Metilen mavisi və azot monoksid: NOS, cGMP və damar siqnallaşması

Sual sadə səslənir: metilen mavisi azot monoksidi inhibə edirmi? Laboratoriyada bu sual dörd ayrı suala bölünür və hər biri fərqli eksperimental sınaq tələb edir. Onların qarışdırılması metilen mavisi və azot monoksid haqqında yazıların qəti, lakin qeyri-müəyyən səslənməsinin əsas səbəbidir.

Azot monoksid siqnalını dörd halqadan ibarət zəncir kimi təsəvvür edin. Azot monoksid sintazasının yaranması üçün gen transkripsiya olunur. Ferment arginini azot monoksidə çevirir. Qaz başqa bir maddə ilə reaksiyaya girməzdən əvvəl hədəfinə diffuziya edir. Həll olunan quanilat siklaza onu aşkar edir və siklik GMP yaradır. Metilen mavisinin hər halqaya təsiri barədə elmi nəşrlər var, lakin sübutlar fərqli eksperimental sistemlərdən, fərqli konsentrasiyalardan və fərqli izoformalardan əldə edilib. Bir halqadakı nəticə digər halqaya təsiri sübut etmir.

Əsas zəncirin sadə izahı

Damar divarında standart ardıcıllıq belədir. Bir stimul endotel hüceyrəsinə təsir edir. eNOS və ya NOS3 adlanan endotel azot monoksid sintazası az miqdarda azot monoksidin qısa müddətli ifrazını yaradır. Qaz qonşu saya əzələ hüceyrəsinə diffuziya edir, həll olunan quanilat siklazanın reduksiya olunmuş dəmir tərkibli heminə bağlanır və GTP-nin siklik GMP-yə çevrilməsini sürətləndirir. Siklik GMP protein kinaza G-ni aktivləşdirir, kalsiumun hüceyrədaxili tənzimlənməsi dəyişir və əzələ boşalır.

Ayrıca nəzərdən keçirilməli olan ikinci zəncir də var. İnfeksiya zamanı və ya sitokinlərin təsiri altında hüceyrələr başqa bir fermentin — NOS2 də adlanan induksiya olunan azot monoksid sintazasının, yəni iNOS-un — genini transkripsiya edir. O, eNOS-la müqayisədə daha böyük və daha uzunmüddətli azot monoksid axınları yaradır. Üçüncü izoforma, neyronal NOS və ya nNOS, başqa bir kontekstə aiddir. Məqalədə izoforma göstərilmədən azot monoksid sintazası deyilirsə, dayanıb hansının ölçüldüyünü yoxlayın. Metilen mavisinin elektronları necə ötürdüyünə dair icmal ümumən redoks hədəfləri üçün də eyni məqamı vurğulayır: ötürücü öz-özünə heç nə etmir və nəticəni hər iki ucdakı tərəfdaş müəyyənləşdirir.

Ölçülən siklik GMP də birbaşa ferment sınağı deyil, bir neçə prosesin birgə nəticəsini əks etdirən göstəricidir. Onun səviyyəsi siklaza ilə sintezdən fosfodiesterazalar, xüsusilə damar saya əzələsindəki PDE5 vasitəsilə parçalanmanı çıxmaqla müəyyən olunur. Buna görə də siklik GMP-nin azalması detektora daha az siqnal çatdığını göstərir. Bu, öz-özlüyündə hansı halqanın sıradan çıxdığını müəyyən etmir.

Halqa 1: daha az iNOS fermenti yaranır

Bakterial lipopolisaxarid, interferon qamma və ya hər ikisi ilə stimullaşdırılan siçan makrofaqlarında metilen mavisi iNOS zülalında gözlənilən artımın qarşısını aldı və makrofaqlarda transkripsiya təcrübələrində iNOS-un məlumat RNT-sini güclü şəkildə azaltdı. Burada məlumatverici məqam dəyişməyən proseslərdir. I kappa B alfa inhibitorunun parçalanması, NF kappa B və STAT1-in fosforlaşması və bu amillərin nüvəyə keçməsi əsasən dəyişməz qaldı. Azalan isə onların DNT-yə bağlanması idi; xromatin immunopresipitasiyası iNOS promotorunda bu amillərin daha az yerləşdiyini göstərərək bunu təsdiqlədi.

