Məqalə
Metilen mavisinin antimikrob tədqiqatları: bakteriyalar, göbələklər və işıqla aktivləşdirmə
İki oxucu metilen mavisinin antimikrob təsiri ifadəsini görəndə fərqli şeylər təsəvvür edir. Biri təmasda mikrobları zəhərləyən mavi mayeni düşünür. Digəri boyanın qırmızı işıqla birlikdə onları məhv etdiyi proseduru təsəvvür edir. Hər iki təsəvvürdə müəyyən həqiqət var. Heç biri tam mənzərəni əks etdirmir və internetdəki iddiaların əksəriyyəti məhz bunları bir-birinə qarışdıranda yanlış olur.
Bu icmalın mövzusu həmin fərqdir. Metilen mavisi kifayət qədər yüksək konsentrasiyada qaranlıqda mülayim toksiklik göstərir. Qırmızı işıqla isə fotosensibilizatora çevrilir: fotonu udur, reaktiv triplet vəziyyətinə keçir və eyni anda çoxsaylı hədəfləri zədələyən oksidləşdirici kimyəvi prosesləri başladır. İşıqla aktivləşən bu rejimin ayrıca adı — antimikrob fotodinamik terapiya — və öz şərtləri var. Onu təkcə konsentrasiya müəyyən etmir. Nəticəni dalğa uzunluğu, işıq dozası, inkubasiya, oksigen və orqanizm müəyyənləşdirir.
Mikrobları öldürməyin iki konsepsiyası
Əvvəlcə qaranlıqdakı təsir konsepsiyasını nəzərdən keçirək. Metilen mavisi müsbət yüklü fenotiazin boya maddəsidir. O, mikrobların örtükləri ilə əlaqəyə girir, hüceyrələrə müxtəlif dərəcədə daxil olur və oksidləşmə-reduksiya, eləcə də bağlanma proseslərində iştirak edir. Burada fotonlar iştirak etmir. Öldürmə baş verir, lakin yalnız orqanizmdən asılı olaraq çox fərqlənən konsentrasiyalarda və mexanizm tək bir dəqiq hədəflə məhdudlaşmır.
Fotodinamik konsepsiya buna işığı əlavə edir. Təxminən 630 ilə 680 nm aralığındakı qırmızı fotonlar boyanın udulma zolağı ilə üst-üstə düşür; monomerin udulma zirvəsi təxminən 664 nm-dədir. Udulma boyanı qısaömürlü singlet vəziyyətinə, sonra isə daha uzunömürlü triplet vəziyyətinə keçirir. Bundan sonra iki reaksiya qrupu yaranır. I tip kimyəvi prosesdə triplet substrata elektron ötürür və superoksid və hidroksil növlərini əhatə edən radikal reaksiya yollarını başladır. II tip kimyəvi prosesdə isə enerjini birbaşa əsas vəziyyətdəki oksigenə ötürərək singlet oksigen yaradır. Hər ikisi eyni vaxtda baş verə bilər və boyanı sırf singlet oksigen yaradan vasitə adlandırmaq həddindən artıq sadələşdirmədir. Fenotiazin fotosensibilizatorlarının struktur–aktivlik əlaqəsinə dair icmal bunu birbaşa göstərir: oxşar boyalar arasında bakterial fototoksiklik yalnız singlet oksigenin çıxımından asılı deyildi, çünki hüceyrəyə daxilolma, lokalizasiya və qeyri-aktiv leyko formaya reduksiya fotofizika qədər əhəmiyyətli idi. Dalğa uzunluğu qaydasının arxasındakı fotokimya boya ilə qırmızı işığın birgə təsirinə dair əlaqəli icmalda izah olunur.
