Metilen mavisi təcrübələrində reaktiv oksigen növlərinin ölçülməsi

İki laboratoriya hər birinin metilen mavisi ilə antioksidant təcrübəsi adlandırdığı sınağı aparır. Biri boyanın reaktiv oksigen növlərini azaltdığını bildirir. Digəri isə onları əmələ gətirdiyini bildirir. Hər ikisi aydın doza–cavab əyriləri göstərir. Hər ikisi səmimidir. Fərqin səbəbi saxtakarlıq və ya səriştəsizlik deyil. Səbəb budur ki, iki qrup fərqli işıq şəraitində, fərqli suallara cavab verən zondlarla fərqli şeyləri ölçüb, sonra isə hər iki nəticəni eyni sözlə ifadə edib: ROS.

Metilen mavisini dəqiq ölçmək çətindir, çünki bu molekul müşahidə etməli olduğu kimyəvi proseslərdə özü iştirak edir. Qaranlıqda donorlarla akseptorlar arasında elektron daşıyır və yenidən dövr etməyə hazır şəkildə ilkin formasına qayıdır. İşıq altında fotosensibilizatora çevrilərək həyəcanlanmış triplet vəziyyətinə keçir; bu vəziyyətdə enerjisini oksigenə ötürərək sinqlet oksigen, yaxud elektronları ötürərək radikallar və hidrogen peroksid əmələ gətirə bilər. Bu sistemə daxil edilən istənilən zond boyanın özü tərəfindən oksidləşdirilə, reduksiya oluna, rəngsizləşdirilə və ya optik olaraq maskalana bilər. Buna görə də hər hansı ROS ölçməsində ilk sual heç vaxt rəqəmin neçə olması deyil. İlk sual analizin əslində nəyi aşkar etməsi və boyanın analizə necə təsir göstərməsidir.

Amplex Red: kalibrlənmiş hidrogen peroksid analizi

Metilen mavisi ilə Amplex Red kombinasiyası düzgün qurulduqda bu sahənin ədəbiyyatında ən əsaslandırıla bilən uyğunlaşdırmadır. Kimyəvi proses spesifikdir: qıtıqotu peroksidazası hidrogen peroksiddən istifadə edərək Amplex substratını təxminən birə bir stoxiometrik nisbətdə flüoressent məhsula — rezorufinə oksidləşdirir. Nümunədəki peroksid detektorda flüoressensiya siqnalına çevrilir. Ənənəvi ROS qrupuna daxil olan digər növlərin heç biri bu reaksiyanı birbaşa törətmir.

Həlledici üstünlük kalibrləmədir. Diqqətli tədqiqatçı məlum peroksid standartlarını eyni buferdə, eyni peroksidaza və substrat konsentrasiyaları, eyni inkubasiya müddəti və eyni optik parametrlərlə ölçür, sonra nümunələri həmin əyri ilə müqayisə edir. Bu metodun əsaslandığı təcrid olunmuş beyin mitoxondriləri tədqiqatında müəlliflər məhz bunu ediblər: hər sınağın sonunda məlum miqdarda peroksid əlavə ediblər və nəticələri ixtiyari flüoressensiya vahidləri ilə deyil, hər milliqram zülala dəqiqədə düşən pikomollarla ifadə olunan sürətlər kimi təqdim ediblər. Parıltını ölçməyə çevirən məhz budur.

Həmin tədqiqatın üç detalını tətbiq etməyə dəyər. Birincisi, müəlliflər siqnalı peroksidi parçalayan katalaza ilə yoxlayıblar. Metilen mavisinin yaratdığı flüoressensiya artımı katalaza əlavə edildikdə dayanıb və bununla siqnalın optik artefaktdan deyil, peroksiddən qaynaqlandığı təsdiqlənib. İkincisi, onlar həyəcanlandırıcı şüanı fasiləli şəkildə kəsərək nümunələrin normal işıq dozasının səkkizdə birini almasını təmin edib, işıqlandırmanın təsirini birbaşa yoxlayıblar; siqnal isə cəmi doqquz faiz azalıb. Bildirdikləri peroksidin doxsan faizdən çoxu ölçmə işığından asılı olmayıb. Üçüncüsü, peroksidin kənarlaşdırılmasını ayrıca elektrodla ölçüblər və boyanın həm onun yaranmasını artırdığını, həm də kənarlaşdırılmasını yavaşıtdığını müəyyən ediblər. Yalnız yekun flüoressensiyanı göstərən zond bu iki təsiri bir-birinə qarışdırardı.