Bu, mövcud fermentin kəskin bloklanması deyil, fermentin miqdarının müəyyənləşməsindən əvvəlki mərhələdə gen tənzimlənməsinə təsirdir. Bu təsir iltihabi siqnallaşmaya aiddir: zülal yaranmazdan əvvəl transkripsiya amilləri promotora bağlanmalıdır. O, sakit vəziyyətdə olan damardakı konstitutiv eNOS haqqında birbaşa heç nə demir və məhz bu çərçivədə təsvir edilməlidir.

Halqa 2: mövcud NOS fermenti daha yavaş işləyir

Siçovullar üzərində aparılan bir tədqiqat fərqli səviyyəni yoxladı. Hipotalamusda NOS aktivliyi tədqiqatında şüuru açıq erkək siçovullara venadaxili lipopolisaxarid verildi, üç saat sonra isə venadaxili fizioloji məhlul və ya hər kg üçün 3 mg metilen mavisi yeridildi. Medial bazal hipotalamusda azot monoksid sintazasının aktivliyi işarələnmiş argininin sitrullinə çevrilməsi ilə ölçüldü. Təkcə stress və fizioloji məhlul birlikdə müəyyən qədər kalsiumdan asılı olmayan aktivlik yaratdı, lipopolisaxarid isə onu nəzarət səviyyəsinin təxminən on qatına qaldırdı. Metilen mavisi induksiya olunmuş hər iki komponenti aradan qaldırdı. Həmin toxumada, həmin dozada və həmin vaxt nöqtəsində kalsiumdan asılı konstitutiv aktivlik dəyişmədi.

Bu nəticəni dəqiq yazıldığı kimi oxuyun: həmin şəraitdə ölçülən iNOS tipli aktivlik azalmışdı. Bu, gen ekspressiyasının ölçülməsi deyil və eNOS və ya nNOS-la müqayisədə iNOS-a daim seçici təsirin sübutu da deyil. Təmizlənmiş fermentlə aparılan işlər ehtiyatlı yanaşmanın vacibliyini daha da vurğulayır. Təmizlənmiş NOS və quanilat siklazanın müqayisəsində bildirildiyinə görə, təmizlənmiş azot monoksid sintazasının birbaşa sınaqlarında metilen mavisi 30 micromolar konsentrasiyada sitrullin əmələ gəlməsini tam blokladı; yarıminhibisiya konsentrasiyası superoksid dismutaza olmadıqda təxminən 5.3 micromolar, olduqda isə 9.2 micromolar idi. Təmizlənmiş nNOS üzrə ayrıca bir tədqiqat fermentə bağlı hemin oksidləşməsinə işarə etdi. Praktik nəticə budur: təcrid olunmuş sistemlərdə NOS-un birbaşa inhibisiyası realdır, lakin hipotalamusda əldə edilən nəticəni metilen mavisinin hər yerdə bütün konstitutiv NOS formalarına təsir etmədiyi barədə ümumi iddiaya çevirmək olmaz.

Halqa 3: azot monoksid hədəfinə çatmadan itirilir

Siklik GMP-nin azalmasını fermentin bloklanmasından başqa bir mexanizmin də izah edə biləcəyinin ən aydın nümayişi kultivasiya olunmuş dovşan ağciyər arteriyasının saya əzələ hüceyrələrindən gəlir. Damar saya əzələsində superoksid tədqiqatında azot monoksid donorları birbaşa əlavə edilərək endogen NOS mərhələsi tamamilə keçildi, sonra isə metilen mavisinin yenə də siklik GMP cavabını azaldıb-azaltmadığı yoxlanıldı.

