Metilen göyü niyə turşuya davamlı boyamada kontrast boya kimi istifadə olunur

Laboratoriya texniki tam boyama ardıcıllığından sonra bəlğəm yaxmasını yoxlayır. Göy fonda qırmızı çöpşəkilli bakteriyalar seçilir və hesabatda turşuya davamlı basillərin müşahidə olunduğu qeyd edilir. Ertəsi gün başqa bir preparatda qırmızı çöpşəkilli bakteriyalar olmayan yekcins göy fon görünür və nəticə vərəm üçün mənfi kimi bildirilir. Bu hesabatlardan biri preparatın əsaslandırdığından daha artıq nəticə çıxarır və həmin hesabat birincisi deyil.

Qarışıqlıq anlayış səviyyəsindədir. Texnik göy boyanı aşkarlama kimyasının bir hissəsi kimi qəbul edib, sanki metilen göyü mikobakteriyaları tapmağa kömək edirmiş. Halbuki belə deyil. Metilen göyü preparata toxunana qədər sınaq artıq başa çatmış olur. Boya yalnız fonu rəngləyir ki, nəticəni oxumaq mümkün olsun. Bu məqalə turşuya davamlı boyamada metilen göyünün məqsədini, niyə başqa rəng deyil, məhz göy rəng seçildiyini və göy fon üzərində qırmızı rəngin hansı nəticələri çıxarmağa əsas verdiyini izah edir.

Qısa cavab

Turşuya davamlı boyama üç prinsipə əsaslanan diferensial sınaqdır. İlkin boya olan karbol fuksin, mumabənzər örtüklü mikobakteriyalar da daxil olmaqla, bütün hüceyrələrə daxil edilir. Rəngsizləşdirici turşu-spirt qırmızı boyanı adi hüceyrələrdən çıxarır, lakin turşuya davamlı hüceyrələrdən çıxara bilmir. Sonra kontrast boya olan metilen göyü rəngsizləşdiricinin boyadan təmizlədiyi hər şeyi rəngləyir; beləliklə, turşuya davamlı olmayan hüceyrələr, sahib orqanizmin hüceyrələri və qalıqlar göy görünür, turşuya davamlı basillər isə qırmızı qalır. Kontrast boya rəng fərqi yaradır. Hüceyrəni turşuya davamlı edən kimyəvi prosesdə onun heç bir rolu yoxdur.

Hər mərhələ nə edir

Aşağıdakı diaqram funksiyaların bölgüsünü göstərir. Onu prosedur kimi soldan sağa oxuyun; aşağıdakı zolaq isə hər boyama qrupunun fərqli bir suala cavab verdiyini xatırladır.

Əvvəlcə nüfuzetmə baş verir. Mikobakteriyaların örtüyü qeyri-adi dərəcədə hidrofob olduğundan onlar adi sulu boyalara müqavimət göstərir; buna görə protokol boyanın daxil olmasını təmin edir. Ziehl-Neelsen üsulunda buxar əmələ gələnədək qızdırma, tərkibində fenol olan karbol fuksinin mumabənzər divardan keçməsini təmin edir. Kinyoun soyuq üsulunda istiliyi daha güclü ilkin boya tərkibi əvəz edir, bəzi dəyişdirilmiş istiliksiz variantlarda isə səthi-aktiv maddələr əlavə olunur. Amerika Mikrobiologiya Cəmiyyətinin turşuya davamlı boyama protokolları hər iki tərkibi yanaşı təqdim edir və qatılıq fərqi nəzərəçarpandır: qızdırılan üsulda hər 100 mL üçün təxminən 0.3 g bazik fuksin, soyuq üsulda isə təxminən 4 g.

