Beteken groter suurstofverbruik meer ATP? Lesse uit metileenbloustudies

'n Geïsoleerde mitochondrion is in 'n kamer met brandstof, maar geen ADP nie. Dit verbruik suurstof stadig. Voeg ADP by en suurstofverbruik neem meervoudig toe. Wag totdat die ADP opgebruik is en suurstofverbruik daal weer. Die brandstof het nooit verander nie. Slegs die vraag na ATP het verander.

Daardie kort reeks gebeure bevat die hele onderskeid waaroor hierdie artikel handel. Suurstofverbruik meet hoe vinnig elektrone deur die respiratoriese ketting na suurstof vloei. ATP-produksie meet hoeveel van daardie vloei as bruikbare energie vasgelê word. Die twee deel 'n tussenstap, die protongradiënt oor die binneste mitochondriale membraan, en enigiets wat verander hoe nou die gradiënt aan ATP-sintese gekoppel is, kan die twee eindpunte in verskillende rigtings laat beweeg. Metileenblou is hier 'n nuttige leermeester omdat albei patrone waargeneem is: dit verhoog suurstofverbruik saam met ATP in sommige preparate, en verhoog suurstofverbruik terwyl ATP onveranderd bly of daal in ander.

Lesers wat eers die breër prentjie van elektronoordrag wil verstaan, kan begin by hoe metileenblou elektrone deur die respiratoriese ketting oordra. Lesers wat die terminologie van die vroeë suurstofeksperimente wil verstaan, kan lees wat die eerste respirasiemetings werklik getoon het.

Respirasie, ATP en die gradiënt tussen hulle

Elektrone uit NADH en FADH2 gaan die ketting by komplekse I en II binne, beweeg deur kompleks III na sitochroom c, en dan deur kompleks IV na suurstof. Die energie wat by komplekse I, III en IV vrygestel word, pomp protone uit die matriks na die intermembraanruimte. Daardie skeiding van lading en suurheid vorm die protondryfkrag, en die elektriese deel daarvan, die membraanpotensiaal, is gewoonlik die oorheersende deel.

ATP-sintase laat protone terugvloei na die matriks en gebruik die vrygestelde energie om ADP en fosfaat tot ATP te verbind. Die ketting is dus:

suurstofverbruik, dan protonpomping, dan die gradiënt, dan ATP-sintese.

Die probleem is dat protone langs ander roetes kan terugkeer. Enige terugvloei wat ATP-sintase omseil, is protonlekkasie. Lekkasie dwing die ketting om dieselfde protone weer te pomp om die membraanpotensiaal bestendig te hou, wat meer suurstof verbruik sonder om meer ATP te maak. 'n Sterk genoeg lekkasie veroorsaak ontkoppeling: suurstofverbruik styg terwyl ATP onveranderd bly of daal, en die vermorste energie word as hitte afgegee.

Toestand 3, toestand 4 en die respiratoriese beheerverhouding

Die klassieke terminologie hiervoor kom uit navorsing met geïsoleerde mitochondria. Toestand 3 is respirasie met substraat en ADP teenwoordig: ATP-sintase tap die gradiënt af, die membraanpotensiaal daal, die ketting versnel om dit te herstel, en suurstofverbruik is hoog omdat ATP vervaardig word. Toestand 4 is respirasie nadat die ADP opgebruik is: ATP-sintase raak onaktief, die gradiënt styg, die hoë membraanpotensiaal werk verdere pomping teen, en suurstofverbruik daal tot wat ook al nodig is om vir lekkasie te vergoed.

Die respiratoriese beheerverhouding, toestand 3 gedeel deur toestand 4, dui dus aan hoe nou die preparaat gekoppel is. 'n Hoë verhouding beteken dat ADP respirasie sterk beheer. 'n Dalende verhouding met 'n stygende toestand 4 beteken dat lekkasie begin oorheers. Dit is die raamwerk waarbinne die metileenblouresultate hieronder sin maak.

Een denkmodel is die moeite werd om te onthou. 'n Hoë membraanpotensiaal vertraag die ketting. Die afvoer van die potensiaal versnel dit. Die ketting reageer op hoe moeilik pomping geword het, nie direk op of ATP vervaardig word nie.

Wanneer die eindpunte saam verander

Die duidelikste voorbeeld van koppeling kom uit geïsoleerde proefkonynbreinmitochondria met geblokkeerde respiratoriese komplekse. By 100 nanomolar tot 1 micromolar metileenblou het rustende suurstofverbruik gestyg met glutamaat plus malaat, suksinaat of gliserofosfaat as brandstof, terwyl ADP-gestimuleerde respirasie onveranderd gebly het. In mitochondria waarin kompleks I of kompleks III deur 'n gifstof geblokkeer is, het die kleurstof ATP-produksie matig verhoog, membraanpotensiaal herstel en kalsiumopname verbeter. Die voorgestelde roete is 'n kortpad: die kleurstof aanvaar elektrone vóór die blokkasie en dra hulle oor aan sitochroom c, en omseil sodoende die beskadigde kompleks.

