Məqalə
Yeni metilen mavisi və retikulositlərin boyanması: fərqli boya və canlı hüceyrə üsulu
Bir tələbə retikulositləri saymağa hazırlaşır, metilen mavisi sifariş edir, onu qanla qarışdırır və demək olar ki, heç nə görmür. Onun tələbə yoldaşı üzərində yeni metilen mavisi yazılmış şüşədən istifadə edir və eritrositlərin bir qismində aydın mavi sapcıqlar görür. Birinci tələbə ikinci şüşədəki boyanın daha təzə və ya daha qatı olduğunu düşünür. Bunların heç biri doğru deyil. O şüşədə fərqli molekul var.
Bu sahədəki qarışıqlığın çoxunun kökündə məhz bu anlayış səhvi dayanır. Adı elə təsəvvür yaradır ki, yeni metilen mavisi metilen mavisinin təkmilləşdirilmiş partiyasıdır. Kimya isə bunun əksini göstərir. Yeni metilen mavisi N öz Colour Index nömrəsi, öz əvəzlənmə quruluşu və hematologiyada öz standartlaşdırılmış rolu olan ayrıca fenotiazin boyasıdır. Bu fərq aydın olduqda üsulun qalan hissəsini də anlamaq asanlaşır: boyanma zamanı hüceyrələrin niyə canlı qalmalı olduğu, hansı hüceyrənin retikulosit sayıldığı, Heinz cisimciklərinin bu prosesdə yeri və parlaq krezil mavisinin nə vaxt istifadə edildiyi.
Qısa cavab
Hematologiya reagenti olan yeni metilen mavisi N adətən PubChem-in yeni metilen mavisi qeydində Basic Blue 24 kimi göstərilir: C.I. 52030, CAS 1934-16-3, formula C18H22ClN3S. Adi metilen mavisi isə PubChem qeydində metiltioninium xlorid, Basic Blue 9 kimi göstərilir: C.I. 52015, CAS 61-73-4, formula C16H18ClN3S. Quruluş baxımından yeni metilen mavisində halqaya bağlı iki metil qrupu və etilamino yan zəncirləri var; metilen mavisində isə dimetilamino qrupları mövcuddur. Bu fərq boyanma xüsusiyyətlərini dəyişir. Hematologiya mətnlərində adi metilen mavisi retikulositləri nisbətən zəif boyayan, yeni metilen mavisi isə daha intensiv və daha bərabər boyayan maddə kimi təsvir edilir. Bu müqayisə ScienceDirect-in yeni metilen mavisi mövzusunda ümumiləşdirilib.
Bəli, yeni metilen mavisi supravital boyadır. NCBI-nin supravital boyanma prinsiplərinə dair icmalında verilən tərifə görə, supravital boyanma canlı hüceyrələrin bədəndən çıxarıldıqdan sonra və fiksasiyadan əvvəl boyanması deməkdir. Həm yeni metilen mavisi, həm də parlaq krezil mavisi bu kateqoriyaya aiddir və CLSI retikulosit standartında yeni metilen mavisi açıq şəkildə supravital boya kimi göstərilir. Tələbələr bəzən bunu fiksasiya edilmiş yaxmaların Romanovski üsulu ilə boyanması ilə eyni kateqoriyaya daxil edirlər. Burada belə yanaşma işləmir. Əvvəlcə fiksasiya etsəniz, üsul artıq işləməyəcək.
Oxşar boya adlarını araşdıran oxucular üçün metil mavisi ilə metilen mavisinin müqayisəsi anion triarilmetan boyası ilə kation fenotiazin ailəsi arasındakı fərqli və daha böyük qarışıqlığı izah edir. Laboratoriyada boyanma üsullarının icmalı supravital üsulları fiksasiya edilmiş yaxma üsulları ilə yanaşı təqdim edir, qan hüceyrələrinin morfologiyasına dair bələdçi isə retikulositlərin qiymətləndirilməsinin daha geniş diferensial qiymətləndirmədəki yerini göstərir.
| Reagent | Kimyəvi kimliyi | C.I. / CAS | Retikulositlərin öyrənilməsində rolu |
|---|---|---|---|
| Yeni metilen mavisi N | Etilamino qrupları olan, halqada iki metil qrupu daşıyan fenotiazin | C.I. 52030 (Basic Blue 24); xlorid üçün CAS 1934-16-3 | Standartlaşdırılmış əl üsulu ilə supravital boyanma üçün boya, üstünlük verilən müqayisə vasitəsi |
| Adi metilen mavisi | Bis(dimetilamino) fenotiazin (metiltioninium xlorid) | C.I. 52015 (Basic Blue 9); CAS 61-73-4 | Retikulositləri zəif boyayır, əvəzedici deyil |
| Parlaq krezil mavisi | Oksazin boyası, tərkibi təchizatçıdan asılı olaraq dəyişir | C.I. 51010; duz formasından asılı olaraq CAS 81029-05-2 və ya 10127-36-3 | Qəbul edilən supravital boya, daha az bərabər boyayır, harmonizasiya edilmiş müqayisə vasitəsi deyil |
Kataloqla bağlı bir xəbərdarlıq: yeni metilen mavisinin sink xloridlə ayrıca ikiqat duz forması CAS 6586-05-6 nömrəsi altında mövcuddur. Buna görə üsullar bölməsində yalnız ümumi ad deyil, duz forması və təchizatçı da göstərilməlidir.