İkinci mərhələ diferensiasiyadır. Adətən 97 mL 95 faizli etanolda 3 mL qatı xlorid turşusundan ibarət olan turşu-spirt, divarı xüsusi müqavimət göstərməyən hər hüceyrədən qırmızı boyanı yuyub çıxarır. Mikobakteriyalara xas lipid örtüyü bütöv olan hüceyrələr boyanı saxlayır. Bütün üsul məhz bu mərhələyə əsaslanır və aşağıda izah edildiyi kimi, icra texnikasına ən həssas mərhələ də budur.

Kontrast ən sonda yaradılır. Bu anda preparatda boyadan təmizlənmiş hüceyrələrdən ibarət, demək olar ki, rəngsiz fon üzərində qırmızı turşuya davamlı hüceyrələr var. 0.3 faiz w/v qatılığında metilen göyü həmin fonu qırmızıdan mümkün qədər fərqlənən rənglə yenidən görünən edir. Kontrast boyama qısadır: qızdırılan üsulda adətən 20–30 saniyə, bəzi soyuq üsul variantlarında isə bir neçə dəqiqəyədək davam edir; müddət boyanın öz xüsusiyyətindən deyil, protokoldan asılıdır.

Niyə bu boya və niyə göy rəng

Metilen göyü kationlu bazik boyadır, yəni onun rəngli ionu müsbət yük daşıyır və rəngsizləşdirilmiş bakteriyaların, sahib orqanizmin hüceyrələrinin və qalıqların mənfi yüklü səthlərinə bağlanır. OpenStax Mikrobiologiya bu yük məntiqini bazik boyaların ümumi prinsipi kimi təsvir edir. Lakin burada metilen göyü kimyəvi baxımdan unikal deyil. Kristal violet və safranin də bazik boyalardır. Seçim kimyəvi deyil, optik əsaslıdır.

Qırmızı çöpşəkilli bakteriyalar üçün kontrast rəngli fon lazımdır və göy rəng işıqlı sahə mikroskopiyasında qırmızı ilə ən faydalı qarşılaşdırmanı yaradır. Safranin uyğun kontrast boya olmazdı, çünki onun verdiyi çəhrayı-qırmızı rəng hüceyrədə saxlanmış karbol fuksinin rənginə çox yaxındır və prosedurun yaratdığı fərqi aradan qaldırır. Kristal violet isə nazik qırmızı basillərlə diqqət uğrunda rəqabət aparan tünd bənövşəyi fon yaradardı. Məqsədin kimyəvi proses deyil, kontrast olduğunu göstərən ən güclü dəlil boyanın əvəz edilə bilməsidir: malaxit yaşılı və parlaq yaşıl kimi yaşıl kontrast boyalar bəzi baytarlıq və dəyişdirilmiş protokollarda istifadə olunur və sınaq yenə işləyir, çünki aydın fərqlənən istənilən rəng eyni funksiyanı yerinə yetirir.

Bundan iki praktik nəticə çıxır. Birincisi, standart reseptdə pH tənzimlənməsi nəzərdə tutulmur; bu adi 0.3 faizli sulu məhlulu başqa boyama yanaşmasına aid olan Loeffler qələvi metilen göyü kimi qələvi tərkiblərlə qarışdırmayın. İkincisi, həddindən artıq boyamaq zərərlidir. Histologiya ədəbiyyatında həddən artıq sıx göy fonun azsaylı basilləri gizlədə biləcəyi xüsusi olaraq qeyd edilir; buna görə preparatı protokolun icazə verdiyindən daha uzun müddət boya altında saxlamaq heç bir fayda vermədən oxunaqlılığı azaldır.

