Metilen mavisi və autofagiya: AMPK, mTOR və neyronlarla aparılan təcrübələr

Təsəvvür edin ki, hüceyrələrlə təcrübə aparır, metilen mavisi əlavə edir və blotunuzda LC3-II adlanan zülal zolağının tündləşdiyini görürsünüz. Birləşmənin "autofagiyanı gücləndirdiyini" elan edib davam etmək cazibədar görünür. Lakin belə bir şərhə hələ tezdir. Daha tünd LC3-II zolağı hüceyrənin daha çox təmizləyici vezikul yaratdığını göstərə bilər; yaxud parçalanma mərhələsi bloklandığı üçün vezikulların yığıldığını ifadə edə bilər. Bu iki şərh əks istiqamətlərə işarə edir və metilen mavisinin neyronlara təsiri barədə elmi ədəbiyyatda hər iki növ dəlilə rast gəlinir. Bu məqalədə əslində nəyin ölçüldüyü hər analiz üzrə nəzərdən keçirilir.

Burada tədqiq edilən forma — makroautofagiya — hüceyrənin materialları kütləvi şəkildə təkrar emal etməsi prosesidir. Faqofor adlanan membran kisə köhnəlmiş zülalların və orqanellərin ətrafında böyüyür, qapanaraq autofaqosom əmələ gətirir, lizosomla birləşir və onun yükü parçalanaraq təkrar istifadə üçün sərbəst buraxılır. Neyronlar bu prosesdən asılıdır, çünki bölünmürlər və bölünmə yolu ilə zədələnmiş hissələrin hüceyrədaxili payını azalda bilmirlər. Təkrar emal dayandıqda tullantılar yığılır. Proses işlədikdə isə hüceyrə stress şəraitində özünə lazım olan struktur vahidlərini geri qazanır.

Hipokamp hüceyrələri ilə aparılan bir təcrübə nə göstərdi

Əsas induksiya tədqiqatında 24 saat serumdan məhrum edilərək stressə məruz qoyulmuş HT22 siçan hipokamp hüceyrələrindən istifadə edilmişdi. Bu şərait böyümə amillərini və trofik siqnalları aradan qaldırır, həm apoptozu, həm də autofagiyanı başladır. Tədqiqatçılar bildirmişdilər ki, metilen mavisi hüceyrə ölümünü dozadan asılı şəkildə azaldır və bu qoruyucu təsir makroautofagiya əlamətləri ilə müşayiət olunur.

Marker nəticələri konkret idi. Təxminən 20 nM metilen mavisindən başlayaraq diffuz LC3B boyanması nüvəətrafı nöqtəvari ocaqlara yenidən paylanırdı; ən güclü LC3-I və LC3-II cavabı isə təxminən 1 μM-də müşahidə olunurdu. Həm LC3B-I, həm də LC3B-II dozadan və zamandan asılı şəkildə artırdı. Əsas məqam budur ki, tədqiqat qrupu statik LC3 blotundan bir addım irəli getmişdi. Onlar lizosomal təmizlənməni bloklayan 10 μM xloroxin əlavə etmiş və metilen mavisi ilə işlənmiş hüceyrələrdə daha yüksək LC3-II səviyyəsi ilə yanaşı p62-nin sabitləşdiyini aşkar etmişdilər. Bu mənzərə sadəcə yığılmadan çox, lizosomdan asılı dövriyyəni dəstəkləyir. Onlar həmçinin xloroxinin antiapoptotik təsiri qismən geri çevirdiyini göstərmişdilər; bu da həmin modeldə qorunmanı autofagiya və lizosom yolu ilə əlaqələndirir.

Siqnallaşma ilə bağlı nəticə ən çox yanlış təqdim olunan hissədir. Fosforlaşmış AMPK və onun aşağı axın hədəfi olan fosforlaşmış ACC ilə qiymətləndirilən AMPK siqnallaşması 12 və 24 saatda dozadan asılı şəkildə artırdı. Son 4 saat ərzində 20 μM konsentrasiyada tətbiq edilən AMPK inhibitoru Compound C həm ACC fosforlaşmasını, həm də LC3 aktivləşməsini azaldırdı. Bunun əksinə, fosforlaşmış mTOR-da ölçülə bilən zəifləmə müşahidə olunmurdu. Beləliklə, stressə məruz qalmış hipokamp hüceyrələrində nəticə zahirən mTOR-dan asılı olmayan yol vasitəsilə AMPK ilə əlaqəli induksiya idi. Eyni mənzərə canlı siçanlarda da müşahidə edilmişdi: metilen mavisi tətbiqi beyin qabığında və hipokampda makroautofagiya markerlərini induksiya etmişdi.

