Loefflerin qələvi və polixrom metilen mavisi boyalarının izahı

Boyama masasında yanaşı duran üç şüşənin hər birinin etiketində metilen mavisinin fərqli bir variantı göstərilə bilər. Birində 1% sulu metilen mavisi yazılıb. Digərində Loefflerin qələvi metilen mavisi. Üçüncüsündə isə polixrom metilen mavisi. İşi çox olan əməkdaş ən yaxındakı şüşəni götürür. Sonra yaxma ya çox solğun, ya həddindən artıq yekcins mavi, ya da gözlənilməz bənövşəyi çalarlarda boyanır və nəticənin günahı nümunədə görülür.

Bu, nümunə deyil, formulasiya problemidir. Üç məhlul bir-biri ilə əlaqəli boyalar ehtiva etsə də, fərqli boyama yanaşmalarına əsaslanır. Biri neytrala yaxın pH-da adi kation boyasıdır. Digəri qələvi ilə təsiri gücləndirilmiş eyni boyadır. Üçüncüsü isə artıq tək bir boya deyil, məqsədli şəkildə oksidləşdirilmiş qarışıqdır. Yanlış olanı istifadə etdikdə boyama prinsipi əlinizin altında dəyişir.

Qısa cavab

Adi sulu metilen mavisi başlanğıc variantdır: suda təxminən 1% boya, bakterial morfologiya və ümumi mikroskopiya üçün sadə kation boyası. Loefflerin qələvi metilen mavisində su ilə durulaşdırılmış spirtli ilkin məhlula az miqdarda, dəqiq ölçülmüş duru qələvi əlavə edilir. Bu, pH-nı yüksəldir və kation boyasının bakteriyaların turş xarakterli strukturlarına daha güclü bağlanmasını təmin edir. Polixrom metilen mavisi isə qələvi mühitdə oksidləşmə yolu ilə məqsədli şəkildə yetişdirilmiş metilen mavisidir. Buna görə şüşədə qalıq metilen mavisi ilə yanaşı demetilləşmiş homoloqların (azure A, azure B, azure C), tioninin və metilen bənövşəyisinin qarışığı olur və bu qarışıq müxtəlif strukturları müxtəlif çalarlarda boyayır.

Yalnız bir cümləni yadda saxlayacaqsınızsa: qələviləşdirmə boyamanın intensivliyini, polixromlaşdırma isə boyamanın rənglərini dəyişir.

Adi sulu metilen mavisi: müqayisə üçün başlanğıc nöqtəsi

Ən sadə formulasiya qələvi əlavə edilmədən və oksidləşdirilmədən suda həll edilmiş metilen mavisidir; adətən konsentrasiya 1% w/v olur. Rəngli hissəcik xlorid əks-ionu olan metiltioninium kationudur. Bu, PubChem-in metilen mavisi qeydində metiltioninium xlorid kimi təsvir edilən kiçik, yastı fenotiazin boyasıdır. Kation kimi o, nuklein turşularının fosfat skeletinə və bakteriya hüceyrə divarlarının turş xarakterli qruplarına bağlanaraq hüceyrələri açıq fon üzərində mavi rəngə boyayır.

Onun üstünlüyü nəticəsinin proqnozlaşdırıla bilməsidir. Nüvələr və bakteriyalar mavi görünür. Kontrast orta səviyyədədir. Çətin seçilən mikroorqanizmlər zəif boyana bilər; Loefflerin aradan qaldırmaq istədiyi məhdudiyyət də məhz bu idi. Bu məhlulun aid olduğu sadə bakterial boyaların daha geniş qrupu haqqında məlumat üçün bakteriyaların sadə boyanmasına dair icmala baxın. Burada da boyanın kimliyini dəqiq müəyyənləşdirmək vacibdir: metil mavisi tamamilə başqa molekuldur. Metil mavisi ilə metilen mavisinin müqayisəsində izah edildiyi kimi, kataloqda yalnız rəng adına görə axtarış etmək yanlış boya sinfinin seçilməsi ilə nəticələnə bilər.

