікрамоляра і прыкладна на 200 працэнтаў пры 1 мікрамоляры. Пасля пашкоджання захоўваліся глікаген і актыўнасць гексакіназы, а вымярэнні не паказалі павелічэння супераксіду.

Механізм прасцей зразумець праз аналогію з рэзервовым генератарам. Метыленавы сіні дзейнічае як альтэрнатыўны пераносчык электронаў, які прымае аднаўленчыя эквіваленты і перадае іх да цытахрому c і комплексу IV. Гэта падтрымлівае паток электронаў і сінтэз АТФ, адначасова памяншаючы ўцечку электронаў на папярэдніх участках ланцуга. Пры цяжкай дэпрывацыі такая стымуляцыя шкодная, бо павялічвае метабалічную патрэбу, калі кіслароду і глюкозы амаль няма, і можа хутчэй вычарпаць апошнія запасы. Пасля вяртання субстратаў тая самая ўласцівасць становіцца карыснай, бо дапамагае пашкоджаным мітахондрыям эфектыўна выкарыстоўваць зноў даступныя кісларод і глюкозу. Менавіта таму вынікі, прыведзеныя ў тлумачэннях мітахандрыяльнага пераносу электронаў, трэба разглядаць з улікам умоў дэпрывацыі.

Адно ўдакладненне: гэтае правіла адносна часу ўвядзення датычыцца менавіта гэтай культуры астрацытаў. У спадарожным клетачным даследаванні з іншым тыпам клетак, мякчэйшай дэпрывацыяй і ніжэйшай канцэнтрацыяй абарону выявілі нават пры ўздзеянні падчас дэпрывацыі. Тып клетак, рэшткавы кісларод, канцэнтрацыя і пратакол вызначаюць, ці будзе эфект станоўчым або адмоўным.

Хранічна зніжаны крывацёк: памяць, цытахромаксідаза і сасуды на працягу тыдняў

У хранічных эксперыментах выкарыстоўвалі штодзённае ўвядзенне нізкай дозы на працягу тыдняў, а не аднаразовае неадкладнае болюснае ўвядзенне. У першым даследаванні пацукі з пастаяннай аклюзіяй сонных артэрый атрымлівалі 4 mg/kg штодня на працягу аднаго месяца. Прэпарат уводзілі пасля кожнага штодзённага навучальнага сеанса, каб уздзейнічаць на кансалідацыю памяці, а не на непасрэднае выкананне задання. Жывёлы з аклюзіяй павольней асвойвалі заданні на зрокавае адрозніванне і горш выконвалі складаную праверку памяці, тады як здольнасць плаваць, рухальная актыўнасць і распазнаванне пахаў не змяняліся. Штодзённае лячэнне памяншала парушэнні навучання і памяці, не змяняючы агульных рухальных паводзін.

У наступным даследаванні пасля таго самага месячнага рэжыму ацанілі размеркаванне актыўнасці цытахромаксідазы, якая з’яўляецца мітахандрыяльным комплексам IV, у 44 рэгіёнах мозгу. Аклюзія зніжала актыўнасць ферменту ў зрокавай, прэфрантальнай і перырынальнай кары, а таксама ў гіпакампе і міндалепадобным целе, і аслабляла ўзгодненую актыўнасць зрокавай кары і гіпакампа. Лячэнне захоўвала рэгіянальную актыўнасць ферменту і ўзмацняла гэтыя міжрэгіянальныя метабалічныя карэляцыі, а захаваная актыўнасць карэлявала з лепшым выкананнем заданняў. Гэтыя карэляцыі апісваюць узгодненую актыўнасць метабалічнага ферменту, а не непасрэдныя вымярэнні функцыянальнай звязанасці мозгу чалавека. Агляды энергетычнага метабалізму мозгу дапамагаюць не блытаць гэтыя паняцці.

У асобным тыднёвым даследаванні выкарыстоўвалі 2 mg/kg штодня і дадавалі інгібітар сігнальнага шляху, каб праверыць механізм. Пры лячэнні мазгавы крывацёк павялічыўся прыкладна з 60 да 100 mL на 100 g за хвіліну, а шчыльнасць сасудаў у гіпакампе — прыкладна з 15.1 да 23 працэнтаў. Абодва паляпшэнні часткова знікалі пры блакаванні шляху выжывання клетак PI3K/Akt, а ўзровень фасфарыляванага Akt пры лячэнні павышаўся. Вынікі адносна крывацёку, шчыльнасці сасудаў, бар’ера і нейронаў паказваюць на нейраваскулярную абарону, звязаную з сігналізацыяй PI3K/Akt, а не на чыста метабалічны эфект.

