Metilen mavisi, Nrf2 və mitoxondrial biogenez: nə ölçülüb, nə isə hələ fərziyyədir

Metilen mavisi haqqında yazılarda bir cümləyə tez-tez rast gəlinir: o, Nrf2-ni aktivləşdirir və yeni mitoxondrilər yaradır. Cümlə vahid iddia kimi səslənir, lakin fərqli sistemlərdə, fərqli növ dəlillərlə araşdırılmış iki ayrı anlayışı birləşdirir. Birincisi siqnal yoludur — müdafiə genlərini işə salan sensor. İkincisi isə quruculuq proqramıdır — hüceyrənin daha çox mitoxondrial mexanizm yaratması. Siqnal quruculuğu başlada bilər, lakin siqnalın işə düşdüyünü göstərmək binanın tikildiyini göstərmək deyil; daha çox tikinti materialının olduğunu göstərmək də enerji təchizatının yaxşılaşdığını göstərmək deyil. Bu məqalə həmin üç məqamı bir-birindən ayırır.

Nrf2 anlayışı: qalxan deyil, sensor

Nrf2 (eritroid 2 nüvə faktoru ilə əlaqəli faktor 2) transkripsiya faktorudur, yəni işi genləri aktivləşdirmək olan zülaldır. Sakit vəziyyətdə onu Keap1 adlı sensor zülal sitoplazmada saxlayır və davamlı parçalanması üçün hüceyrənin utilizasiya mexanizminə ötürür. Oksidantlar və ya elektrofillər Keap1-dəki reaktiv sisteinləri dəyişdirdikdə parçalanma dayanır. Yeni yaranan Nrf2 toplanır, nüvəyə keçir, kiçik Maf zülalları ilə birləşir və antioksidant cavab elementləri adlanan DNT ardıcıllıqlarına bağlanır. Bu bağlanma bir sıra müdafiə genlərini işə salır.

Bu yolun kanonik göstəriciləri konkretdir. NQO1 (NAD(P)H xinon dehidrogenaza 1) və TrxR1 (tioredoksin reduktaza 1) ən etibarlı Nrf2 hədəf genləri arasındadır. HO-1 (hem oksigenaza-1) güclü şəkildə induksiya olunur, lakin digər tənzimləyicilərə də cavab verir. SOD və katalaza kimi fermentlər antioksidant mexanizmin tərkib hissələridir, amma onların səviyyələrini çoxsaylı transkripsiya faktorları idarə edir; buna görə SOD-un artması təkbaşına səbəbin Nrf2 olduğunu sübut etmir. Siqnal hadisəsinə ən yaxın dəlillər Nrf2-nin nüvədə toplanması, ARE reportyorunun aktivləşməsi və ya Nrf2 aradan qaldırıldıqda yox olan kanonik hədəf induksiyasıdır. Qalan hər şey — oksidant səviyyələrinin azalması, stress şəraitində hüceyrələrin daha yaxşı sağ qalması, qlutationun artması — müxtəlif yolların yarada bildiyi sonrakı təsirlərdir.

Bu mövzuda metilen mavisinə dair ilk nəticə həmin dəlil şkalasının siqnala yaxın ucuna uyğun gəlir. Nanomolar konsentrasiyada metilen mavisinin təsirinə məruz qalan fibroblastlarda hüceyrə qocalmasının gecikməsi ilə yanaşı, kompleks IV miqdarının və oksigen sərfinin artması, həmçinin 2-ci faza fermentləri TrxR1 və NQO1-in induksiyası müşahidə edilmişdi. Bu nəticələr metilen mavisini mitoxondrial fəaliyyətin güclənməsi və hüceyrə qocalmasının gecikməsi ilə ilk dəfə əlaqələndirən tədqiqatda bildirilmişdi. TrxR1 və NQO1 diqqətli oxucunun görmək istədiyi məhz həmin kanonik Nrf2 hədəfləridir. Tədqiqatın göstərmədiyi isə siqnal hadisəsinin özüdür: nüvədə Nrf2 ölçülməmişdi, ARE reportyoru yox idi, Nrf2-nin genetik olaraq sıradan çıxarıldığı nəzarət qrupu yox idi. Buna görə dürüst şərh belədir: metilen mavisi bu sistemdə məlum Nrf2 hədəf genlərini induksiya edir; bu, Nrf2 aktivləşməsi ilə uyğundur, lakin Nrf2-ni ayrıca səbəb kimi müəyyənləşdirmir. Hədəf genin induksiyası aktivləşmə anından bir mərhələ sonradır.

