Метыленавы сіні і Bartonella: лабараторныя вынікі і межы клінічных доказаў

Культуральную чашку і пацыента аб’ядноўвае слова «інфекцыя», але не тое, што за ім стаіць. У чашцы інфекцыя — гэта колькасць калоній на агары. У пацыента — гэта бактэрыі ўнутры клетак і сасудаў, прэпараты, якія перамяшчаюцца праз кроў і тканкі, і імунная сістэма, якая выконвае частку працы. Калі змяшаць гэтыя два паняцці, уражлівы лабараторны паказчык пачынае выглядаць як метад лячэння. Калі ж размяжоўваць іх, той самы паказчык застаецца тым, чым ён ёсць: падставай для наступнага эксперыменту.

Гэтае размежаванне — галоўная задача нашага агляду метыленавага сіняга і Bartonella. У двух лабараторных даследаваннях адной даследчай групы метыленавы сіні правяралі супраць Bartonella henselae у станах без росту. Абодва паказалі высокую актыўнасць у шкляным і пластыкавым лабараторным посудзе. Ні ў адным яго не выпрабоўвалі на людзях.

Чаму даследчыкі вывучаюць стацыянарную фазу

У большасці выпрабаванняў антыбіётыкаў выкарыстоўваюць клеткі, якія растуць. Такая мадэль не ўлічвае больш складаны выпадак: клеткі, якія перасталі дзяліцца і вытрымліваюць дзеянне прэпаратаў, што забіваюць іхнія аналагі ў фазе росту.

Bartonella можа захоўвацца ў арганізме, у тым ліку ўнутры эрытрацытаў і эндатэліяльных клетак. Таму група задалася пытаннем, якія ўхваленыя прэпараты могуць знішчаць B. henselae пасля пераходу ў стацыянарную фазу. Нізкая MIC для клетак, якія растуць, не прадказвала знішчэння клетак у стацыянарнай фазе. Рыфампіцын меў вельмі нізкую MIC, але слаба знішчаў стацыянарныя клеткі, тады як злучэнні з вышэйшымі значэннямі MIC знішчалі іх добра. Чытачы, якім патрэбны агульны падыход да разбору такіх публікацый, знойдуць яго ў кіраўніцтве па чытанні даследаванняў метыленавага сіняга.

Першы скрынінг: Li і калегі, 2019

У скрынінгу стацыянарнай фазы 2019 года ў Antibiotics выкарыстоўвалі адзін штам, B. henselae JK53, вырашчаны ў асяроддзі Schneider з 10 працэнтамі фетальнай бычынай сыроваткі пры 37 C і 5 працэнтах CO2. Аднадзённыя культуры пераважна складаліся з рассеяных клетак, якія дзяліліся. Пяцідзённыя культуры з прыблізна 10 у 8-й ступені калонеўтваральных адзінак на mL лічылі стацыянарнай фазай; яны ўтрымлівалі бачныя агрэгаты.

Для аналізу выкарыстоўвалі SYBR Green I з ёдыдам прапідзію, адкалібраваныя паводле сумесяў жывых клетак і клетак, забітых ізапрапанолам. Паколькі метыленавы сіні мае інтэнсіўную афарбоўку, станоўчыя вынікі пацвярджалі мікраскапіяй, а затым падлікам калоній на крывяным агары — больш строгім канчатковым крытэрыем.

Сярод 1,581 ухваленых прэпаратаў пры канцэнтрацыі 50 мікрамоляр метыленавы сіні пакідаў 16 працэнтаў жыццяздольных клетак паводле планшэтнага счытвальніка і 25 працэнтаў паводле мікраскапіі. Для даптаміцыну паказчык склаў 21 працэнт, для некалькіх азолаў — ад 22 да 27 працэнтаў, для гентаміцыну — 32 працэнты, эрытраміцыну — 66 працэнтаў, цыпрафлаксацыну — 74 працэнты. Памаат пірвінію выглядаў больш актыўным паводле счытвальніка, але яго нельга было ацаніць мікраскапіяй праз уласную флуарэсцэнцыю.