Singlet oksigen faydalı xüsusiyyətlərdən birinin əsasını təşkil edir. O, eyni anda çoxsaylı biomolekullarla reaksiyaya girir, buna görə təsir tək bir fermentə və ya bağlayıcı zülala yönəlmək əvəzinə çoxamilli olur. Fotodinamik antimikrob kimyaterapiyanın əsaslarını təsvir edən məqalədə ənənəvi müqavimət profillərinin az əhəmiyyət daşımasının səbəbi belə izah edilirdi: əlavə penisillin bağlayan zülal və ya mutasiyaya uğramış topoizomeraza reaktiv oksigenin qəfil yaranmasını əngəlləmir. Aşağıdakı cədvəldə göstərildiyi kimi, bu məntiq metisillinə davamlı Staphylococcus aureus və vankomisinə davamlı enterokoklar üzərində sınaqlarda özünü doğrultdu. Bu, müqavimətin mümkünsüz olduğu deyil, sadəcə fərqli işlədiyi deməkdir. Efflüks nasosları və antioksidant müdafiə mexanizmləri, xüsusən göbələklərdə, tələb olunan dozanı yenə də dəyişə bilər.
Orqanizm və tədqiqat modeli üzrə cədvəl
Bu cədvəl məqalənin əsas məlumat mənbəyidir. Hər bir göstərici konkret protokola aiddir: eyni boya, fərqli işıq dozası və ya inkubasiya — fərqli nəticə. MBC, MLC və MIC-ni bir-birinin əvəzi kimi qəbul etməyin. Burada MBC və MLC təkrar əkmədə sağ qalanların olmamasını, MIC isə böyümənin inhibə edilməsini bildirir. Hər sətirdə işıqlandırma şərtləri göstərilib.
| Orqanizm və model | Qaranlıqdakı nəticə | İşıqdakı nəticə | Şərtlər |
|---|---|---|---|
| S. aureus NCTC 6571, planktonik suspenziya | MBC 5 uM | MBC 5 uM | İcmal cədvəli, ağ işıq 12 J per cm2 |
| S. aureus NCTC 6571, planktonik suspenziya | MLC 2.5 uM | MLC 1 uM | 1997-ci ilin ilkin tədqiqat protokolu, 1 saat ərzində 1.7 mW per cm2, təxminən 6.3 J per cm2, inokulum təxminən 10^6 CFU per mL; fenotiazinlərin fotobakterisid təsirinə dair ilkin tədqiqatda bildirilib |
| MRSA EMRSA-15, planktonik | MBC 80 uM | MBC 20 uM | İcmal cədvəli, təxminən 12 J per cm2, həssaslığın dördqat artması |
| MRSA EMRSA-16, planktonik | MBC 40 uM | MBC 10 uM | Yuxarıdakı ilə eyni protokol |
| E. coli NCTC 9001, planktonik | MBC 500 uM | MBC 100 uM | Eyni protokol, həssaslığın beşqat artması |
| P. aeruginosa NCTC 10622, planktonik | MBC 500 uM | MBC 25 uM | Eyni protokol, həssaslığın iyirmiqat artması |
| E. faecalis NCTC 775, planktonik | MLC 100 uM | MLC 100 uM | 6.3 J per cm2 ilə 1997-ci il protokolu, bu ştam və doza üçün yaxşılaşma yoxdur |
| Vankomisinə davamlı E. faecium, planktonik | MBC 400 uM | MBC 400 uM | İcmal cədvəli, ilkin boya ilə yaxşılaşma yoxdur, lakin daha hidrofob metilləşdirilmiş törəmələr yaxşılaşma göstərib; vankomisinə davamlı enterokok tədqiqatına əsasən |
| Candida albicans, planktonik | MIC 12.79 ug per mL-dən yuxarı | 5, 10 və 15 J per cm2-də MIC müvafiq olaraq 12.79, 6.39 və 1.59 ug per mL | Qaranlıqda 30 dəqiqəlik ilkin inkubasiya, zirvəsi 635 nm olan 600 ilə 650 nm aralığında qırmızı LED; metilen mavisinin göbələk əleyhinə fotodinamik təsirinin doza–cavab tədqiqatına əsasən |