Bu analizdə yenə də xəta mənbələri var və metilen mavisi onlardan bir neçəsini üzə çıxarır. Boya rezorufinin şüalanma yaydığı eyni qırmızı spektral bölgədə geniş udulmaya malikdir, buna görə də yüksək boya konsentrasiyalarında nümunə daxili filtr effektləri vasitəsilə öz siqnalını maskalaya bilər. Odur ki, standartlarda boya konsentrasiyası nümunələrdəki ilə eyni olmalıdır. Amplex Red özü də fotooksidləşə bilər, onun məhsulu olan rezorufin isə superoksid və peroksid yaradan fotoredoks dövrlərinə daxil ola bilər; təcrübədə fotosensibilizator da işıqlandırıldıqda bu, xüsusilə əhəmiyyətlidir. Praktik həll boya ilə zondu birlikdə işıqlandırmaq əvəzinə, əvvəlcə metilen mavisi nümunələrini şüalandırmaq, sonra isə alikvotları Amplex reagentləri ilə qaranlıqda analiz etməkdir. Nəhayət, superoksid dismutaza Amplex siqnalını sadəcə azaltmır: superoksidin peroksidə çevrilməsi onu artıra bilər. Flüoressensiyanı artıran SOD nəzarəti uğursuz olmayıb. O, superoksidin prosesin əvvəlki mərhələsində iştirak edən növ olduğunu göstərib.

DCFDA: qeyri-spesifik oksidləşmə göstəricisi

Metilen mavisi ilə DCFDA kombinasiyası çaşqınlığın böyük hissəsinin mənbəyidir. DCFH-DA hüceyrəyə daxil edilən prekursor formadır. Hüceyrə daxilindəki esterazalar onun asetat qruplarını ayıraraq flüoressensiya verməyən DCFH əmələ gətirir, DCFH-nin oksidləşməsi isə flüoressent DCF yaradır. Onu oksidləşdirən maddələrin siyahısı uzundur: hidroksil radikalları, peroksidaza və hem reaksiyalarının aralıq məhsulları, azot dioksid, hipoxlor turşusu və peroksinitritdən yaranan radikallar. Hidrogen peroksid təkbaşına onu praktik baxımdan əhəmiyyətli sürətlə birbaşa oksidləşdirmir; peroksiddən asılı flüoressensiya üçün prosesdə adətən dəmir, hem zülalları və ya peroksidaza reaksiyaları iştirak etməlidir.

Hər metodlar bölməsində istinad edilməli olan tənqid Kalyanaraman və həmkarlarının DCFH-ni zond kimi təhlilindən qaynaqlanır və bu səbəbdən DCFDA-dan imtina edən beyin mitoxondriləri tədqiqatında ümumiləşdirilir. Həmin təhlil zondun yavaş, xarakterizə olunmamış stoxiometriya ilə, etibarlı kalibrləmə olmadan və ROS olmayan birləşmələrlə də reaksiyaya girdiyini göstərib. Zond ölçdüyü prosesi özü də gücləndirir: DCFH-nin bir elektronlu oksidləşməsi oksigenlə reaksiyaya girib superoksid yaradan DCF radikalı əmələ gətirir, superoksid isə dismutasiya yolu ilə əlavə peroksidə çevrilir. Ölçmə prosesi bildirdiyi kimyəvi reaksiyaların bir hissəsini özü yaradır.

