Metilen mavisi ilə sadə boyama və Qram boyaması: hər üsul nəyi sübut edə bilər

Tələbə E. coli kimi etiketlənmiş kulturadan yaxma hazırlayır, üzərini bir dəqiqəlik metilen mavisi ilə örtür, yaxalayır və yağ immersiya obyektivindən baxır. Görmə sahəsi mavi çöpvari hüceyrələrlə doludur. Laboratoriya hesabatında belə yazılır: “Qram-mənfi çöpvari bakteriyalar E. coli kimi müəyyən edildi.” Müşahidə doğrudur. Amma həmin preparat bu nəticəyə gəlmək üçün əsas vermir.

Səhv texniki deyil, anlayışla bağlıdır. Tələbə sadə boyamanı differensial sınaq kimi qəbul edib. Sadə boyama və Qram boyaması fərqli suallara cavab verir, çünki fərqli boyama prinsiplərinə əsaslanır. Biri soruşur: hansı forma mövcuddur? Digəri soruşur: sınağa məruz qaldıqda hüceyrə divarı necə davranır? Bu ikisini qarışdırdıqda düzgün boyanmış preparat əsassız hesabata gətirib çıxarır.

Bu müqayisə iki üsulu bir-birindən ayırır, hər nəticənin hansı fikri söyləməyə əsas verdiyini göstərir və tələbələrin ən çox verdiyi iki suala cavab verir: metilen mavisi Qram boyamasında istifadə edilə bilərmi və E. coli-nin metilen mavisi ilə boyanması əslində nəyi göstərir?

Qısa cavab

Metilen mavisi ilə sadə boyama boyana bilən bütün hüceyrələri eyni mavi rəngə boyayır. Buna görə morfologiyanı (çöpvari, kürəvi, spiral formaları) və düzülüşü (tək, cüt, zəncir şəklində) göstərir, lakin Qram kateqoriyası barədə heç nə demir. Qram boyamasına yod, rəngsizləşdirmə mərhələsi və əks boyama daxildir. Buna görə bakteriyalar hüceyrə örtüklərinin boyanı necə saxlamasına əsasən Qram-müsbət (bənövşəyi) və Qram-mənfi (çəhrayı və ya qırmızı) qruplara ayrılır. Metilen mavisindən sonra görünən mavi çöpvari hüceyrələr “çöpvari hüceyrələr mövcuddur” deməkdir. Tam Qram boyama ardıcıllığından sonra görünən çəhrayı çöpvari hüceyrələr isə “Qram-mənfi çöpvari bakteriyalar mövcuddur” deməkdir. İkinci fikir daha güclü əsaslandırılıb, çünki prosedur əlavə sınağı da əhatə edib.

Bu məqalənin aid olduğu tək boyalı bakterial üsulların daha geniş qrupu üçün mikroskopik boyama atlasına baxın.

Sadə boyama: bir boya, bir sual

Metilen mavisi əsasi (kationik) boyadır. Onun rəngli ionu müsbət yük daşıyır və hüceyrədəki mənfi yüklü strukturlara, o cümlədən nuklein turşularına və səthdəki turşu qruplarına bağlanır. Buna görə hüceyrələr açıq rəngli fonda mavi görünür. OpenStax boyama fəslində bu pozitiv boyama prinsipini təsvir edir. Boyanın kationu metilen mavisinin kimyasına dair məlumat mənbəyində ətraflı təsvir edilən kiçik, yastı fenotiazin ionudur; xlorid əks-ionu rənglənməni təmin etmir.

Standart tədris protokolu məqsədli şəkildə sadədir: nazik yaxma hazırlayın, havada qurudun, istiliklə fiksasiya edin, üzərini təxminən bir dəqiqə müddətinə təqribən 1% sulu metilen mavisi məhlulu ilə örtün, su ilə ehtiyatla yaxalayın, hopdurucu kağızla qurudun və yağ immersiyası ilə yoxlayın. LibreTexts tədris protokolunda məhz bu 1%-lik, bir dəqiqəlik variant verilir, eyni zamanda bəzi laboratoriyaların müddəti uzatdığı qeyd olunur. Nə mordant, nə rəngsizləşdirici, nə də ikinci boya var. Əsas məqam məhz onların olmamasıdır. Yalnız bir boya olduqda və boya seçici şəkildə çıxarılmadıqda, boyanı bağlayan bütün hüceyrələr sonda eyni rəngdə olur.