Чаму ўсё гэта не раўназначна неадкладнай дапамозе пры інсульце

Менавіта кантраляваныя лабараторныя ўмовы не дазваляюць непасрэдна пераносіць гэтыя вынікі ў клінічную практыку. У культуры клетак няма ні тромба, ні фармакакінетыкі. Мадэль 2VO — гэта працяглае глабальнае зніжэнне крывацёку, а не раптоўная факальная эмбалія з пенумбрай, якая ўзнікла некалькі хвілін таму. Нават у мадэлі MCAO ў пацукоў выкарыстоўваюць маладых здаровых жывёл, анестэзію, аднастайныя аклюзіі і дакладна прымеркаванае ўвядзенне доз. Гэта адрозніваецца ад сітуацыі ў пажылых пацыентаў з рознымі тромбамі, атэрасклерозам, гіпертэнзіяй, дыябетам і невядомым часам пачатку інсульту.

Ніводнае апублікаванае рандомізаванае даследаванне на людзях не ўстанавіла, што метыленавы сіні з’яўляецца сродкам неадкладнага лячэння вострага ішэмічнага інсульту. У даследаванні з візуалізацыяй мозгу чалавека, якое часам цытуюць, удзельнічалі 26 здаровых дарослых, а не пацыенты з інсультам. Аднаразовая пероральная доза змяняла сігналы мозгу, звязаныя з выкананнем заданняў, з невялікім паляпшэннем узнаўлення інфармацыі з памяці. Гэта паказвае на цэнтральную актыўнасць, а не на эфектыўнасць пры інсульце. Сучасныя рэкамендацыі па неадкладнай дапамозе, наадварот, засяроджаны на хуткай рэперфузіі з дапамогай нутравеннага трамбалізісу ў пацыентаў, якія адпавядаюць крытэрыям, і тромбэктаміі пры прыдатных для яе аклюзіях буйных сасудаў. Стандартныя алгарытмы неадкладнай дапамогі пры інсульце застаюцца адзіным даказаным шляхам. Пры падазрэнні на інсульт ніколі нельга адкладаць дапамогу дзеля ўвядзення метыленавага сіняга, а практычныя абмежаванні экстрапаляцыі даклінічных доз тлумачаць, чаму схемы для пацукоў нельга ўспрымаць як клінічныя рэжымы.

Звесткі пра бяспеку яшчэ больш падкрэсліваюць гэтую мяжу. Для нутравеннага метыленавага сіняга прадугледжана папярэджанне ў рамцы пра цяжкі або смяротны сератанінавы сіндром пры спалучэнні з сератанінергічнымі прэпаратамі, у тым ліку СІЗЗС, СІЗЗСН і інгібітарамі МАО, якія прымаюць многія пацыенты ва ўзросце, характэрным для інсульту. Ён супрацьпаказаны пры дэфіцыце G6PD праз рызыку гемолізу. Ён таксама прыгнятае сігналізацыю аксіду азоту, што ў некаторых умовах павышае сасудзістае супраціўленне і ціск, таму яго нельга апісваць проста як прэпарат, які павялічвае крывацёк у мозгу. Ухвалены рэжым нутравеннага ўвядзення 1 mg/kg пры набытай метгемаглабінеміі не з’яўляецца рэжымам лячэння інсульту.

Карэктная выснова вузкая, але абгрунтаваная. У перыяд рэперфузіі пры часовай факальнай ішэміі метыленавы сіні ў нізкай дозе памяншаў развіццё паражэння ў пацукоў. Пры пастаяннай аклюзіі ён затрымліваў, але не прадухіляў інфаркт. У астрацытах ён шкодзіў падчас цяжкай дэпрывацыі і дапамагаў пры рэаксігенацыі. Пры хранічнай гіпаперфузіі ён захоўваў цытахромаксідазу, сасуды і памяць на працягу тыдняў. Адзін пераносчык, тры кантэксты, тры адказы.