| C. albicans YEM14 ilə efflüks nasoslarını həddindən artıq ifadə edən variantın müqayisəsi, CFU üzrə öldürmə | Tətbiq edilmir | İlkin ştamda təxminən 5 log öldürmə, CDR1/CDR2-ni həddindən artıq ifadə edən variantda sıfıra yaxın öldürmə | 100 uM boya, 30 dəqiqəlik inkubasiya, 60 J per cm2 ilə 660 nm; efflüks nasoslarının metilen mavisi ilə fotoöldürməyə təsirinə dair tədqiqata əsasən |
| Trichophyton rubrum hifləri ilə sporlarının müqayisəsi | Tətbiq edilmir | Hiflərdə MIC təxminən 6.3 ug per mL, sporlarda təxminən 2.0 ug per mL; CFU-nun tam qarşısını almaq üçün hiflərə 5 ug per mL və 100 J per cm2, sporlara isə 1.25 ug per mL və 40 J per cm2 tələb olunub | 635 nm fotodinamik protokol; dermatofitlərin inkişaf mərhələlərinə görə həssaslıq tədqiqatına əsasən |
| 33 növdən ibarət yetkin dişəti altı biofilm, Calgary qurğusu, 6-cı gün | Təkcə MB ilə ümumi sayda 80 faizdən çox azalma | MB və 660 nm LED ilə metabolik aktivlikdə təxminən 55 faiz azalma, mikrob birliyinin strukturunda genişmiqyaslı dəyişiklik yoxdur | 0.01 faiz boya (100 ug per mL), 5 dəqiqə ərzində təxminən 330 mW per cm2 ilə 660 nm, anaerob böyümə; çoxnövlü ağız biofilminin in vitro tədqiqatına əsasən |
Üç qanunauyğunluq nəzərə çarpır. Birincisi, qram-müsbət stafilokoklar aşağı mikromolyar konsentrasiyalarda ölür, qram-mənfi çöpşəkilli bakteriyalar isə qaranlıqda təxminən yüz dəfə çox boya tələb edir, çünki qram-mənfilərin xarici membranı daxilolmanı məhdudlaşdırır. İşıq bu fərqi azaldır, lakin aradan qaldırmır. İkincisi, metilen mavisinin göbələk əleyhinə təsiri realdır, amma şərtlərdən asılıdır: Candida-nın metilen mavisi ilə öldürülməsi işıq dozası artdıqca kəskin güclənir və efflüks nasoslarının həddindən artıq ifadəsi kimi tək bir fenotip dəyişikliyi eyni dozada 5 log öldürməni aradan qaldıra bilər. Üçüncüsü, yetkin biofilm suspenziyalardan fərqli davranır və ağız biofilmi sətri məhz bu kontekstdə qiymətləndirilməlidir.
Bakteriyalar: işıq harada ən çox kömək edir, harada isə etmir
Stafilokoklar həssas nümunədir. İşıq tətbiq edildikdə, hətta epidemik MRSA üçün icmal cədvəlindəki göstəricilər də müqayisə üçün götürülən vankomisin göstəricisindən yüksək deyil; dimetilləşdirilmiş törəmələr isə daha yaxşı nəticə verib, çünki metilləşmə lipofilliyi və singlet oksigenin çıxımını artırmaqla yanaşı, leyko formaya reduksiyaya qarşı davamlılığı yüksəldib. Bu kimyəvi təfərrüat vacibdir: o göstərir ki, öldürmə təkcə fotofizikanın deyil, maddənin hədəfə çatdırılması ilə fotofizikanın birgə nəticəsidir.
Qram-mənfi orqanizmlər hədəfə çatdırılma tərəfini nümayiş etdirir. Pseudomonas üçün qaranlıqda 500 uM, işıqda isə 25 uM tələb olunub — iyirmiqat yaxşılaşma. Bununla belə, işıqdakı göstərici stafilokoklar üçün diapazondan hələ də xeyli yüksəkdir. Kation yükü boyanın xarici membrana yaxınlaşmasına kömək edir, lakin nüfuzetmə məhdudlaşdırıcı amil olaraq qalır. Formulyasiya, inkubasiya müddəti və törəmənin seçimi bu göstəriciləri eyni boyanı daha yüksək dozada təkrar tətbiq etməkdən daha çox dəyişir.