Для B. henselae ў фазе росту MIC метыленавага сіняга складала ад 0.08 да 0.16 мікраграма на mL. Для пяцідзённых стацыянарных клетак пры 5 мікраграмах на mL пасля аднаго дня ўздзеяння колькасць калоній зніжалася да ўзроўню, на якім іх не выяўлялі, як і ў выпадку даптаміцыну і памаату пірвінію пры правераных канцэнтрацыях. У асобным эксперыменце па знішчэнні клетак у часе выкарыстоўвалі 10 мікраграмаў на mL. Гэта ўзроўні лабараторнага ўздзеяння, а не дозы, і ў публікацыі яны пададзены менавіта так. Згаданае ў артыкуле пікавае значэнне ў плазме чалавека каля 3.9 мікраграма на mL прыводзіцца толькі як даведачны кантэкст. Агляд фармакакінетыкі метыленавага сіняга тлумачыць, чаму паказчык у плазме нельга лічыць паказчыкам у тканках.

У публікацыі выразна названыя два абмежаванні. Не было ні мадэлі біяплёнкі, ні выпрабаванняў камбінацый з метыленавым сінім. Пяцідзённыя агрэгаты былі скопішчамі ў стацыянарнай вадкай культуры, а не валідзіраваным эксперыментам з біяплёнкай. Аўтары заклікалі правесці даследаванні на жывёлах, вывучыць камбінацыі і біяплёнкі, а таксама правесці выпрабаванні на іншых відах Bartonella.

Камбінацыі і клеткі з біяплёнкі: Zheng і калегі, 2020

У наступным даследаванні 2020 года ў BMC Microbiology захавалі той самы штам і асяроддзе, але перайшлі да шасцідзённых стацыянарных культур і дадалі два элементы, якіх не было ў першай публікацыі: камбінацыі з двух прэпаратаў і мадэль клетак, атрыманых з біяплёнкі.

Пры выпрабаванні асобных прэпаратаў у аднолькавай канцэнтрацыі 5 мікраграмаў на mL на працягу 24 гадзін метыленавы сіні пакідаў 3.2 × 10 у 4-й ступені калонеўтваральных адзінак на mL у параўнанні з прыкладна 2.8 × 10 у 10-й ступені ў кантролі. Цыпрафлаксацын, гентаміцын і нітрафурантаін у той самы момант пакідалі менш калоній. Гэта адрозніваецца ад выніку 2019 года, калі пры тым самым намінальным узроўні праз адзін дзень калоній не выяўлялі. Узрост і шчыльнасць культур, а таксама спосабы працы з імі адрозніваліся, таму знішчэнне клетак паўтаралася як тэндэнцыя, але не было аднолькавым па велічыні. Такое адрозненне паміж эксперыментамі — адна з прычын, чаму пры стандартнай праверцы бяспекі і ўзаемадзеянняў лабараторную актыўнасць разглядаюць асобна ад клінічнага эфекту.

Скрынінг камбінацый — найбольш цытаваная частка. Канцэнтрацыю кожнага кампанента фіксавалі на ўзроўні 5 мікраграмаў на mL. Як азітраміцын з метыленавым сінім, так і рыфампіцын з метыленавым сінім праз 24 гадзіны не пакідалі выяўных калоній стацыянарнай фазы; тое самае назіралася для абедзвюх пар з цыпрафлаксацынам. Сярод 25 правераных пар такі вынік далі толькі гэтыя чатыры. Фармальнага аналізу сінергіі не праводзілі, таму правільна казаць пра актыўную камбінацыю ў гэтых умовах, а не пра даказаную сінергію.

У эксперыменце з біяплёнкай правяралі клеткі, атрыманыя з маладой разбуранай біяплёнкі, а не пранікненне ў непашкоджаную спелую біяплёнку. Культуры вырошчвалі пяць дзён, разводзілі і пераносілі ў планшэты з лункамі яшчэ на пяць дзён, пацвярджалі біяплёнку афарбоўваннем крышталічным фіялетавым, а затым саскрабалі яе перад уздзеяннем прэпаратаў. Пры 5 мікраграмах на mL метыленавы сіні асобна зніжаў колькасць да 2.3 × 10 у 2-й ступені да дня 6 — гэта быў адзін з найлепшых вынікаў сярод асобных прэпаратаў, але не нулявы. Абедзве камбінацыі з метыленавым сінім дасягнулі нуля да дня 6, як і абедзве камбінацыі з цыпрафлаксацынам.