'n Tweede gekoppelde geval gebruik 'n heeltemal ander ATP-bron. In geïsoleerde breinmitochondria met geïnhibeerde ATP-sintase het metileenblou steeds respirasie op elke getoetste substraat gestimuleer. ATP-sintese het egter slegs met alfa-ketoglutaraat en glutamaat gestyg, die twee substrate wat succinyl CoA vorm. Met oligomisien wat ATP-sintase blokkeer, het die ekstra ATP uit substraatvlakfosforilering deur succinyl CoA-ligase in die sitroensuursiklus gekom, nie uit oksidatiewe fosforilering nie. Die kleurstof het ook membraanpotensiaal herstel wanneer kompleks I en ATP-sintase saam geïnhibeer is. Hier het suurstofverbruik en ATP saam verander, maar slegs waar die substraat die tweede ATP-roete moontlik gemaak het. Met suksinaat of malaat het respirasie gestyg sonder ekstra ATP. Dieselfde kleurstof, dieselfde kamer, ander brandstof, ander antwoord.

Wanneer die eindpunte uiteenloop

Die gevalle waarin die eindpunte uiteenloop, is net so goed gepubliseer en net so leersaam. In 'n studie uit 1997 met geïsoleerde rotlewermitochondria het metileenblou toestand 4-respirasie versnel in nou gekoppelde mitochondria wat suksinaat gebruik het, wat die respiratoriese beheerverhouding laat daal het. Die effek was vanaf 0.5 micromolar sigbaar en sterk by 5 micromolar, 'n konsentrasie naby plasmavlakke ná 'n binneaarse bolus van 100 milligram. By 5 micromolar het die mitochondria ook geswel, hoewel die koppelingsgebrek eers by laer konsentrasies verskyn het. Dit dui daarop dat die lekkasie die strukturele skade voorafgegaan het, eerder as om daaruit te ontstaan. In ontkoppelde mitochondria het die kleurstof respirasie op 'n versadigbare, konsentrasie-afhanklike manier gestimuleer. Suurstofverbruik het in albei preparate gestyg. ATP-sintese per hoeveelheid suurstof wat verbruik is, het nie. Dit is 'n handboekvoorbeeld van ontkoppeling saam met elektronoordrag, in dieselfde molekule.

Die opvallendste skeiding kom uit die retina. In muise met 'n AIF-tekort en fotoreseptorselle wat met rotenoon behandel is het metileenblou retinale dikte, fotoreseptormerkers en mitochondriale struktuur behou. Dit het ook die verhouding van NADH tot NAD verlaag en stresroetes gedemp, waaronder die ontvoudeproteïenrespons en mitofagie. Dit het dit gedoen sonder om die ATP-tekort reg te stel. Beskerming sonder herstelde energie beteken dat die voordeel deur redoksbalans en mitochondriale integriteit gekom het, nie deur ekstra ATP nie. Enigiemand wat die oorlewing van die weefsel met herstelde energieproduksie gelykstel, sou daardie eksperiment heeltemal verkeerd interpreteer.

Die werk met breinmitochondria voeg 'n kostekolom by dieselfde grootboek. Dieselfde lae konsentrasies wat bio-energetika verbeter het, het ook waterstofperoksiedvorming onder elke getoetste toestand verhoog en die verwydering daarvan vertraag. Dit is met 'n gekalibreerde Amplex-toets gemeet, eerder as met 'n niespesifieke kleurstof. Meer ATP en meer oksidant het saamgegaan.

'n Praktiese kontrolelys vir die lees van resultate

Vier vrae onderskei 'n gekoppelde resultaat van 'n ontkoppelde een.

Eerstens, watter eindpunt werklik gemeet is. Suurstofverbruik alleen kan nie ATP aandui nie. ATP-sintese, membraanpotensiaal en die respiratoriese beheerverhouding voeg elk 'n stukkie inligting by wat die suurstofelektrode nie kan waarneem nie. Die gids oor die lees van metileenblounavorsingsaansprake bespreek hierdie noukeurige hantering van eindpunte in besonderhede.

Tweedens, watter substraat die mitochondria gevoed het. Die succinyl CoA-resultaat wys dat die keuse van brandstof kan bepaal of ekstra respirasie enigsins ekstra ATP kan oplewer.

Derdens, watter konsentrasie gebruik is. Metileenblou by nanomolar- tot lae micromolar-konsentrasies in breinmitochondria het matige bio-energetiese verbeterings opgelewer, met 'n oksidantkoste; 'n halwe micromolar en hoër het koppeling in lewermitochondria verswak; 5 micromolar het ook swelling veroorsaak. Konsentrasie is deel van die meganisme, nie bloot agtergrondinligting nie.

Vierdens, watter model die resultaat opgelewer het. Geïsoleerde mitochondria onthul die stroombane, maar intakte selle en weefsels voeg vervoer, reduksie tot die kleurlose vorm en mededingende bestemmings vir elektrone by. Laboratoriumwerk oor dosering, insluitend hoe konsentrasie en protokol metileenblou se uitwerking vorm, is die brug tussen syfers uit die meetkamer en enige aanspraak oor 'n persoon.

Suurstofverbruik dui elektronvloei aan. ATP dui aan hoeveel van daardie vloei vasgelê is. Metileenblou kan enigeen van die twee verander, en die eksperimente hierbo toon al vier kombinasies wat daaruit volg: albei styg, respirasie styg slegs waar die substraat dit toelaat, respirasie styg terwyl koppeling afneem, en weefsel bly behoue terwyl ATP onveranderd bly. Die syfer op die suurstofelektrode is die begin van die interpretasie, nie die einde daarvan nie.