Yanaq hüceyrələrinin metilen mavisi ilə boyanması: nəyi müşahidə etməli

Şagird əşya şüşəsinə bir damcı yanaq hüceyrəsi suspenziyası qoyur, mikroskopa baxır və demək olar ki, heç nə görmür. İşıqlı görüntü sahəsində bir neçə solğun kölgə süzülür. O, fokusu tənzimləyir, sonra işığı artırır və nəhayət, preparatın boş olduğu qənaətinə gəlir. Preparat boş deyil. Hüceyrələr oradadır. Onlar demək olar ki, şəffafdır və bu boyamanın həll etməli olduğu əsas problem məhz şəffaflıqdır.

Gözlənti ilə görüntü arasındakı bu uyğunsuzluğu protokola başlamazdan əvvəl izah etmək faydalıdır. Yeni başlayanlar mikroskopun, kameranın böyütməsi uzaqdakı lövhəni göstərdiyi kimi, detalları üzə çıxarmasını gözləyirlər. İşıqlı sahə mikroskopu daha məhdud bir iş görür: işığın udulmasındakı fərqləri göstərir. Boyanmamış yanaq hüceyrəsi demək olar ki, işıq udmur, buna görə də görüntüdə demək olar ki, fərq yaratmır. Metilen mavisi bu fərqi yaradır. Hüceyrənin daxilində qeyri-bərabər şəkildə bağlanır və quruluşu kontrasta çevirir. Şagirdlər bu anlayışı mənimsədikdən sonra bütün sonrakı addımlar sadəcə təlimat deyil, onun məntiqi nəticəsi kimi görünür.

Məktəb laboratoriyasında sadə boyamaların kontrastı necə artırdığı barədə ilkin məlumat burada kömək edir, boyamadan əvvəl işıqlı sahə mikroskopunun qurulmasının təkrarlanması isə uğursuz preparatların yarısının qarşısını alır. Rəngin kimyəvi əsasları mikroskopiyada metilen mavisinə girişdə izah olunur; burada məhz bu boyanın laboratoriya masasında niyə tez-tez istifadə edildiyi də açıqlanır.

Sinif protokolu

Aşağıdakı yaş preparat variantı ümumi dərslər üçün daha sadə standart seçimdir. Nə alov, nə də fiksasiya mərhələsi tələb edir. Bəzi ali məktəb təlimatlarında istifadə olunan fiksasiya edilmiş yaxma variantında havada qurutma və qısa istiliklə fiksasiya mərhələləri əlavə olunur. Buna Biology LibreTexts vasitəsilə dərc edilmiş North Central Texas College yanaq yaxması məşğələsində rast gəlinir, lakin istiliklə fiksasiya mikrobiologiyada yayılmış bir üsuldur, epitel hüceyrələrini görmək üçün tələb deyil.

Lazım olanlar: təmiz əşya və örtük şüşələri, steril birdəfəlik yaxma çubuqları (üstünlük verilir) və ya yeni yastı diş çöpləri, damcılı flakonda 0.5 ilə 1 faiz arasında metilen mavisinin sulu məhlulu, distillə edilmiş və ya deionlaşdırılmış su, hopdurucu kağız, əlcəklər və ümumi böyütməsi 100x və 400x olan mürəkkəb mikroskop.