1–100 micromolar diapazonunda üç donor sınaqdan keçirildi: S-nitrozo-L-sistein, natrium nitroprussid və MPANO adlanan stabil deaminasiya olunmuş analoq. Hamısı siklik GMP-ni təxminən 1.5 qatdan 12 qata qədər artırdı. 10 micromolar konsentrasiyada metilen mavisi ilk ikisinin təsirini 51–100 faiz azaltdı və MPANO cavabını dəyişməz saxladı. Əgər metilen mavisi sadəcə siklazanın katalitik mərkəzini bloklasaydı, donorlar arasındakı bu seçiciliyi izah etmək çətin olardı, çünki hər üçü sonrakı mərhələdə eyni fermentə təsir göstərir.

Daha sonra üç nəzarət sınağı mexanizmin superoksidlə bağlı olduğunu dəqiqləşdirdi. Birincisi, ksantin və ksantin oksidaza ilə hüceyrəxarici superoksid yaradılması eyni mənzərəni təkrarladı: CYSNO və nitroprussidin təsiri bloklandı, MPANO-nun təsiri isə qorundu. İkincisi, metilen mavisi saya əzələ hüceyrələrində dozadan və zamandan asılı superoksid yaranmasına səbəb oldu; bu, sitoxrom c-nin reduksiyası ilə ölçüldü. Üçüncüsü, superoksid dismutaza inhibisiyanın qarşısını tam aldı, katalaza isə almadı. Bu, həmin eksperimental sistemdə bilavasitə təsir göstərən hissəciyin hidrogen peroksid deyil, superoksid olduğuna işarə edir.

Təcrübənin birgə kultivasiya variantını da təsvir etmək vacibdir, çünki o, təsirin məkanını müəyyənləşdirir. Örtük şüşələri üzərindəki endotel hüceyrələri saya əzələ hüceyrələri ilə qısa müddət birgə kultivasiya edildi və bazal olaraq ifraz olunan endotel amili saya əzələdə siklik GMP-ni üç-səkkiz qat artırdı. İki bölmədən hər hansı birinin əvvəlcədən metilen mavisi ilə işlənməsi bu siqnalı azaltdı, superoksid dismutaza isə endotel hüceyrələrinin əvvəlcədən işlənməsinin təsirini qismən aradan qaldırdı. Başqa sözlə, metilen mavisinin mütləq saya əzələnin detektor hüceyrəsinin daxilində təsir göstərməsi lazım deyil. O, siqnal daşıyıcısını ötürülmə zamanı aradan qaldıraraq siqnalı azalda bilər. Metilen mavisi tədqiqatlarını oxumaq üçün bələdçi bunu ümumi qayda kimi təqdim edir: molekulyar hədəfi adlandırmazdan əvvəl müdaxilənin baş verdiyi bölməni göstərin.

Bunu NOS inhibisiyası adlandırmaq yanlış olardı. Donorların işləməsi üçün sintaza mərhələsinə ehtiyac yox idi, amma siqnal yenə də azaldı.

Halqa 4: detektorun öz cavabı zəifləyir

Həll olunan quanilat siklazaya birbaşa təsirlər mövcuddur, lakin konsentrasiyalar əhəmiyyətlidir. Yuxarıda istinad edilən təmizlənmiş fermentlərin müqayisəsində azot monoksidlə stimullaşdırılmış siklazanın yarıminhibisiyası üçün təxminən 60 micromolar metilen mavisi lazım idi; NOS üçün isə yarıminhibisiya təxminən 5–9 micromolar səviyyəsində idi. Hətta 1 millimolar konsentrasiyada belə maksimal bloklanma yalnız qismən baş verdi. Bu, təxminən altı-on bir qat fərq deməkdir. Buna görə də aşağı micromolar konsentrasiyada siklik GMP-ni azaldan hüceyrə təcrübəsini yalnız siklik GMP göstəricisinə əsasən siklazanın seçici inhibisiyası adlandırmaq olmaz.