Biogenez anlayışı: üç yoxlama mərhələsi olan proqram

Mitoxondrial biogenez hüceyrənin mitoxondrial potensialını artırdığı proqramdır. Dərsliklərdəki iyerarxiyası üç yoxlama mərhələsindən keçir. Əvvəlcə koaktivator PGC-1alpha proqramı işə salır. İkinci mərhələdə nüvə transkripsiya faktorları mitoxondrial genlərin, o cümlədən mitoxondrial DNT-ni saxlayan və replikasiya edən TFAM-ın ekspressiyasını artırır. Çaşdırıcı məqam budur ki, həmin faktorlardan biri NRF1, yəni nüvə tənəffüs faktoru 1 adlanır və Nrf2-dən fərqli zülaldır. Üçüncü mərhələdə hüceyrədə daha çox mitoxondrial genom və tənəffüs mexanizmi olur; bunu mtDNT nüsxələrinin sayı, sitrat sintaza aktivliyi və ya tənəffüs komplekslərinin miqdarı və aktivliyi ilə ölçmək mümkündür.

Hər yoxlama mərhələsi əvvəlki ilə müqayisədə daha zəif və ya daha güclü iddianı dəstəkləyir. PGC-1alpha və ya TFAM məlumat RNT-sinin artması proqramın icrası üçün siqnal verildiyini göstərir, tamamlandığını yox. Daha çox mtDNT və ya kompleks IV zülalı daha çox material olduğunu göstərir, lakin yenidən qurulmuş mitoxondrilər də eyni mənzərəni yarada bilər. Tənəffüsün yaxşılaşması, oksigen sərfinin və ya kompleks aktivliyinin artması funksiyanın dəyişdiyini göstərir, amma funksiya heç bir yeni mitoxondri yaranmadan da yaxşılaşa bilər. Güclü biogenez iddiası hər üçünü birləşdirir: tənzimləyici, miqdar və funksiya.

Fibroblastlarla aparılan sonrakı tədqiqat bu zəncirin böyük hissəsini izlədi. 100 nanomolar konsentrasiyada metilen mavisi ilə işlənmiş insan IMR90 hüceyrələrində NAD-ın NADH-a nisbəti 15 dəqiqə ərzində müvəqqəti yüksəldi və bir gün ərzində ilkin səviyyəyə qayıtdı. Bu müvəqqəti enerji siqnalını enerji sensoru AMPK-nın müvəqqəti fosforlaşması, ardınca isə PGC-1alpha və işlək kompleks IV-ün yığılması üçün zəruri zülal olan SURF1-in induksiyası izlədi. Kompleks IV aktivliyi təxminən ikiqat artdı, hüceyrədəki oksidantlar təxminən 28 faiz azaldı və telomerlər daha yavaş qısaldı. Tam ardıcıllıq metilen mavisinin redoks aktivliyini AMPK və mitoxondrial biogenezlə əlaqələndirən məqalədə təqdim olunur.

Həmin məqalədə iki detal diqqətə layiqdir, çünki bunlar adətən nəzərdən qaçırılan detallardır. Birincisi, aktivləşmənin baş verməsindən çox, onun gedişatı əhəmiyyətli idi: metilen mavisi AMPK-nı müvəqqəti aktivləşdirirdi, müqayisə üçün istifadə edilən AICAR preparatı isə onu davamlı aktivləşdirirdi; müvəqqəti aktivləşdirici hüceyrə qocalmasını təxminən səkkiz dəfə daha effektiv gecikdirirdi. Buna görə “metilen mavisi AMPK-nı aktivləşdirir” şəklində iddia natamamdır; əsas iddia onun AMPK-nı müvəqqəti aktivləşdirməsidir və müqayisə davamlı aktivləşmənin eyni nəticəni vermədiyini göstərir. İkincisi, metilen mavisi hüceyrə siklini dəyişdirmirdi. Bu, ən sadə alternativ izahı — hüceyrələrin sadəcə daha yavaş bölündüyünü və buna görə daha gənc göründüyünü — istisna edir.