1. Ağzınızı adi su ilə yaxalayın. Bu, sonradan güclü boyanan və diqqəti hüceyrələrdən yayındıran qida hissəciklərini uzaqlaşdırır.
2. Hər şagird yalnız öz yanağından nümunə götürür. Yeni steril yaxma çubuğu ilə yanağın iç səthini yüngülcə sürtün. Təzyiq göstərin, qaşımayın. Narahatlıq və ya qanama yaranmasına imkan vermədən dayanın.
3. Çubuğu təmiz əşya şüşəsinin mərkəzi boyunca yuvarlayaraq nazik qat yayın. Nazik qat aydın müşahidə edilə bilən preparat əldə etməyin ən mühüm şərtidir. Qalın ağ çöküntü boyandıqda ayırd edilə bilməyən mavi kütləyə çevriləcək.
4. Yaxmanın üzərinə bir damcı metilen mavisi əlavə edin. 1 ilə 3 dəqiqə arasında saxlayın. Bir çox ali məktəb protokolunda bir dəqiqə kifayət edir; NCERT-in IX sinif təbiət elmləri laboratoriya təlimatında müvəqqəti preparat üçün təxminən 3 dəqiqə nəzərdə tutulur. Daha uzun müddət daha yaxşı nəticə demək deyil və həddindən artıq boyanma vaxtla bağlı ən çox rast gəlinən səhvdir.
5. Yerli protokola uyğun olaraq distillə edilmiş su ilə yüngülcə yaxalayın və ya artıq boyanı hopdurucu kağızla çəkin. Fon tünd göy deyil, açıq mavi olmalıdır.
6. Örtük şüşəsini bucaq altında endirin ki, əvvəlcə bir kənarı toxunsun, sonra isə onu yavaşca aşağı buraxın. Bu, hava qabarcıqlarının yaranmasının qarşısını alır.
7. Hüceyrələri tapmaq üçün aşağı böyütmədən başlayın, fokusun və mərkəzləşdirmənin düzgünlüyünü yoxlayın, sonra 100x və nəhayət 400x böyütməyə keçin. 400x böyütmədə yalnız incə fokus tənzimləyicisindən istifadə edin.

Boyanın konsentrasiyasını bir cümlə ilə dəqiqləşdirmək lazımdır. Məktəb protokollarında adətən metilen mavisinin 1 faizli sulu məhlulu istifadə olunur. Daha yüksək konsentrasiyalı məhlul və ya uzun müddət təsir fonu nüvədən daha sürətlə tündləşdirir və bununla da məşğələnin əsaslandığı kontrastı tərsinə çevirir.

Yanaq materialı ilə təhlükəsiz davranış

Yanaq nümunələri tüpürcək və ağız boşluğunun normal mikroorqanizmlərini də daşıyır. Buna görə nümunə verənlər sağlam sinif yoldaşları olsa belə, hər təzə yaxmaya potensial yoluxucu material kimi yanaşın. Amerika Mikrobiologiya Cəmiyyətinin tədris laboratoriyaları üçün biotəhlükəsizlik qaydaları ümumi prinsipləri müəyyən edir: məşğələdən əvvəl riski qiymətləndirin, əlcək geyinin, sıçrama ehtimalı olan hallarda gözləri qoruyun, sonra əlləri yuyun, laboratoriya masalarını dezinfeksiya edin və çirklənmiş birdəfəlik əşyaları təsdiqlənmiş bioloji tullantı qaydalarına uyğun atın.

Sinifdə tətbiq olunan dörd qayda risklərin əksəriyyətini əhatə edir. Hər yaxma çubuğu və hər əşya şüşəsi yalnız bir nümunə verənə aid olmalı, heç vaxt paylaşılmamalıdır. Hər kəs yalnız özündən nümunə götürməlidir, yanındakı şəxsdən yox. Birdəfəlik yaxma çubuqları və diş çöpləri birbaşa təyin olunmuş tullantı qabına atılmalı, heç vaxt yenidən masaya qoyulmamalıdır. Metilen mavisinin özü dərini və geyimi boyayır, gözləri qıcıqlandırır; buna görə əlcək və boyalarla işləməyə aid adi gigiyena qaydaları tətbiq olunur. Bu məşğələni yaxmadan hər hansı mikroorqanizm kulturasının yetişdirilməsinə qədər genişləndirməyin və məktəbin təhlükəsizlik prosedurundan kənar təzə insan materialını özbaşına istiliklə fiksasiya etməyin.