E. coli üçün gözlənilən görüntü tək, cüt və ya kiçik qruplar şəklində yerləşən mavi çöpvari hüceyrələrdir (basillərdir). Mavi rəng boyadan gəlir. Çöpvari forma isə orqanizmin öz xüsusiyyətidir. Lakin bu birləşmə orqanizmi müəyyən etmir, çünki bir çox növ çöpvaridir və bir çox çöpvari hüceyrə sadə boyamada mavi rəng alır. ATCC mikrobioloji kultura təlimatında nəticənin yalnız morfologiya ilə məhdudlaşdığını açıq şəkildə bildirir. Düzgün hesabat belədir: “mavi basillər müşahidə edildi.” Forma və düzülüşdən kənar hər hansı nəticə üçün əlavə sübut lazımdır.

Qram boyaması: dörd reagent, bir davranış sınağı

Qram boyaması differensial boyama üsuludur. Bütün hüceyrələr eyni ardıcıllıqdan keçirilir və hansı hüceyrələrin ilk boyanı saxladığı, hansılarının isə itirdiyi müşahidə olunur. Amerika Mikrobiologiya Cəmiyyətinin Qram boyaması protokolları standart dördmərhələli ardıcıllığı müəyyən edir: kristal violet (ilkin boya), Qram yodu (mordant), spirt və ya aseton-spirt (rəngsizləşdirici), sonra isə safranin (əks boya).

Standart tədris modeli bu ayrılmanı hüceyrə örtüyünün quruluşu ilə izah edir. Qram-müsbət hüceyrələrin qalın peptidoqlikan divarı spirtlə yuma zamanı susuzlaşır və kristal violet–yod kompleksini saxlayır. Qram-mənfi hüceyrələrdə isə nazik peptidoqlikan təbəqəsi ilə yanaşı, rəngsizləşdiricinin pozduğu lipidlərlə zəngin xarici membran var. Buna görə kompleks yuyulub çıxır və hüceyrələr daha sonra safranini qəbul edir. NCBI Bookshelf-dəki Qram boyaması icmalı hüceyrə divarına əsaslanan bu izahı verir. Mütəxəssislər əlavə edirlər ki, prosesin tam fiziki-kimyəvi mexanizmi təkcə divarın qalınlığından daha mürəkkəbdir. Lakin laboratoriyada nəticəni şərh etmək üçün bu davranış qaydası qüvvədə qalır: bənövşəyi rəng boyanın saxlandığını, çəhrayı rəng isə əvvəl itirildiyini, sonra əks boyama aparıldığını göstərir.

İllüstrativ panellər. Üsulların müqayisəsi üçün üslublaşdırılmış rəsmlərdir, kamera ilə çəkilmiş mikrofotoşəkillər deyil. Məntiqi öyrətmək üçün rənglər sadələşdirilib: sadə boyamada bir rəng, Qram rəngsizləşdirməsindən sonra iki rəng.

Metilen mavisi Qram boyamasında istifadə edilə bilərmi

Bu sual iki cür başa düşülə bilər və hər biri fərqli cavab tələb edir.

Birinci məna: metilen mavisinin bir dəfə tətbiqi bütün Qram ardıcıllığını əvəz edə bilərmi? Xeyr. Yod, rəngsizləşdirici və əks boya olmadan differensial mərhələ yoxdur, buna görə Qram kateqoriyası yoxlanılmır. Yalnız metilen mavisi tətbiqindən sonra mavi görünən sahə, boya şüşəsi Qram reagentlərinin yanında dursa belə, sadə boyamanın nəticəsidir. Bunu Qram nəticəsi kimi qeyd etməyin.

İkinci məna: metilen mavisi 4-cü mərhələdə əks boya kimi safranini əvəz edə bilərmi? Funksional baxımdan o, rəngsizləşdirilmiş hüceyrələri boyaya bilər və dərslik tapşırığı belə əvəzləmədən sonra Qram-müsbət hüceyrələrin bənövşəyi, Qram-mənfi hüceyrələrin isə mavi olacağını nəzərdə tutur. Bu məntiq əsaslıdır, çünki düzgün rəngsizləşdirilmiş Qram-mənfi hüceyrələr demək olar ki, rəngsizdir və başqa kationik boyanı qəbul edəcək. Lakin bu, standart protokol deyil. ASM protokolları safranini nəzərdə tutur; bəzi variantlarda əsasi fuksin kimi qəbul edilmiş alternativlər göstərilir, metilen mavisi isə göstərilmir. Praktik çətinlik də var: mavini bənövşəyidən ayırmaq çəhrayını bənövşəyidən ayırmaqdan daha çətindir, xüsusən yeni başlayanlar üçün və mikroskop lampaları zəiflədikdə. Tədris işlərində və nəticənin əhəmiyyət daşıdığı bütün hallarda protokolunuzda göstərilən əks boyadan, adətən safranindən istifadə edin. Metilen mavisi ilə əks boyamanı isə standart üsulun bərabərhüquqlu əvəzi deyil, nümayiş variantı kimi qəbul edin.