Sınağı mümkün edən divar kimyası

Turşu-spirtin fərqləndirməsinin səbəbi mikobakterial örtükdədir. Onun struktur nüvəsi mikolil-arabinoqalaktan-peptidoqlikan kompleksidir: peptidoqlikan arabinoqalaktana bağlıdır, arabinoqalaktanın xarici uclarında isə çox uzun zəncirli mikol turşuları yerləşir və qeyri-adi dərəcədə aşağı keçiriciliyə malik, lipidlərlə zəngin xarici mikomembran yaradır. Mikobakteriyaların xarici membranı haqqında icmal bu quruluşu ətraflı təsvir edir. Maneə hər iki istiqamətdə işləyir. O, boyanın daxil olmasına müqavimət göstərir; buna görə nüfuzetmə üçün istilik və ya gücləndirilmiş ilkin boya lazımdır. O, həmçinin boyanın çıxarılmasına müqavimət göstərir; buna görə karbol fuksin içəri daxil olduqdan sonra turşu-spirt onu çıxara bilmir. Adi bakteriyalarda bu örtük yoxdur və onlar boyanı itirir. Buna görə turşuya davamlılığı fuksinin mikol turşusuna kimyəvi bağlanması kimi deyil, lipid maneəsinin yaratdığı hadisə kimi anlamaq daha düzgündür.

Bu kimyəvi xüsusiyyət geniş yayılmış bir anlaşılmazlığı da izah edir: mikobakteriyalar Qram üsulu ilə zəif və qeyri-sabit boyanır, bəzən solğun muncuqvari formalar və ya boyanmamış kölgəvari hüceyrələr kimi görünür. Onların hidrofob divarı kristal violetin nüfuzetməsini məhdudlaşdırır. Turşuya davamlı boyama dəyişdirilmiş Qram boyaması deyil. Bu, divarın başqa xüsusiyyətinə əsaslanan fərqli diferensial prinsipdir; sadə boyama ilə Qram boyamasının müqayisəsi digər iki üsulun prinsiplərini göstərir.

Üç üsul, üç sual

Bir boya ilə aparılan bakterial boyama üsullarının daha geniş qrupu üçün mikroskopik boyama atlasına baxın.

Göy fon üzərində qırmızı rəng nəyi sübut edə bilməz

Qırmızı çöpşəkilli bakteriyalar orqanizmlərin turşu-spirt təsirindən sonra karbol fuksini saxladığını göstərir. Bu tapıntı Mycobacterium tuberculosis ilə uyğun gəlir, lakin CDC-nin vərəmin diaqnostikasına dair təlimatı başqa mikobakteriyaların da turşuya davamlı olduğunu açıq şəkildə qeyd edir. Buna görə növü müəyyən etmək üçün rəng deyil, kultura və nuklein turşusu testləri lazımdır.

İcra səhvləri əsasən iki yuma mərhələsində toplanır. Yetərsiz rəngsizləşdirmə fon materialını qırmızı saxlayır və yanlış müsbət şərhlərə yol açır. Həddindən artıq rəngsizləşdirmə zəif saxlanmış ilkin boyanı çıxarır və yanlış mənfi nəticələrə səbəb ola bilir. Həddindən artıq tətbiq olunan kontrast boya azsaylı basilləri göy rəngin içində gizlədir. Qalın yaxmalar, çökmüş reagentlər və çirklənmiş yaxalama suyu da əlavə artefaktlar yaradır.

Texnika nə qədər düzgün olsa da, həssaslıq orqanizmlərin miqdarı ilə məhdudlaşır. Adi yaxma mikroskopiyası üçün hər millilitr bəlğəmdə təxminən 5,000–10,000 basil lazımdır və CDC-nin əvvəlki sübut icmallarında kultura ilə təsdiqlənmiş ağciyər vərəmi hallarına aid yaxma həssaslığı təxminən 45–80 faiz kimi göstərilib. Buna görə mənfi yaxma heç vaxt vərəmi istisna etmir. CDC-nin cari təlimatı hər yaxma ilə yanaşı kultura müayinəsini də nəzərdə tutur və ağciyər vərəmi ehtimalı nəzərdən keçirildikdə, nəticə klinik idarəetməni dəyişəcəksə, ən azı bir tənəffüs yolu nümunəsində nuklein turşusunun amplifikasiyası testini tövsiyə edir.