Bunların heç biri DCFDA-nı yararsız etmir. Onu identifikasiya vasitəsi deyil, skrininq vasitəsi edir. DCF flüoressensiyasının artması oksidləşdiricilərdən asılı zond oksidləşməsinin artdığını göstərir. Bu, peroksidin artması demək deyil və əlbəttə, heç bir tək zondun ölçmədiyi ümumi ROS miqdarının artması da demək deyil. Bir mikromolyardan yuxarı konsentrasiyalarda DCF oksidləşməsinə əsaslanan əvvəlki metilen mavisi tədqiqatları prooksidant təsirlər bildirirdi, eyni dövrdə başqa sistemlərdə isə peroksidin törətdiyi hüceyrə ölümündən qorunma müşahidə olunurdu. Hər iki müşahidə fərqli redoks şəraitlərində eyni boya üçün doğru ola bilər və təkcə DCF nəticəsi siqnalı hansı oksidləşdiricinin yaratdığını deyə bilməz. Əvvəlki beyin mitoxondriləri işinin əhəmiyyəti ondadır ki, bu skrininqi kalibrlənmiş peroksid ölçməsi ilə əvəz edib və yükü birbaşa müəyyənləşdirib: hətta yüz nanomolyar boya belə sınaqdan keçirilmiş bütün substratlarda və tənəffüs vəziyyətlərində peroksid ayrılmasını bir neçə dəfə artırıb.

DCFDA ilə metilen mavisinə xas daha bir tələ var. Boya intensiv rəngə malikdir və redoks baxımından aktivdir, buna görə də flüoressensiyanı rəngsizləşdirə, emissiyanı söndürə və ya hüceyrə ROS-undan asılı olmayaraq zondun kimyəvi komponentlərini oksidləşdirə bilər. Boya və zond olan, lakin hüceyrə olmayan nəzarət nümunəsi könüllü bir əlavə deyil. Boyanın zondla qarşılıqlı təsirə girib-girmədiyini göstərən təcrübə məhz budur.

Spin tutma və oksigen sərfi: növün kimliyi və axın

Flüoressent zondlar oksidləşdirici bir şeyin meydana çıxdığını göstərdiyi halda, spin tələləri ilə elektron spin rezonansı onun nə olduğuna daha yaxın cavab verir. Metilen mavisinin fotokimyasına dair klassik tədqiqatda boya, askorbat və işıqdan yaranan askorbat radikalını aşkar etmək üçün ESR-dən istifadə olunub, sonra oksigen sərfi təcrübələrində peroksid əmələ gəlməsi və spin tutma sınaqlarında dəmirin kataliz etdiyi hidroksil radikalı əmələ gəlməsi göstərilib. Hər üsul digərlərinin cavablandıra bilmədiyi suala cavab verib: ESR radikalın kimliyini, oksigen sərfi hər hansı flüoressent zonddan asılı olmayan reaksiya axınını göstərib, onların kombinasiyası isə eyni işıqlandırılmış sistemdə həm sinqlet oksigen, həm də radikal yollarının işlədiyini ortaya qoyub.

1984-cü ilin həmin nəticəsi hələ də xəbərdarlıq kimi səslənir. İşıqlandırma və reduksiyaedici maddə olduqda boya peroksid yaradıb, dəmir olduqda isə sistem bu növlər arasında ən reaktiv olan hidroksil radikalını əmələ gətirib. Müəlliflər bunu gözdəki askorbatla əlaqələndirərək düşünülməmiş oftalmoloji istifadəni sual altına alıblar. Müasir oxucular şərtlərə diqqət yetirməlidirlər: işıq, reduksiyaedici maddə və dəmir birlikdə. Bunlardan hər hansı birini aradan qaldırdıqda həmin reaksiya yolu zəifləyir və ya yox olur.

Oksigen elektrodlarının əhəmiyyəti başqadır. Klark tipli elektrod xalis oksigen sərfini ölçür; bu, boyanın törətdiyi redoks reaksiyalarının molekulyar oksigen sərf etdiyini təsdiqləyir və heç bir flüoressensiya artefaktının saxtalaşdıra bilməyəcəyi kinetik məlumat verir. O, məhsulun kimliyini müəyyən etmir. Peroksid, superoksid və su yaranması, eləcə də sinqlet oksigenin sönməsi oksigen sərf edir. Kimlik müəyyən edilmədən axın haqqında məlumat, axın müəyyən edilmədən kimlik haqqında məlumat qədər natamamdır; buna görə də güclü tədqiqatlarda elektrod kalibrlənmiş peroksid analizi və ya tələ ilə birlikdə istifadə olunur.

Antioksidant nəticələr niyə ziddiyyətlidir

Üç ölçmə nəticəsini yanaşı qoyduqda metilen mavisi ədəbiyyatındakı zahiri ziddiyyətlər metod fərqləri və üç bioloji faktla izah olunur.