İnduksiya tamamlanmış axın demək deyil

Burada anlayışlar arasındakı fərq xüsusilə vacibdir. İnduksiya prosesin ilkin mərhələlərindəki mexanizmlərin daha çox autofaqosom yaratması deməkdir. Axın isə yükün bütün yolu keçməsi deməkdir: təcrid olunma, yetişmə, lizosomla birləşmə, parçalanma və təkrar emal. Axın testi yolun qalan hissəsini təsdiqləyənədək hər LC3-II artımı yalnız induksiyaya dair iddia olaraq qalır.

Standart axın testi LC3-II-ni bafilomisin A1 və ya xloroxin kimi vasitələrlə qısa müddətli lizosomal blokada tətbiq edilən və edilməyən şəraitdə ölçür. Tətbiq həqiqətən yaranmanı sürətləndirirsə, parçalanmanın bloklanması LC3-II-ni daha da artırmalıdır. Tandem mCherry-GFP-LC3 reportyoru ikinci bir baxış bucağı verir: strukturlar lizosomla birləşmədən əvvəl sarı işıqlanır, turş mühit GFP siqnalını söndürdükdən sonra isə yalnız qırmızı görünür. Buna görə yalnız qırmızı olan nöqtəvari ocaqların artması turş autolizosomlara keçidi dəstəkləyir. p62 zülalının azalması yükün dövriyyəsini təsdiqləyə bilər; lakin nəzərə alınmalıdır ki, p62 transkripsiyası da stressə cavab verir və mRNA səviyyəsində yoxlanmalıdır.

Aşağıdakı yoxlama siyahısı bu ədəbiyyatda istifadə edilən hər analizin nəyi ölçdüyünü və təkbaşına nəyi sübut edə bilmədiyini göstərir. Oxucular onu gələcəkdə istənilən makroautofagiya iddiasını, o cümlədən bu markerlərə əsaslanan ac qalma və uzunömürlülük arqumentlərini qiymətləndirmək üçün yenidən istifadə edə bilərlər.

Cədvəlin qarşısını aldığı bir ifadə yanlışlığına diqqət yetirin. Fosforlaşmış ACC fermentativ baxımdan inhibə olunmuş formadır. Onun artması ACC aktivləşməsini deyil, AMPK-nin siqnal çıxışını göstərir.

"Makroautofagiyanın inhibə edilməsi neyroproteksiyanı aradan qaldırdı" ifadəsi də eyni dəqiqliyi tələb edir. HT22 modelində bu, autofagiya və lizosom yoluna müdaxilənin serumdan məhrumetmə şəraitində metilen mavisinin verdiyi sağqalma üstünlüyünü aradan qaldırması deməkdir. Bu nəticə həmin hüceyrə kulturasında autofagiyanın zəruri olduğunu və ya qorunmaya töhfə verdiyini dəstəkləyir. Lakin autofagiyanın birləşmənin yeganə qoruyucu mexanizmi olduğunu müəyyən etmir, xloroxinin yalnız autofagiya vasitəsilə təsir etdiyini sübut etmir və səbəb əlaqəsi iddiasını möhkəmləndirmək üçün ATG5, ATG7 və ya ULK1-ə genetik müdaxilə lazım olardı.

Eyni mexanizmə aparan iki yol

Sadələşdirilmiş sxem bunu anlamağa kömək edir. Enerji stressi AMPK-ni artırır, AMPK ULK1 kompleksini aktivləşdirir və autofagiya başlayır. Böyümə amilləri və qida maddələri mTORC1-i artırır, mTORC1 ULK1-i inhibə edir və autofagiya başlamır. ULK1-dən sonrakı mərhələlərdə Beclin-1 və VPS34 kompleksi faqoforun yaranmasını başladır, LC3-I lipidləşərək LC3-II-yə çevrilir, autofaqosom qapanır, lizosomla birləşir və yük parçalanır; bu zaman p62 də dövriyyəyə daxil olur.

Diaqram metilen mavisi ilə bağlı hər nəticəni bu sxemdə yerləşdirir: hipokamp nəticəsi AMPK qolunun, sələf hüceyrə nəticəsi isə mTOR qolunun yanında göstərilir.