Daha sonrakı bir redoks tədqiqatı ikinci xəbərdarlığı əlavə etdi: metilen mavisi azot monoksidlə aktivləşdirilmiş siklazanı hem dəmirinin hava ilə sadə oksidləşməsindən fərqli mexanizm vasitəsilə deaktivləşdirdi. Deməli, detektorun fəaliyyəti pozula bilər, lakin kimyəvi mexanizm tam aydın deyil və konsentrasiyalar arasındakı fərq aşağı micromolar təsir səviyyələrində əvvəlcə superoksid və NOS təsirlərinin istisna edilməli olduğunu göstərir. Fosfodiesterazalara nəzarət də burada nəzərə alınmalıdır. Parçalanma ölçülməyibsə və ya bloklanmayıbsa, siklik GMP yığılmasının azalması daha az sintezə, daha sürətli parçalanmaya və ya hər ikisinə uyğun gəlir.

Niyə bunu qan təzyiqi haqqında tək bir iddiaya endirmək olmaz

Hər halqa fərqli sistemdə müəyyənləşdirilib. Makrofaqlarda transkripsiya hipotalamusda ferment aktivliyi ilə eyni deyil. Lipopolisaxariddən sonra hipotalamusdakı aktivlik sakit vəziyyətdəki endotel tonusu deyil. Birgə kultivasiyada bazal olaraq ifraz olunan endotel amili aqonistlə stimullaşdırılmış vazodilatasiya deyil. 10 micromolar metilen mavisi ilə işlənmiş, kultivasiya olunmuş ağciyər arteriyası hüceyrələri insanın qan dövranı deyil. Bütün bunları «metilen mavisi azot monoksidi bloklayaraq qan təzyiqini artırır» kimi bir ifadədə birləşdirmək nəzarət sınaqlarının məhz qorumaq üçün qurulduğu fərqləri aradan qaldırır.

Üç yoxlama izahın dəqiqliyini qoruyur. Birincisi, izoformanı göstərin: sakit vəziyyətdəki damar tonusu üçün eNOS, induksiya olunmuş iltihabi axın üçün iNOS, neyronal və bəzi təmizlənmiş ferment kontekstləri üçün nNOS. İkincisi, azot monoksid siqnalının necə çatdırıldığını göstərin: endogen sintez, bazal endotel ifrazı, yaxud CYSNO, nitroprussid və ya MPANO kimi konkret donor. Çünki stabil donor metilen mavisinə davamlı olduğu halda, qeyri-sabit donorlar belə deyildi. Üçüncüsü, konsentrasiyanı və bərpa sınağını göstərin: superoksid dismutaza ilə bərpa superoksidin iştirakına işarə edir, katalazanın təsirsiz qalması həmin sistemdə hidrogen peroksidin rolunun əleyhinə dəlildir, ksantin oksidaza ilə təsirin təkrarlanması bu mexanizmin kifayət etdiyini göstərir, təmizlənmiş ferment sınaqları isə katalizə birbaşa təsirləri ötürülmə zamanı baş verən itkilərdən ayırır.

Qısa ümumiləşdirmə belədir. Metilen mavisinə siklazanın seçici bloklayıcısı kimi deyil, azot monoksiddən siklik GMP-yə uzanan siqnallaşmaya bir neçə nöqtədə müdaxilə edən maddə kimi yanaşmaq daha düzgündür. Eksperimental sistemdən və konsentrasiyadan asılı olaraq, o, iNOS transkripsiya amillərinin bağlanmasını azalda, NOS fermentlərini birbaşa inhibə edə, superoksid yaranması vasitəsilə azot monoksidin mövcudluğunu azalda və azot monoksidlə aktivləşdirilmiş siklazanın fəaliyyətini poza bilər. Damar tədqiqatlarında siklik GMP siqnallaşmasının rolu və hüceyrə sınaqlarında istifadə olunan azot monoksid donorlarının müqayisəsi bu qollardan birini daha ətraflı izah edir. Redoks təsirlərini ferment təsirlərindən ayırmaq üçün istifadə olunan üsullar isə superoksid dismutaza, katalaza və stabil donorla nəzarət sınağının bu ədəbiyyatda niyə bu qədər tez-tez birlikdə istifadə olunduğunu açıqlayır.

Metilen mavisindən sonra siklik GMP-nin aşağı səviyyəsi zəncirin qırıldığını göstərir. Hansı halqanın qırıldığını yalnız nəzarət sınaqları müəyyən edir.