Nəyi müşahidə etməli və niyə belə görünür

100x böyütmədə konturları qeyri-müntəzəm oval və ya çoxbucaqlı olan geniş, yastı, açıq mavi hüceyrələri axtarın. Onlar tək-tək və ya bir-birinin üzərinə düşən seyrək təbəqələr şəklində yerləşir. Hər hüceyrədə adətən bir tünd mavi ləkə olur. Bu ləkə nüvədir. Düzülüşə də diqqət yetirin: yastı epitel hüceyrələri kürə deyil, nazik plitələr kimidir. Buna görə onların kənarları yumru şarlardan çox çatlamış şir qatına bənzəyir.

400x böyütmədə üç xüsusiyyət aydın seçilir. Hüceyrənin sərhədi onu əhatə edən nazik, daha tünd xətt kimi görünür. Sitoplazma daxili sahəni açıq, bərabər mavi rənglə doldurur. Nüvə daha tünd və yığcamdır, çox vaxt oval olur, adətən mərkəzə yaxın yerləşir, lakin həmişə belə deyil. Şagirdlərdən hər üçünü, eləcə də formanı və böyütməni qeyd etmələrini istəyin, çünki iş vərəqində məhz bunlar tələb olunur.

Burada dəqiqlik baxımından vacib bir məqam var və bir çox iş vərəqində bu səhv təqdim olunur. Görünən sərhəd plazma membranının yerləşdiyi sahəyə uyğun gəlir, lakin membranın özü — qalınlığı təxminən 7 ilə 10 nanometr arasında olan ikiqat lipid təbəqəsi — məktəb mikroskopunun ayırdetmə imkanından çox aşağıdadır. Şagirdlərin gördüyü hüceyrənin optik kənarı və orada toplanmış boyadır. Eyni məhdudiyyət orqanoidlərə də aiddir. Bu preparatda mitoxondrilər, endoplazmatik retikulum, Holci cisimcikləri və ribosomlar görünmür. NCBI-nin mikroskopiya vasitələri haqqında hüceyrə biologiyasına dair məlumatında izah edildiyi kimi, adi işıq mikroskopunun yaxşı şəraitdə ayırdetmə həddi təxminən 0.2 mikrometrdir və ultrastrukturun əksər elementləri bu həddən aşağıda və ya ona yaxın ölçüdədir. Daha yüksək boş böyütmə detal əlavə etmədən görüntünü böyüdür.

Nüvə niyə ən tünd boyanır? Metilen mavisi məhlulda müsbət yüklü olan kation boyasıdır və hüceyrədəki mənfi yüklü materialla, ilk növbədə nuklein turşuları ilə əlaqələnir. Xromatin DNT-ni nüvədə cəmləşdirir, buna görə də ən çox boya nüvədə toplanır. Sitoplazmada RNT və digər yüklü molekullar var, buna görə o da boyanır, lakin daha yayğın və daha açıq şəkildə. Əsas qeyd budur: metilen mavisi DNT-yə spesifik boya deyil. Nüvənin görüntülənməsində metilen mavisinin paylanması haqqında tədqiqatda kationun nuklein turşuları ilə zəngin sahələrlə əlaqələnməsi təsvir olunur, hüceyrə preparatlarında metilen mavisinin bağlanmasına dair daha əvvəlki kəmiyyət tədqiqatında isə bağlanmış boyanın əksər hissəsinin nuklein turşuları ilə əlaqəli olduğu müəyyən edilib. Buna görə tünd nüvə və açıq sitoplazma molekulyar analiz deyil, kontrast mənzərəsidir.

Şagirdlərin edəcəyi səhvlər və onları necə şərh etməli

Uğursuz preparatların demək olar ki, hamısı beş vəziyyətdən birinə uyğun gəlir. Şagirdlərə preparatı kor-koranə təkrarlamaq əvəzinə problemin səbəbini müəyyən etməyi öyrədin.