Siçanlarla aparılan araşdırma: davranış, genomlar və qəsdən paradoksal başlanğıc siqnalı

Hüceyrə kulturası ilə aparılan iş orta yaşlı siçanları araşdıran bir qrup tərəfindən heyvanlara da tətbiq edildi. 60 gün ərzində ağızdan metilen mavisi qəbul edən siçanlar maddəni qəbul etməyən yaşlı siçanlarla müqayisədə fiziki dözümlülüklərini və ətrafı araşdırma davranışlarını daha çox qorudular, narahatlığa bənzər davranışları isə daha az göstərdilər. Beyin toxumasında yaşlanmanın zəiflətdiyi NRF1, TFAM, SOD2 və kompleks IV alt vahidi COX1 genlərinin ekspressiyası yetkin siçanlardakı səviyyələrə doğru bərpa olundu və mtDNT nüsxələrinin sayı artdı. Davranışı, tənzimləyicini və genom miqdarını əhatə edən bu nəticələr metilen mavisi və beyində mitoxondrial biogenez haqqında orta yaşlı siçanlarla aparılan tədqiqatda bildirilir.

Fərz edilən başlanğıc siqnalı maraqlı məqamdır, çünki metilen mavisinin sadəcə antioksidant olması barədə sadə izaha ziddir. Metilen mavisi verilən siçanların beyin mitoxondrilərində reaktiv oksigen növlərinin, xüsusilə hidrogen peroksidin yaranması artmışdı. Müəlliflərin fərziyyəsinə görə, Nrf2 yolunu aktivləşdirən zəif peroksid siqnalıdır və həmin yol daha sonra biogenez proqramını işə salır. Bu modeldə metilen mavisi başlanğıc mərhələsində prooksidant, nəticə mərhələsində isə antioksidantdır. Farmakoloqlar kiçik stressin özündən daha böyük müdafiə reaksiyası yaratdığı bu modeli hormezis adlandırırlar. Peroksidin artmasının həqiqətən Nrf2 aktivləşməsinə səbəb olub-olmadığı birbaşa yoxlanılmayıb; bu, ölçülmüş əlaqə deyil, fərz edilən əlaqələndirici mexanizmdir.

Eyni qrupun paralel tədqiqatı bu fərziyyənin təhlükəsizlik tərəfini sərt sınaqdan keçirdi. Təcrid olunmuş beyin mitoxondrilərində metilen mavisi hətta 50 nanomolar kimi aşağı konsentrasiyalarda hidrogen peroksid istehsalını artırdı, lakin terapevtik konsentrasiyalar mitoxondrial DNT-də aşkar edilə bilən zədələnmə yaratmadı. Yalnız terapevtik səviyyələrdən xeyli yüksək olan 100 micromolar konsentrasiyada seçilmiş mtDNT fraqmentlərində zədələnmə müşahidə edildi. 20 micromolar konsentrasiyalı boyanın qırmızı işıqla birləşdirilməsi isə mtDNT-ni geniş şəkildə zədələyən sinqlet oksigen yaratdı. Bu, boyanın qaranlıqda farmakoloji təsiri deyil, məlum fotosensibilizator davranışıdır. Əvvəlcədən tətbiq hətta orta beynin ventral hissəsinin mitoxondrilərini rotenonun yaratdığı mtDNT zədələnmələrindən qorudu. Dozadan asılı cavab və genotoksiklik üzrə nəzarət sınaqları metilen mavisinin genotoksik olmayan peroksid istehsalına dair tədqiqatda ətraflı təqdim olunur.

Ölçülmüş nəticələr və fərziyyələr: diaqramın oxunması

Aşağıdakı siqnal yolu diaqramı mətn boyu aparılan fərqləndirməni aydın göstərmək üçün bu məqaləyə xüsusi hazırlanıb. Bütöv haşiyəli xanalar metilen mavisi haqqında ədəbiyyatda birbaşa eksperimental dəstəyi olan mərhələlərdir: NAD/NADH nisbətini dəyişən redoks dövrü, AMPK-nın müvəqqəti fosforlaşması, PGC-1alpha və SURF1-in induksiyası, kompleks IV aktivliyinin artması, NQO1 və TrxR1-in induksiyası, siçan beynində biogenez genlərinin ekspressiyasının və mtDNT nüsxələrinin sayının bərpası, həmçinin terapevtik dozalarda mtDNT zədələnmədən peroksidin yüksəlməsi. Kəsik haşiyəli xanalar fərz edilən əlaqələrdir: Keap1-in peroksid siqnalını hiss etməsi, Nrf2-nin nüvədə toplanaraq müdafiə genlərini işə salması və Nrf2 aktivləşməsindən biogenez proqramına yönələn səbəb-nəticə oxu. Bu kəsik haşiyəli mərhələlər məntiqli, məlumatlarla uyğun və dərslik biologiyasına əsaslanan olsa da, həmin məqalələrdə onları bütöv haşiyəli xanalara çevirməyə imkan verəcək nəzarət sınaqları ilə — nüvədə Nrf2 ölçülməsi, ARE reportyorları, Nrf2-nin genetik olaraq sıradan çıxarılması ilə — ölçülməyiblər.