Supravital boyanma əslində nə edir
Retikulosit nüvəsini itirmiş, lakin qalıq ribosomal RNT-ni saxlayan gənc eritrositdir. Boyanmamış yaş preparatda bu RNT görünmür. Supravital boya canlı hüceyrəyə daxil olur və həmin RNT-ni çökdürərək və ya aqreqasiya edərək mavi dənəciklərə və sapcıqlara çevirir. Yağ immersiyası altında görünən retikulosapcıqlı material məhz budur. Deməli, bu şəbəkə rənglənməyi gözləyən, əvvəlcədən mövcud skelet deyil, boyanma məhsuludur. Buna görə protokol dəyişənləri — boyanın konsentrasiyası, bufer, qan-boya nisbəti, temperatur və vaxt — boyanın adı qədər əhəmiyyətlidir.
Praktik nəticə əməliyyatların ciddi ardıcıllıqla aparılmasıdır: əvvəlcə antikoaqulyantlı qanı boya ilə qarışdırın, inkubasiya edin, sonra yaxmalar hazırlayın və onları fiksasiya etmədən, əlavə boya tətbiq etmədən müayinə edin. Boyanmadan əvvəl fiksasiya və ya zəif görünən sapcıqları örtən əlavə boya saymanın əsaslandığı məlumatı məhv edir.
Yeni metilen mavisi ilə işlək retikulosit protokolu
Vahid universal tərkib yoxdur, buna görə istifadə edilən tərkibi qeyd edin. Sənədləşdirilmiş üç variant mövcud diapazonu göstərir.
Klassik Brecher tipli prosedurda kalium oksalatla birlikdə təxminən 0.5 faiz yeni metilen mavisi istifadə edilir. Bu məhlul yaxşı qarışdırılmış EDTA-lı qanla bərabər həcmdə qarışdırılır və otaq temperaturunda təxminən 10–15 dəqiqə inkubasiya edilir. Ehtiyatla yenidən qarışdırıldıqdan sonra nazik pazşəkilli yaxmalar hazırlanır, havada qurudulur və fiksasiya edilmədən 100x yağ immersiyalı obyektiv altında müayinə edilir. NCBI-nin retikulositlərin sayılması proseduru bu iş ardıcıllığını və onunla istifadə edilən sayma çərçivəsini təsvir edir.
Dacie və Lewis variantında sitratlı fizioloji məhlulda 1.0 faiz yeni metilen mavisi istifadə edilir. Məhlul 2–4 həcm qanla qarışdırılır və yaxma hazırlanmazdan əvvəl 37 C temperaturda 15–20 dəqiqə saxlanılır. CLSI H44 prosedurunun harmonizasiyasına dair yaxın tarixli tətbiqdə pH 7.4 olan fosfat buferli fizioloji məhlulda daha aşağı konsentrasiyalı, 0.1 faiz məhlul istifadə edilib; inkubasiya 20 C temperaturda 10 dəqiqə aparılıb və fiksasiya edilməyib. Bu, 2026-cı il NMB harmonizasiya tədqiqatında bildirilib.
Sayma qaydaları bütün variantlarda eynidir. Hüceyrədə ən azı iki ayrı mavi boyanmış dənəcik və ya sapcıq seqmenti varsa, onu retikulosit kimi sayın; bu, tək boya çöküntüsünü saymadan kənarlaşdırır. Rutin işdə ən azı 1,000 eritrosit sayın və retikulositləri faizlə bildirin. Faiz aşağı olduqda statistik baxımdan daha çox hüceyrə saymaq tələb olunur. De Gruyter-dəki CLSI H44 icmalında qeyd edilir ki, retikulositlərin payı təxminən 1 faiz olduqda sayma variasiyasını 5 faizə endirmək üçün təxminən 4,400 hüceyrə lazımdır. Miller okulyar diski çoxsaylı hüceyrələrin sayılmasını praktik edir. Boyanı süzün və ya təzə hazırlayın, çünki çöküntü dənəvər daxilolmaları təqlid edir.
Eyni preparatda Heinz cisimcikləri
Eyni supravital yaxmada Heinz cisimcikləri də görünə bilər. Bunlar qalıq RNT deyil, oksidləşmiş və denaturasiya olunmuş hemoqlobinin aqreqatlarıdır. Yeni metilen mavisi preparatlarında onlar çox vaxt tək və membrana yaxın yerləşən, retikulosapcıqlı materialdan daha açıq mavi rəngə boyanan dairəvi cisimciklər kimi görünür. Fiksasiya və əlavə boyanma zamanı zəif qorunduqları üçün fiksasiya edilməmiş yaxmanı müayinə edin. Yaxın tarixli bir protokolda 20 mikrolitr EDTA-lı qan, 20 mikrolitr 1 faiz yeni metilen mavisi və 15 dəqiqə inkubasiya istifadə edilərək 250 eritrosit arasında Heinz cisimciyi olan hüceyrələrin sayı müəyyənləşdirilib. Bu prosedur PMC-dəki tədqiqatda təqdim olunub.