Bu yanaşma Xie-nin ikinci tədqiqatı ilə görünən uyğunsuzluğu aradan qaldırır. Çoxalan siçovul sinir sələf hüceyrələrində aparılmış ayrıca bir təcrübə göstərmişdi ki, 5 μM metilen mavisi proliferasiyanı inhibə edir və sakitlik vəziyyətinə keçidi təşviq edir. Ki67-müsbət hüceyrələr 1 və 3-cü günlərdə azalırdı, neyron istiqamətində artıq müəyyənləşmiş diferensiasiya isə pozulmurdu. Burada mexanizm mTOR siqnallaşmasının zəiflədilməsi ilə işləyirdi: ümumi mTOR və fosforlaşmış mTOR azalır, p70S6K və 4EBP1 ekspressiyası aşağı düşür, həmçinin E1, B1, D1 və D2 siklinləri zəif tənzimlənirdi. Əsas fenotip sələf hüceyrələrin sakitlik vəziyyəti idi; müəlliflər bunu stressə məruz qalmış hipokamp hüceyrələrinin qorunması ilə deyil, hüceyrə qocalmasının gecikməsi ilə əlaqələndirmişdilər.

İki məqalə arasında ziddiyyət yoxdur. AMPK və mTOR sabit açarlar deyil, şəraitə həssas inteqratorlardır. Stressə məruz qalmış, neyrona bənzər hüceyrə ölçülə bilən mTOR inhibisiyası olmadan AMPK-ni işə qoşa bilər; mitogenlə stimullaşdırılan sələf hüceyrə isə eyni birləşməyə mTOR-dan asılı böyümə mexanizmlərini zəiflətməklə cavab verə bilər. Hansı qolun üstün olacağını hüceyrə tipi, stress şəraiti, konsentrasiya və ölçmə vaxtı müəyyən edir. Metilen mavisinin mitoxondrial enerji və redoks təsirlərinin də eyni mənzərədə nəzərə alınmasının səbəbi budur: neyroproteksiyanın mexanizmlərinə dair bir icmalda təsvir edildiyi kimi, birləşmə alternativ elektron daşıyıcısı rolunu oynayır, antioksidant və antiapoptotik siqnallaşmanı işə qoşur, MAO və NOS-u inhibə edir və biogenez ilə autofagiya vasitəsilə mitoxondrial yenilənmə ilə əlaqələnir. Autofagiya çoxşaxəli təsir profilinin bir qoludur, onun hamısı deyil.

Təcrübələr nəyi göstərmir

Serumdan məhrumetmə hüceyrə kulturasında trofik və metabolik stressi modelləşdirir. Bu, bütöv orqanizmin ac qalmasını modelləşdirmir: qlükoza, amin turşuları və duzlar baza mühitində qalır, qidalanma davranışı isə yoxdur. Hüceyrə kulturasında istifadə edilən 20 nM-dən 5 μM-ə qədər konsentrasiyaları sadə hesabla insan dozalarına çevirmək olmaz, çünki sorulma, zülallara bağlanma, redoks vəziyyəti, metabolizm, toxumalarda yığılma və təsir müddəti fərqlənir.

İndiyədək insanlarda aparılan heç bir klinik sınaq metilen mavisinin pasiyentlərdə autofagik axını induksiya etdiyini göstərmək üçün nəzərdə tutulmayıb. Mexanizmlərə dair dəlillər hələ də hüceyrə, ex vivo və heyvan tədqiqatlarından ibarətdir; icmallar da klinikaya keçidlə bağlı dəlilləri ilkin hesab edir. Buna görə bu tədqiqatlar metilen mavisinin ac qalmanın təsirlərini təkrarladığını, autofagiya vasitəsilə insan ömrünü uzatdığını və ya insan beynində autofagik axını tamamladığını göstərmir. Ac qalmanı təqlid etmə və uzunömürlülük iddiaları ayrıca klinik dəlil tələb edir; metilen mavisinin başqa göstərişlər üzrə insanlarda aparılan sınaqları sadəcə əlaqəyə görə autofagiya sınaqlarına çevrilmir. Qida maddələrinin çatışmazlığından yaranan stress və uzunömürlülük modelləri üzrə tədqiqatları bu sərhədi nəzərə alaraq oxumaq lazımdır.

Oxuyacağınız növbəti məqalədə yoxlama siyahısını ardıcıllıqla tətbiq edin. Əvvəlcə hansı qolda dəyişiklik olduğunu soruşun: AMPK, mTOR, yoxsa heç biri. Sonra LC3 nəticəsinin axın testi ilə müşayiət olunduğunu, yoxsa təkbaşına təqdim edildiyini soruşun. Daha sonra yolun bloklanmasının faydanı aradan qaldırıb-qaldırmadığını və bunun hansı üsulla yoxlandığını nəzərdən keçirin. Hər üç suala cavab verən tədqiqat mexanizm barədə güclü iddia irəli sürmək üçün əsas qazanır. Yalnız birinciyə cavab verən tədqiqat isə sadəcə icazə siqnalını göstərmiş olur; yolun qalan hissəsi hələ müəyyənləşdirilməmiş qalır.