Həddindən artıq boyanma hüceyrələri və fonu eyni dərəcədə tündləşdirir, nəticədə nüvə görüntü sahəsində seçilmir. Bunu daha qısa boyama müddəti və ya daha yaxşı yaxalama ilə düzəldin. Yetərsiz boyanma işıq artırıldıqda itən solğun kölgələr yaradır; müddəti otuz saniyəlik addımlarla artırın. Qalın yaxmalar heç bir konturun izlənə bilmədiyi sıx, üst-üstə düşən kütlələr yaradır; düzəliş mexaniki xarakterlidir: növbəti dəfə daha nazik yayın, çünki heç bir yaxalama hüceyrə yığınını xilas etmir. Hava qabarcıqları kəskin tünd kənarlı mükəmməl dairələr kimi görünür və onları hüceyrə quruluşları ilə səhv salan yeni başlayanların diqqətini yayındırır; örtük şüşəsini yenidən, bucaq altında yavaşca yerləşdirin. Hüceyrələrin üzərində və ya ətrafında səpələnmiş xırda tünd nöqtələr, Ingrid Science-ın yanaq hüceyrəsi proseduru kimi məktəb protokollarında qeyd olunduğu kimi, adətən ağız boşluğunun normal bakteriyalarıdır. Onlar ağızda mikroorqanizmlərin yaşadığını göstərir və bu, şagirdlər üçün yaddaqalan ola bilər. Lakin bu məşğələdə onların növünü müəyyən etmək mümkün deyil və onları hüceyrənin hissələri kimi çəkmək olmaz. Qida qalıqları və selik telləri qeyri-bərabər və güclü boyanır; ilkin yaxalama onları azaltmaq üçündür.

Bu məşğələnin imkanları nələri əhatə etmir

Bu, diaqnostik test deyil, tədris məqsədli müşahidədir. Sinifdə boyanmış hüceyrələrin görünüşünə əsasən infeksiya, xərçəng və ya hər hansı xəstəliyə diaqnoz qoymaq mümkün deyil və məqalə bunun əksini nəzərdə tutan mətn kimi qəbul edilməməlidir. Preparat iki böyütmə səviyyəsində formanı, sərhədi, sitoplazmanı və nüvəni göstərir. O, membranın ultrastrukturunu, orqanoidlərin detallarını və ya molekulyar kimliyi göstərmir. Məhdudiyyəti açıq şəkildə bildirmək həm elmi, həm də şagirdləri qoruyur: yaxşı nəticə sağlamlıq haqqında qənaət deyil, böyütməsi və istifadə edilmiş boyası qeyd olunan, düzgün işarələnmiş rəsmdir.

Şagird iş vərəqi və işarələnmiş mikroqrafiyalar

Bu səhifə üçün layihənin iki materialı yuxarıdakı işarələnmiş mikroqrafiya və aşağıdakı iş vərəqidir. Hər şagird üçün bir iş vərəqi çap edin və ya onu ekrana verərək şagirdlərdən xanaları dəftərlərinə köçürmələrini istəyin.

45 dəqiqəlik məşğələdə istifadə qaydası: təhlükəsizlik təlimatı və nümunə götürmə üçün on dəqiqə, boyama və preparatın hazırlanması üçün on dəqiqə, hər iki böyütmədə müşahidə və eskiz çəkmək üçün on beş dəqiqə, yoxlama siyahısı və işarələnmiş mikroqrafiya ilə müqayisə üçün on dəqiqə. Yoxlama siyahısının bəndləri bilərəkdən sadə və konkret seçilib. Nazik yaxma, düzgün boyama müddəti, sitoplazmadan daha tünd nüvə, qeyd olunmuş böyütmə. Dördünü də təsdiqləyə bilən şagird dərsin öyrətməli olduğu anlayışı mənimsəyib: mikroskoplar fərqləri göstərir, boyalar isə göstərilməyə dəyər fərqləri yaradır.