Enterokoklar ehtiyatlı yanaşmanın vacibliyini göstərir. Köhnə protokollarda E. faecalis işıqdan heç bir üstünlük əldə etməyib, vankomisinə davamlı E. faecium üçün isə daha çox işıq deyil, başqa molekul lazım olub. Metilen mavisinin tək bir MBC göstəricisini ümumi antibakterial sabit kimi təqdim edən şəxs ədəbiyyatı yanlış şərh edir. Belə bir sabit yoxdur. Yalnız ştama, mühitə, inokuluma, inkubasiyaya, dalğa uzunluğuna və flüensə xas göstəricilər var. Bu göstəriciləri özünüzü aldatmadan necə oxumaq öldürmə əyrilərinin şərhi üzrə təlimatda izah olunur.
Göbələklər: həssasdırlar, lakin mərhələ və nasoslar həlledicidir
Qlükanlardan, mannanlardan və xitindən ibarət göbələk hüceyrə divarları bakteriyalardakından fərqli daxilolma problemi yaradır; göbələklərdə əlavə olaraq aktiv müdafiə mexanizmləri də var. Yuxarıdakı Candida efflüks nəticəsi ən bariz nümunədir: eyni boya, eyni işıq, eyni mühit, lakin həddindən artıq ifadə edən variant sağ qalıb, ilkin ştam isə koloniya əmələ gətirən vahidlərinin təxminən 99.999 faizini itirib. Dermatofitlərdə inkişaf mərhələsi də əlavə amildir. Sporlar hiflərdən xeyli asan ölür, buna görə sporları aradan qaldıran protokol eyni dozada hif fraqmentlərini canlı saxlaya bilər.
Məhz buna görə metilen mavisinin göbələk əleyhinə təsirinə dair hesabatlarda da bakterial tədqiqatlardakı kimi işıq parametrlərinə ciddi yanaşmaq lazımdır. Dırnaq və dəri üzrə klinik fotodinamik tədqiqatlarda 1 ilə 2 faiz boya ölçülmüş qırmızı işıqla, müəyyən edilmiş flüenslərlə və sonrakı müşahidə ilə birləşdirilib, klinik görünüş isə mikoloji təmizlənmədən ayrıca qiymətləndirilib. Bu sınaqlar dırnaq və dərinin göbələk xəstəliklərində fotodinamik təsirə dair sübutların xülasəsində nəzərdən keçirilir. Otaq işığında zədələnmiş sahəyə durulaşdırılmış boya çəkmək rəngi təkrarlayır, lakin proseduru yox.
Biofilm sınağı: 33 növdən ibarət ağız modeli
2024-cü ilin çoxnövlü ağız biofilmi tədqiqatı diqqətə layiqdir, çünki asan vəziyyəti deyil, çətin olanı sınaqdan keçirir. Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium və ağız streptokokları daxil olmaqla otuz üç ağız mikroorqanizmi növü anaerob şəraitdə böyüyərək 6-cı gündə yetkin biofilm əmələ gətirib. Tətbiq yüksək şüalanma intensivliyində 5 dəqiqə ərzində 660 nm LED ilə 0.01 faiz boyadan ibarət olub. Həm təkcə boya, həm də təkcə işıq ümumi sayı xeyli azaldıb, onların birləşməsi isə metabolik aktivliyi təxminən yarıya endirib. Bununla belə, mikrob birliyinin strukturu dəyişməyib və biofilm sterilizə olunmayıb.
Bu, sərhədi açıq göstərilən real təsirdir. Nəticə fotodinamik müdaxiləni təmizlənmiş dişəti cibində yerli köməkçi üsul kimi dəstəkləyir, diaqnoz qoyulmuş periodontiti təkbaşına müalicə edən yaxalama vasitəsi kimi yox. Bu da bizi ümumi fərqə gətirir.