Diaqram qarşınızda olduqda üç qarışıqlıq aydın görünür. Birincisi, NRF1 və Nrf2 adları demək olar ki, eyni olan fərqli zülallardır; siçan tədqiqatında antioksidant transkripsiya faktoru deyil, biogenez tənzimləyicisi olan nüvə tənəffüs faktoru 1 ölçülmüşdü və onları qarışdırmaq bütün diaqramı tək bir düyünə endirir. İkincisi, gen ekspressiyası hekayənin sonu deyil, başlanğıcıdır; TFAM və ya COX1 məlumat RNT-lərinin bərpası biogenez üçün siqnal verildiyini dəstəkləyir, mtDNT nüsxələrinin sayı və kompleks IV aktivliyi isə bu siqnalın icra olunduğuna dəlildir. Üçüncüsü, antioksidant nəticə Nrf2 yolunu sübut etmir; fibroblastlarda oksidantların 28 faiz azalması və siçanlarda rotenondan qorunma real sonrakı təsirlərdir, lakin bir neçə yol eyni nəticələrə gətirib çıxarır.

Kəsik haşiyəli xananı nə bütöv haşiyəli edərdi

Çatışmayan təcrübələr standart təcrübələrdir. Metilen mavisinin təsirindən sonra nüvədə Nrf2 zülalının müvəqqəti AMPK siqnalına uyğun zaman ardıcıllığı ilə ölçülməsi, sinxron aktivləşmə fərziyyəsinin iddia etdiyi kimi, iki qolun həqiqətən birlikdə işə düşüb-düşmədiyini yoxlayardı. ARE ilə idarə olunan reportyor transkripsiya aktivliyini hədəf genlərdən çıxarılan nəticə kimi deyil, birbaşa təsdiqləyərdi. Nrf2-nin ekspressiyası azaldılmış və ya geni sıradan çıxarılmış şəraitdə biogenez göstəricilərinin təkrar ölçülməsi səbəb-nəticə oxunu birbaşa yoxlayardı: kompleks IV induksiyası və mtDNT artımı Nrf2 olmadan da davam edərsə, fərz edilən əlaqə yanlışdır və təsiri təkcə AMPK qolu təmin edir. Heyvanlarda isə eyni üç yoxlama mərhələsini — tənzimləyici, miqdar və funksiyanı — əhatə edən uzunmüddətli dozalanma tədqiqatı proqramın aktiv qalmasını, yoxsa uyğunlaşmasını yoxlayardı. O vaxta qədər enerji və müdafiə yollarının sinxron aktivləşməsi müəlliflərinin onu adlandırdığı kimi qalır: təsdiqlənmiş mexanizm deyil, mümkün əsas amil.

Mövzuya daha geniş farmakologiya baxımından yanaşan oxucular ətraf kontekstlə də maraqlana bilərlər: metilen mavisinin mitoxondrial səviyyədə elektronları necə daşıması, mitoxondrilərə və hüceyrə enerjisinə başqa hansı təsirləri göstərməsi, hüceyrə qocalmasına dair nəticələrin yaşlanma araşdırmalarında yeri, biogenez iddialarının koqnitiv performansla əlaqəsi və dozalanmaya dair hər bir müzakirənin sərhədlərini müəyyən edən təhlükəsizlik məlumatları. Bunların hər biri öz dəlilləri olan ayrıca anlayışdır və hər biri bu məqalədə Nrf2-yə tətbiq edilən ölçülmüş nəticə ilə fərziyyənin eyni dərəcədə diqqətli fərqləndirilməsinə layiqdir.