Metilen mavisinin digər tək boyalı variantlarla necə müqayisə olunduğu barədə əlaqəli sual sadə bakterial boyamaların müqayisəsində izah edilir.

E. coli-nin metilen mavisi ilə boyanması nəyi sübut edir, nəyi etmir

E. coli Qram-mənfi çöpvari bakteriyadır, lakin bu cümlə bir neçə üsuldan əldə edilən faktları birləşdirir: morfologiya mikroskopiyadan, Qram reaksiyası Qram boyamasından, kimliyin müəyyənləşdirilməsi isə kultivasiya ilə yanaşı biokimyəvi və ya molekulyar sınaqlardan gəlir. Metilen mavisi ilə boyanmış yaxma yalnız birinci hissəyə töhfə verir. O, boyanmış nümunədə çöpvari hüceyrələrin mövcud olduğunu və onların necə düzüldüyünü göstərir. Rəngsizləşdirmə sınağı aparılmadığı üçün Qram reaksiyasını müəyyən etmir. Bu ayırdetmə səviyyəsində bir çox növün çöpvari hüceyrələri oxşar göründüyü üçün növü də müəyyən etmir.

Hesabatlarda təkrarlanan səhv məhz burada yaranır. Hesabatı yazan şəxs əvvəlcədən bildiyi məlumatı (“bu kultura E. coli olmalıdır və E. coli Qram-mənfidir”) müşahidə sətrinə daxil edir. Nəticədə preparat əslində fərz edilmiş məlumatı təsdiqləyirmiş kimi görünür. Daha düzgün hesabat məlumat səviyyələrini ayırır: “Metilen mavisi ilə sadə boyama: mavi basillər müşahidə edildi; yalnız morfologiya qiymətləndirildi, Qram kateqoriyası yoxlanılmadı.” Sonra, Qram boyaması nəzarət nümunələri ilə düzgün aparılıbsa: “Qram boyaması: çəhrayı çöpvari hüceyrələr, Qram-mənfi nəticəyə uyğundur.” Növün müəyyənləşdirilməsi daha sonra identifikasiya prosesindən əldə edilir, təkcə rəngdən deyil.

Nəticələrin şərhi üçün praktik bələdçi

Laboratoriya masasında bu qərar qaydasından istifadə edin. Bütün hüceyrələr eyni rəngdədirsə və protokolda rəngsizləşdirici olmadan bir boya istifadə edilibsə, sadə boyama aparmısınız. Formanı, təxmini ölçünü və düzülüşü qeyd edin. Bununla kifayətlənin. Protokolda məlum müsbət və mənfi nəzarət nümunələri ilə kristal violet, yod, rəngsizləşdirici və əks boya tətbiq edilibsə, Qram boyaması aparmısınız. Rəngi və morfologiyanı birlikdə qeyd edin: zəncir şəklində bənövşəyi kokklar, çəhrayı çöpvari hüceyrələr və s.

Qarışıqlığın çoxu üç səhvdən qaynaqlanır. Birincisi, mavi çöpvari hüceyrələri E. coli-nin təsdiqi kimi həddindən artıq şərh etməkdir. İkincisi, metilen mavisi ilə boyanmış preparatı dəftərdə “Qram boyaması” başlığı altında qeyd etməkdir; bu, sonrakı oxucuların qeydi yanlış anlamasına səbəb olacaq. Üçüncüsü, əks boyaları düşünmədən dəyişmək, sonra isə rəng palitraları eyni imiş kimi müxtəlif laboratoriyaların rənglərini müqayisə etməkdir. Hər səhvin həlli eynidir: həqiqətən aparılmış üsulun adını qeyd edin və yalnız həmin üsulun yoxladığı nəticəni bildirin.

Sadə boyama məhz məhdud nəticə verdiyi üçün dəyərlidir. O, sürətlidir, kiçik texniki sapmalara dözümlüdür və sual morfologiya ilə bağlı olduqda kifayətdir: nəsə varmı və hansı formadadır? Sual təsnifatla bağlıdırsa, differensial sınaq aparın. Mavi preparat hüceyrələrin necə göründüyünü bildirir. Bənövşəyi və ya çəhrayı preparat onların divarlarının necə davrandığını bildirir. Bu preparatlardan heç biri təkbaşına növü müəyyən etmir.