Birincisi, boya həm elektron daşıyıcısı, həm də peroksid mənbəyidir. Elektronları oksigenin əks halda superoksidə çevriləcəyi tənəffüs sahələrindən uzaqlaşdıraraq bir ROS növünü azalda bilər; eyni zamanda onun reduksiya olunmuş forması oksigeni birbaşa peroksidə reduksiya edərək digərini artıra bilər. Buna görə də mitoxondrial redoks kimyası və metilen mavisinin alternativ elektron yolu kimi rolu ilə işləyən laboratoriya zonddan asılı cavablar gözləməlidir: eyni küvetdə superoksidə həssas ölçmə nəticəsi azalarkən peroksid nəticəsi artır.

İkincisi, aşağı dozalarda peroksid sadəcə zərər deyil, həm də siqnaldır. Əvvəlki işin davamı olan siçan beyin mitoxondriləri tədqiqatı cəmi əlli nanomolyar boyadan peroksid əmələ gəldiyini və terapevtik səviyyələrdə mitoxondrial DNT zədələnmələrinin olmadığını müəyyən edib; əvvəlcədən tətbiqdən sonra rotenonun törətdiyi zədələnmələrə qarşı qorunma da müşahidə olunub. Yalnız terapevtik diapazondan xeyli yuxarı olan yüz mikromolyar səviyyəsində boya seçilmiş DNT fraqmentlərini zədələyib, qırmızı işıqla birlikdə iyirmi mikromolyar boya isə sınaqdan keçirilmiş bütün fraqmentləri zədələyən sinqlet oksigen yaradıb. Təklif olunan mexanizm hormetikdir: zəif peroksid yaranması Nrf2 ilə əlaqəli antioksidant müdafiəni və mitoxondrial biogenezi işə salır, beləliklə, qısamüddətli prooksidant nəticədən sonra daha uzunmüddətli antioksidant nəticə gəlir. Bir saat sonra oxunan analizlə bir gün sonra oxunan analiz bir-birinə uyğun gəlməyə bilər, çünki bu müddətdə bioloji vəziyyət dəyişib.

Üçüncüsü, işıq hansı molekulun mövcud olduğunu belə müəyyənləşdirir. İşıqlandırma boyanı demetilləşdirərək Azure B və əlaqəli məhsullara çevirir, qabın üzərindəki mikroskop lampası isə onu fotosensibilizasiya etmək üçün kifayətdir. Qaranlıqda və işıq altında aparılan təcrübələr fərqli təcrübələrdir və hər protokolun işıqlandırma və boya ilə işləmə üzrə nəzarətlər bölməsi onları bu şəkildə nəzərdən keçirməlidir.

Minimum nəzarət dəsti və istənilən iddianı necə qiymətləndirməli

Aşağıdakı müqayisə bu məqalə üçün hazırlanmış orijinal istinad materialıdır. Metilen mavisi ilə bağlı hər hansı ROS nəticəsini qəbul etməzdən əvvəl müəlliflərin hansı sətri yerinə yetirdiyini, hansını isə buraxdığını yoxlayın.

Buradan praktik bir qiymətləndirmə qaydası çıxır. Peroksidaza ilə işlədilən, kalibrlənmiş və katalaza ilə yoxlanmış Amplex peroksid haqqında dəlildir. DCFDA qeyri-spesifik zond oksidləşməsi haqqında dəlildir və bundan artıq heç nə deyil. Radikal tutucularla nəzarət olunan spin tutma radikalın kimliyi haqqında dəlildir. Oksigen sərfi axın haqqında dəlildir. Analizinin əsaslandıra biləcəyindən artıq iddia edən cümlə nə qədər inamla yazılsa da, boya haqqında deyil, zond haqqında cümlədir. Dozadan asılılıq və hormetik diapazon, mitoxondrial elektron axını, boyanmış nümunələrdə analizə müdaxilə və mikroskopiyada işıqlandırma artefaktları ilə bağlı müzakirələr bu məqamların hər birini genişləndirir və müvəqqəti istinadları əvəzləndikdən sonra da hər biri qüvvədə qalır.