Laboratoriyada öldürmə niyə müalicə demək deyil
Planktonik MBC sınağında eynicinsli hüceyrələr oksigenlə təmin olunmuş mühitdə eyni dərəcədə boya və işıq təsirinə məruz qalır. Zədələnmiş sahə bu şərtlərin heç birini təmin etmir. Matriks daxilolmanı ləngidir, persisterə bənzər vəziyyətlər oksidləşməyə dözür, qan və ekssudat işığı udur, toxumanın həndəsi quruluşu kölgəli sahələr yaradır, hipoksik ciblər isə II tip kimyəvi prosesləri zəiflədir, çünki singlet oksigenin yaranması tərifinə görə molekulyar oksigen tələb edir. Qarışıq infeksiyalar daxilolma və həssaslıq baxımından fərqlənən növlər əlavə edir, buna görə bir istinad ştamının göstəricisi bütün sahəni təmsil edə bilməz.
Ağız nümunəsi bu fərqi konkretləşdirir. Laboratoriya qabında Porphyromonas və ya streptokokların sayını azaltmaq, yaxud yetişdirilmiş biofilmi yarıya qədər zəiflətmək mavi yaxalama vasitəsinin periodontiti müalicə etdiyini, endodontik infeksiyanı sağaltdığını və ya bakteriemiyanı aradan qaldırdığını sübut etmir. Klinik periodontal yardım biofilmin mexaniki dağıdılması və çıxarılmasına, eləcə də dişəti cibinin anatomik xüsusiyyətlərinin idarə olunmasına əsaslanır; işığa əsaslanan müdaxilə isə yerli köməkçi üsul kimi öyrənilir. Laboratoriya lövhəsinin yuvasında öldürən boya konsentrasiyası ilə dişəti xəttinin altındakı bakteriyalara çatan konsentrasiya arasında sabit əlaqə yoxdur və otaq işığı 660 nm doza deyil. Ağızda hər hansı istifadə üçün doza, təhlükəsizlik və qarşılıqlı təsir məhdudiyyətləri, təhlükəsizlik və qarşılıqlı təsir üzrə istinad materialında qeyd edildiyi kimi, klinisistlə müzakirə edilməlidir.
Bu sübutlar nə demək deyil
Bunlar məişət dezinfeksiyaedicisi barədə iddia deyil. Bakterisid cədvəllərdə müəyyən edilmiş ştamlar, mühitlər, təmas müddətləri, spektrlər və flüenslər istifadə olunur. Onlar mətbəx səthləri, üzvi çirklənmə şəraitində tələb olunan təmas müddətləri və ya normativ dezinfeksiya standartları barədə heç nə demir.
Bunlar sistemik antibiotiki əvəz etmək barədə də deyil. Ənənəvi fotodinamik təsir boyanın, udulan işığın və oksigenin eyni yerdə, eyni vaxtda olmasını tələb edir. İşıq dərin və ya yayılmış ocaqlara ağızdan qəbul edilən dərmanın qana çatdığı kimi çatmır. Ədəbiyyat bu yanaşmanı əlçatan yerli infeksiya üçün və ya köməkçi üsul kimi təqdim edir — Wainwright yerli dezinfeksiyanı elə başlanğıcdan bu şəkildə çərçivələndirmişdi.
Ədalətli xülasə daha məhduddur, amma yenə də maraqlıdır. Metilen mavisi qaranlıqda mülayim antimikrob aktivliyə malikdir, qırmızı işıq isə bir çox bakteriya və göbələk üçün daha böyük fotodinamik təsiri aktivləşdirir. Pseudomonas üçün 500-dən 25 uM-ə, epidemik MRSA üçün isə 80-dən 20 uM-ə enmə kimi işıqla qaranlıq arasındakı böyük fərqlərlə yanaşı, enterokoklarda və efflüks qabiliyyətli Candida-da öyrədici uğursuzluqlar da var. Nəticələrin praktikaya tətbiqini nominal boya konsentrasiyası qədər hədəfə çatdırılma, biofilm fiziologiyası və oksigen də müəyyən edir. Bu şərtləri nəzərə aldıqda rəqəmlər məna daşıyır. Onları kənara qoyduqda isə heç bir məna daşımır.