Praktik iş təsdiqlənmiş protokollara əsaslanmalıdır

Bu məqalə də daxil olmaqla, tədris xarakterli təsvirlər klinik iş aparmağa icazə vermir. Laboratoriyada praktik iş üçün cari CDC, APHL və ya CLSI sənədlərinə uyğunlaşdırılmış, laboratoriyanın validasiya edilmiş standart əməliyyat proseduruna əməl edin; CDC-nin Stacks arxivində saxlanan turşuya davamlı boyama üzrə istinad sənədi belə prosedurlarda reagentlərin və nəticələrin oxunmasının necə müəyyənləşdirildiyini göstərir. Vərəm nümunələri ilə iş bioloji mühafizə tələb edir: yaxmalar bioloji təhlükəsizlik şkafında hazırlanır, çünki hazırlıq zamanı aerozollar və sıçrantılar yaranır. CDC-nin laboratoriya təhlükəsizliyi təlimatı bildirir ki, hətta istiliklə fiksasiya edilmiş yaxmalarda da canlı vərəm basilləri ola bilər və onlarla yenə də çirklənmiş material kimi davranılmalıdır. CDC-nin İctimai Səhiyyə Şəkilləri Kitabxanasında M. leprae üçün yoxlanılmış, karbol fuksin və metilen göyü ilə boyanmış yaxmaya aid qeyd üsulun vərəmdən kənar tətbiq dairəsini xatırladan faydalı nümunədir: turşuya davamlı orqanizmlər axtarılan hər yerdə eyni göy fonda qırmızı kontrast istifadə olunur və diqqətlə aparılmış mənfi qiymətləndirmə də qeydə alınmağa dəyər nəticədir.

Hazır preparatın qiymətləndirilməsi

Kontrast boyanın əhəmiyyəti ilkin baxış zamanı üzə çıxır. Aşağı böyütmədə sahəni nəzərdən keçirən mikroskopist əvvəlcə yaxmanın keyfiyyətini qiymətləndirmək üçün göy fondan istifadə edir: hüceyrələrin bərabər paylanması, fokuslama üçün bütöv sahib orqanizm hüceyrələri və güclü çöküntünün olmaması. Sonra qırmızı rəngli şübhəli strukturlar məhz preparatda başqa heç nə qırmızı olmadığı üçün diqqəti cəlb edir. Təsdiqləmə yağ immersiyası altında aparılır; burada həqiqi basillər yekcins boya qalıqları kimi deyil, gözlənilən nazik, bəzən azca əyri və ya muncuqvari çöpşəkilli strukturlar kimi görünür.

Fonun boyanması hesabatın ifadələrini də müəyyənləşdirir. Qırmızı basillər olan preparat üçün turşuya davamlı basillərin müşahidə olunduğu bildirilir və çox vaxt laboratoriyanın şkalasına uyğun yarımkəmiyyət dərəcəsi də göstərilir. Qırmızı orqanizmlər olmayan preparat üçün turşuya davamlı basillərin müşahidə olunmadığı bildirilir; heç vaxt vərəm üçün mənfi nəticə kimi yazılmır. Bu fərq vacibdir, çünki göy fon boyamanın işlədiyini, hüceyrələrin kontrast boyanı qəbul etdiyini və optikanın yetərli olduğunu sübut edir, lakin aşkarlama həddindən aşağı miqdarda olan orqanizmlər barədə heç nə demir. Qırmızı strukturlar olmayan göy sahə preparat haqqında etibarlı nəticədir, pasiyent haqqında hökm deyil.

Funksiyaların bölgüsünü yadda saxlasanız, hesabatı yazmaq asanlaşar. Karbol fuksin namizəd orqanizmləri aşkar edir. Turşu-spirt sınağı həyata keçirir. Metilen göyü isə yalnız cavabı oxunaqlı edir: qırmızı olanlar turşu təsirinə baxmayaraq boyanı saxlayıb, göy olanlar isə onu itirib. Qalan hər şey — növ, miqdar və klinik məna — preparatdan kənar aparılan işdən əldə olunur.