İki fərq yanlış şərhlərin qarşısını alır. Birincisi, ScienceDirect-in Heinz cisimciyi mövzusunda qeyd edildiyi kimi, metil bənövşəyisi və kristal bənövşəyisi Heinz cisimciklərini yeni metilen mavisindən daha intensiv boyayır. Yeni metilen mavisi retikulositlər və Heinz cisimcikləri birlikdə qiymətləndirildikdə əlverişli seçimdir, lakin Heinz cisimcikləri üçün ən güclü xüsusi boya deyil. İkincisi, alfa-talassemiya daşıyıcılığında HbH daxilolmaları supravital boyanmadan sonra hüceyrə boyunca çoxsaylı xırda nöqtələr əmələ gətirir, klassik Heinz cisimcikləri isə daha az sayda, daha iri və çox vaxt membranla əlaqəli olur. Üçüncü oxşar görüntü boya çöküntüsüdür: o, hüceyrələrin fokus müstəvisindən kənarda yerləşir və görünüş sahələri arasında dəyişir.
Parlaq krezil mavisi ilə yeni metilen mavisinin müqayisəsi
Hər iki boya retikulositlər üçün supravital boyadır, lakin standartlaşdırma onlardan birinə üstünlük verir. Hematologiyada Standartlaşdırma üzrə Beynəlxalq Şura ilə birgə hazırlanmış və CLSI H44 standartının səhifəsində göstərilən CLSI H44-A2 retikulosit üsulu EDTA-lı qanın yeni metilen mavisi ilə boyanmasını əl üsulu ilə müqayisə metodu kimi müəyyən edir. Klassik hematologiya tədrisi görünüş baxımından da bunu təsdiqləyir: yeni metilen mavisi sapcıqları daha intensiv və daha bərabər boyayır, parlaq krezil mavisi isə partiyalar və nümunələr arasında daha çox dəyişkənlik göstərir.
Bu status müəyyən qeydlə təqdim edilməlidir. ICSH-nin analizatorların qiymətləndirilməsi üzrə təlimatı yeni metilen mavisi ilə əl üsulu ilə aparılan mikroskopiyanı referens müqayisə yanaşması kimi qəbul edir, lakin onu subyektiv və nisbətən qeyri-dəqiq adlandırır; mövcud olduqda axın sitometriyasına əsaslanan referens prosedurlara üstünlük verilir. 2022-ci ildə 100 nümunənin müqayisəsində istifadə edilən analizatora nisbətən sistematik kənarlaşmanın parlaq krezil mavisində yeni metilen mavisinə nisbətən daha aşağı olduğu müəyyən edilib. Bu nəticə PMC-dəki boyanma üsullarının müqayisəsində bildirilib. Tələbələr üçün əsaslandırılmış yekun belədir: yeni metilen mavisindən standartlaşdırılmış əl üsulu ilə müqayisə vasitəsi kimi istifadə edin, istənilən yerli parlaq krezil mavisi üsulunu onunla və ya avtomatlaşdırılmış üsulla müqayisə edərək yoxlayın və hər iki halda əl üsulu ilə mikroskopiyada daha geniş nəticə səpələnməsi gözləyin. Əvvəlki standartlaşdırma ədəbiyyatında kommersiya boya partiyaları fərqləndiyi üçün təmizlənmiş Azure B kimyəvi baxımdan daha təmiz alternativ kimi də tövsiyə olunurdu. Bu, Marshall-ın Azure B haqqında tədqiqatında qeyd edilir və reagentin təmizlik dərəcəsinin üsullarla bağlı müzakirələrdə niyə hələ də yer aldığını izah edir.
Tipik səhvlərdən yayınmaq
Uğursuz preparatların çoxunun səbəbi dörd səhvdir. Yeni metilen mavisi N əvəzinə adi metilen mavisinin sifariş edilməsi texnikaya görə deyil, kimyəvi xüsusiyyətlərə görə zəif boyanma yaradır. Müayinədən əvvəl fiksasiya və ya əlavə boyanma supravital siqnalı aradan qaldırır. Boya çöküntüsünün dənəcik kimi sayılması nəticəni artırır; iki dənəcik qaydası və süzülmüş boya bunun qarşısını alır. Retikulosit faizi aşağı olduqda çox az hüceyrənin sayılması dəqiq görünən, lakin etibarlılıq sərhədləri geniş olan rəqəm verir. Bütün bu səhvlərin ortaq əlaməti eynidir: mikroskopist reagent mərhələsində müəyyənləşmiş nəticəyə görə mikroskopu günahlandırır.