Loefflerin qələvi metilen mavisi: eyni boya, daha güclü təsir

Klassik Loeffler resepti metilen mavisinin spirtli ilkin məhlulunu suda durulaşdırılmış qələvi ilə birləşdirir. Dərsliklərdəki variantlarda 30 mL 95% etanolda 0.3 g boya və 100 mL 0.01% sulu kalium hidroksid məhlulu göstərilir (və ya ekvivalent olaraq 30 mL doymuş spirtli metilen mavisi məhlulu, 100 mL distillə edilmiş su və 1 mL 1% KOH). Nəticədə açıq-aşkar qələvi pH-a malik, boya konsentrasiyası təxminən 0.3% olan işçi məhlul alınır. Kommersiya variantları da eyni prinsipə əsaslanır və Thermo Fisher-in mikrobioloji boyalar kataloqunda Loefflerin qələvi metilen mavisi polixrom və sulu variantlarla yanaşı, fərqli təyinatları olan ayrıca kataloq məhsulları kimi göstərilir.

Əsas rol qələviyə məxsusdur. pH-nın yüksəldilməsi nümunədəki karboksil və fosfat qruplarını deprotonlaşdıraraq mənfi yüklü sahələrin sıxlığını artırır. Spirtli ilkin məhlul isə boyanı tam həll olmuş vəziyyətdə saxlayır ki, o, həmin sahələrə monomer şəklində çatsın. Nəticədə bakteriyalar neytral sulu boya ilə müqayisədə daha sürətli və daha intensiv boyanır; adi bakterioloji yaxmada tanış tünd mavi çöpşəkilli bakteriyalar və kokklar görünür. Boyama müddəti adətən bir–üç dəqiqədir, bundan sonra su ilə yaxalama aparılır.

Klassik tətbiq Loeffler serum mühitində yetişdirilmiş Corynebacterium diphtheriae-dir: bunlar saxlanılmış polifosfatdan ibarət, güclü boyanmış metaxromatik Babes-Ernst qranulları olan nazik, çox vaxt ucları toppuzşəkilli çöplərdir. Mühitlə boyanın bu birləşməsi tarixi xarakter daşıyır; hər ikisi eyni bakterioloqun adı ilə bağlıdır və diaqnostik üstünlük qranulların kontrastında özünü göstərir. Difteriya ilə bağlı işlərdən başqa, bu boya kulturlardan hazırlanmış yaxmalar üçün ümumi bakterioloji boya kimi, klinik yaxmalarda Neisseria morfologiyasını göstərmək üçün və Qram boyamasına ehtiyac olmadığı, lakin adi sulu mavinin çox solğun qaldığı hallarda istifadə olunur. Bu, monoxrom boyadır. Turş xarakterli hər şey mavinin müəyyən bir çalarını alır. Protokol rənglə fərqləndirmə tələb etdikdə təkcə qələvi bunu təmin edə bilməz.

Bir praktik xəbərdarlıq: qələvi boya məhlulları saxlanma zamanı və karbon dioksidi udduqca keyfiyyətini itirir və çöküntü əmələ gətirir. Laboratoriyalar ya az həcmdə məhlul hazırlayır, ya da hər predmet şüşəsinin üzərinə çöküntü tökən köhnə şüşəni saxlamaq əvəzinə kataloq məhlulunu alıb onun yararlılıq müddətinə riayət edirlər.

Polixrom metilen mavisi: bir ad, bir neçə boya

Polixrom metilen mavisi eyni boyadan başlayır, lakin onu qələvi mühitdə nəzarət olunan oksidləşməyə məruz qoyur. Tarixən bu proses yetişdirmə və ya polixromlaşdırma adlandırılıb. Qələvi mühitdə saxlanaraq yetişdirmə, karbonatla qızdırma və ya dixromat kimi maddələrlə oksidləşdirmə dimetilamino əvəzləyicilərindən metil qruplarını mərhələli şəkildə ayırır. Məhsul qarışıqdır: qalıq metilen mavisi, azure B (bir metil qrupu ayrılmış), azure A və azure C (daha çox demetilləşmiş), tionin (tam demetilləşmiş) və metilen bənövşəyisi ailəsinin oksidləşmə nəticəsində yaranan yan məhsulları. Hər komponentin öz rəng çaları və toxumalara bağlanma meyli var. Buna görə qarışıq metaxromatik şəkildə boyayır: nüvələr, qranullar, musinlər və qığırdaq ayrı-ayrılıqda mavidən qırmızı-bənövşəyiyə qədər fərqli çalarlar alır.