Аўтары адзначылі тыя ж абмежаванні, якія заўважыў бы ўважлівы чытач: маладая саскрабаная біяплёнка замест старой непашкоджанай, адна зручная канцэнтрацыя для ўсіх прэпаратаў замест рэалістычнага пікавага ўзроўню кожнага, толькі выбраныя пары з азітраміцынам або рыфампіцынам, адзін штам, адсутнасць жывёл і пацыентаў. Далейшую працу з трыма прэпаратамі прапанавалі, але вынікаў не прадставілі.

Параўнанне дызайну даследаванняў

Табліца сцісла перадае галоўную думку гэтага артыкула. Усё злева ад апошняга слупка — гэта праца з культурамі. Нічога ў гэтых двух даследаваннях не адносіцца да апошняга слупка.

Bartonella — не Borrelia

У абедзвюх публікацыях згадваецца Borrelia burgdorferi, спірахета, якая выклікае хваробу Лайма, таму што аналіз з фарбавальнікамі паходзіць з ранейшых даследаванняў стацыянарнай фазы Borrelia ў той самай лабараторыі, дзе метыленавы сіні і даптаміцын таксама паказалі актыўнасць. Гэтая гісторыя — карысны кантэкст і частая крыніца памылак.

Ні ў адным эксперыменце ў гэтых публікацыях пра Bartonella не правяралі Borrelia паралельна з Bartonella. Арганізмы, асяроддзі і канцэнтрацыі адрозніваюцца, а меркаваны ўплыў метыленавага сіняга на мембрану Bartonella быў пададзены як гіпотэза, якая патрабуе далейшага вывучэння. Вынікі не варта пераносіць з аднаго віду на іншы, і ніводная публікацыя не падтрымлівае шырокіх сцвярджэнняў пра паразітаў. Менавіта таму ў параўнанні персістэрных клетак Borrelia і Bartonella гэтыя два масівы даследаванняў разглядаюцца асобна.

Чаму вынікі ў культурах не ператвараюцца ў пратакол

Цікавасць да пошуку пратаколу прымянення метыленавага сіняга пры Bartonella зразумелая. Гэтыя публікацыі паказваюць, чаму такую фразу варта ўспрымаць як папераджальны сігнал, а не як спіс пакупак.

Па-першае, 5 мікраграмаў на mL у лунцы — не прызначэнне. Гэты паказчык нічога не кажа пра ўсмоктванне, размеркаванне, звязванне з бялкамі, пранікненне ўнутр клетак або пераноснасць. Аўтары выбралі яго як прыблізнае сярэдняе пікавых канцэнтрацый антыбіётыкаў і адзначылі, што ў будучых даследаваннях варта выкарыстоўваць рэалістычны ўзровень кожнага прэпарату.

Па-другое, нуль калоній азначае адсутнасць калоній пры гэтых умовах пасеву, а не стэрыльнасць тканак. Персістэрныя клеткі, унутрыклетачныя бактэрыі і абмежаванні адбору проб застаюцца па-за межамі агаравай чашкі.

Па-трэцяе, камбінацыі, якія стэрылізуюць лунку, могуць не спрацаваць або нашкодзіць у арганізме. Азітраміцын з метыленавым сінім і рыфампіцын з метыленавым сінім — гэта лабараторныя пары пры лабараторных узроўнях уздзеяння. Без фармакакінетычных даследаванняў на жывёлах і кантраляваных даных для людзей няма ні вызначанай дозы, ні працягласці, ні суадносін карысці і рызыкі. Кожнаму, хто разглядае варыянты, варта абмеркаваць іх з лекарам і азнаёміцца з тым, калі прымяненне метыленавага сіняга патрабуе медыцынскага нагляду, перш чым рабіць якія-небудзь высновы з даных, атрыманых у чашцы.

Вузкая выснова, якую гэтыя публікацыі сапраўды падтрымліваюць, такая: метыленавы сіні мае ўзнаўляльную актыўнасць супраць B. henselae JK53 без росту in vitro, у тым ліку ў лабараторных камбінацыях з двух прэпаратаў; наймацнейшыя вынікі для камбінацый і клетак з біяплёнкі атрыманы ў даследаванні 2020 года. Усё астатняе, у тым ліку тое, ці мае гэтая актыўнасць значэнне для бартанелёзу ў людзей, застаецца неправераным.