Məşhur qan boyalarının əsasında da eyni kimya dayanır. İlk tədqiqatçılar qələviləşdirilmiş metilen mavisinin malyariya parazitinin nüvələrini bənövşəyi çalarlarda boyadığını aşkar etmişdilər. Lakin onların sulu yetişdirilmiş məhlulları qeyri-sabit idi və bir neçə gün ərzində çöküntü əmələ gətirirdi. Bənövşəyi qan boyasının necə icad edildiyinə dair icmal Malachowski və Romanowsky-nin 1891-ci ildə bu təsirdən bir-birindən asılı olmadan necə istifadə etdiyini, boya çöküntüsünü sabitləşdirmək və yaxmaları istilik tətbiq etmədən fiksasiya etmək üçün metanolun necə tətbiq olunduğunu və Giemsa-nın sonradan qarışığı dəqiq ölçülmüş azure B və eozin əsasında, qliserinlə sabitləşdirmə yolu ilə necə standartlaşdırdığını izləyir. Müasir Giemsa tipli boyalar birbaşa polixrom metilen mavisi ilə eozinin birləşməsindən törəyib; Romanowsky effektini yaradan da bu birləşmədir. Eozinlə birləşmə və azure B komponenti haqqında ətraflı məlumat üçün Romanowsky tipli boyalar və azure B–eozin qarşılıqlı təsirinə baxın.

Qarışıq olduğuna görə polixrom metilen mavisi təbiət etibarilə bu üç variant arasında ən az standartlaşdırılmış olandır. Onun dəqiq rəng balansı oksidləşmə üsulundan və dərəcəsindən asılıdır. Buna görə histologiya təchizatçıları onu saxlanaraq köhnəlmiş Loeffler məhlulu kimi deyil, özünəməxsus iş göstəriciləri yoxlanılan ayrıca məhsul kimi satırlar. Tipik tətbiqlərə mast hüceyrələrinin qranullarının, musinlərin və qığırdağın metaxromatik göstərilməsi, plazma hüceyrələrinin detallarının göstərilməsi və Goodpasture tipli polixrom üsullarla toxuma kəsiklərində Helicobacter pylori-nin göstərilməsi daxildir. Məqsəd rəngə görə fərqləndirmə olduqda bu, doğru seçimdir; protokol aydın monoxrom bakterial siluet gözlədikdə isə yanlış seçimdir.

Formulasiyaların və təyinatların müqayisəsi

Cədvələ seçim alqoritmi kimi baxın. Nümunə çox solğun boyanırsa, pH yanaşmasını dəyişin və Loeffler boyasını seçin. Hər şey boyanır, lakin heç nə fərqlənmirsə, boya yanaşmasını dəyişin və polixrom variantı seçin. Loeffler ilə boyanmış yaxmada qranullar çox yaxşı görünür, amma rəhbər nüvələrlə sitoplazmanın niyə eyni mavi rəngdə olduğunu soruşursa, cavab budur: heç bir qələvi monoxrom boya bu fərqləndirməni edə bilməz. Bu məsələ polixrom boya ailəsinə və onun qan boyası törəmələrinə aiddir.

Adi qarışıqlıqlardan qaçınmaq

Qarışıqlığın çoxu iki səhvdən qaynaqlanır. Birincisi, hər ikisi şüşədə mavi göründüyü üçün Loeffler boyasını adi metilen mavisi ilə əvəzolunan hesab etməkdir. Onların pH-sı və intensivliyi fərqlidir. Loeffler boyasının göstərildiyi yerdə neytral boya istifadə etmək protokolun məhz əsaslandığı qranul kontrastını itirir. İkincisi, hər hansı köhnə və ya təsadüfən saxlanaraq yetişmiş qələvi mavi məhlulu polixrom hesab etməkdir. Nəzarətsiz saxlanma naməlum qatılıqda naməlum qarışıq yaradır. Əsl polixrom məhlullar isə müəyyən edilmiş oksidləşmə üsulları ilə hazırlanır və qan boyaları xəttində dəqiq ölçülmüş eozinlə birləşdirilir. Tarix burada dərs verir: 1890-cı illərin qeyri-sabit sulu yetişdirilmiş məhlulları məhz nəzarətsiz qarışıqları təkrar əldə etmək mümkün olmadığı üçün metanolla sabitləşdirilmiş formulasiyalarla əvəz olundu. Yaşı məlum olmayan şüşədəki məhlulla diaqnostik preparatı boyamadan əvvəl bu dərsi xatırlamağa dəyər.

Adlandırmada dəqiqlik məsələni tamamlayır. Rəngə əsasən nəticə çıxarmaq əvəzinə, etiketdə kataloq məhsulunu (sulu, Loeffler və ya polixrom), boya miqdarını və nəzərdə tutulan tətbiqi yoxlayın. Bu üç formulasiyanın ortaq xromofor mənşəyi var. Təyinatları isə ortaq deyil.