Metileenblou se absorpsiespektrum en molêre absorptiwiteit: ’n verwysing met aangeduide toestande

’n Metileenblouspektrum lyk eenvoudig totdat jy ’n getal daaruit probeer hergebruik. Een laboratorium rapporteer ’n molêre ekstinksiekoëffisiënt naby 82,000. ’n Ander rapporteer 67,000. ’n Derde rapporteer meer as 100,000. Al drie kan korrekte beskrywings van hul eie metings wees, en nie een daarvan is ’n universele konstante vir die kleurstof nie.

Die verwarring spruit uit die vermenging van twee afsonderlike begrippe. Absorbansie is ’n meting wat op ’n spesifieke oplossing in ’n spesifieke sel gedoen word. Molêre absorptiwiteit, wat dikwels as epsilon geskryf word, is ’n parameter in ’n model van daardie oplossing. Wanneer metileenblou se assosiasietoestand verander, verander die model, en dus verander die parameter ook. ’n Nuttige gewoonte is om elke koëffisiënt as ’n waarde met aangeduide toestande te hanteer: golflengte, oplosmiddel, pH of buffer, temperatuur, konsentrasiebereik en padlengte moet die getal vergesel.

Die monomeerband in verdunde waterige oplossings

In ’n verdunde waterige oplossing lê die dominante band van die metileenbloukation naby 664 tot 665 nm, en word dit algemeen binne 664 tot 668 nm aangegee, afhangend van die instrument en kalibrasiekeuses. Daardie band is die regte keuse vir kwantifisering wanneer die oplossing verdun genoeg is dat die meeste van die kleurstof monomeries is.

Drie literatuurwaardes wys waarom die toestande belangriker as die kerngetal is. Kleinavorsers wat waterige monsters onder ongeveer 7 micromolar in 1 cm-selle gehou het, het ’n epsilon van ongeveer 82,000 M-1 cm-1 by 665 nm gerapporteer. Daardie waarde is buitengewoon goed gedokumenteer as ’n empiriese kalibrasiehelling vir baie verdunde waterige monsters. ’n Latere primêre kalibrasie in gedeïoniseerde water, met 2.34 tot 37.52 micromolar en ’n padlengte van 1 cm, het ongeveer 67,100 M-1 cm-1 by 665 nm vir die totale kleurstof opgelewer. Die laer resultaat is verwag, nie teenstrydig nie, omdat die boonste helfte van daardie kalibrasiebereik reeds ’n beduidende hoeveelheid dimeer bevat. ’n Derde waarde, ongeveer 73,460 M-1 cm-1 by 664 nm, kom uit werk by pH 6.86 en 293 K waarin die waargenome spektrum in monomeer- en dimeerkomponente ontbind is, soos opgesom in ’n onlangse kritiese oorsig van metileenblou se fotofisika. Daardie getal verteenwoordig ’n monomeerkomponent wat deur dekonvolusie verkry is, nie ’n direkte helling van absorbansie teenoor totale kleurstof nie.

Die praktiese punt: kies die koëffisiënt waarvan die toestande met jou monsters ooreenstem, of doen jou eie kalibrasie. Moenie 82,000 in ’n bepaling met ’n 30 micromolar-oplossing in fosfaatbuffer gebruik en aanvaar dat lineariteit steeds geld nie.

Die skouer by korter golflengtes is ’n mengsel

Namate die konsentrasie styg, word ’n skouer naby 600 tot 615 nm groter relatief tot die 664 nm-piek. Moderne werk plaas die H-tipe dimeerbydrae gewoonlik naby 605 tot 610 nm. Die globale spektrale analise van metileenblou in water onderskei ’n dimeermaksimum by 607 nm en ’n maksimum vir ’n hoër aggregaat by 600 nm, met monomeerresonansiekomponente by 664 en 650 nm. Die volledige teks is beskikbaar via die ooptoegangsrekord vir PMID 33251415.

Daardie skouer moet nie as suiwer dimeerabsorbansie aangedui word nie. Monomeer-vibroniese struktuur dra ook in dieselfde gebied by, dus is die gemete hoogte ’n superposisie. Een globale passing het bevind dat ’n monomeer-plus-dimeermodel nie oor die volle bereik van 1.1 micromolar tot 3.4 millimolar voldoende was nie, terwyl die toevoeging van ’n tetrameer die beste passing gelewer het, met ’n tetrameersein wat reeds onder 34 micromolar waarneembaar was. Die gepaste komponentsterktes was hoog: ongeveer 107,800 M-1 cm-1 by 664 nm vir die hoofmonomeerkomponent, ongeveer 101,400 vir die dimeer by 607 nm, en ongeveer 138,500 vir die tetrameer by 600 nm, in ongebufferde gedeïoniseerde water met natriumchloried van 0 tot 0.15 M en temperature van 282 tot 333 K. Dit is komponente wat met behulp van ’n model onderskei is, en hulle moet dus nie in die plek van ’n empiriese Beer-Lambert-helling gebruik word nie.

Die sterkte van dimerisasie is direk gekwantifiseer. By pH 6.86 en 293 K het een studie ’n dimerisasiekonstante naby 3,900 M-1 verkry. Daardie grootte verklaar waarom ’n 5 micromolar-werkoplossing byna lineêr optree, terwyl ’n 50 micromolar-voorraadoplossing dit nie doen nie. ’n Nuttige kontrole tydens metodeontwikkeling is die verhouding van absorbansie naby 610 nm tot absorbansie naby 665 nm. Wanneer daardie verhouding met konsentrasie toeneem, beskryf epsilon by 664 nm nie meer een onveranderlike spesie nie.

Oor ’n konsentrasie-interval wat oorheers word deur een paar wat onderling omskakel, kan spektra ’n isosbestiese punt deel, wat eksperimenteel naby 625 nm in waterige reekse lê. ’n Duidelike, vaste punt is in ooreenstemming met twee dominante spesies. Wanneer die punt verskuif of verdwyn namate die konsentrasie styg, beskou dit as ’n waarskuwing dat hoër aggregate of verskuiwende ewewigte betrokke geraak het, nie as ’n instrumentfout nie.

Oplosmiddel, pH en temperatuur verskuif die spektrum

Water bevorder assosiasie. Die toevoeging van dimetielsulfoksied onderdruk dimerisasie, verskuif absorpsie- en fluoressensiemaksima na langer golflengtes, en verhoog die fluoressensiekwantumopbrengs ongeveer viervoudig, volgens die oplosmiddelstudie van metileenblou in water- en DMSO-mengsels, geïndekseer as PMID 30933781. Daardie werk behandel waterige spektra as ’n monomeer-dimeerewewig met monomeerabsorbansie naby 650 tot 670 nm en dimeerabsorbansie naby 580 tot 615 nm, en lei dimerisasiekonstantes af uit die spektra by 293.15 K.

Alkohole verskuif sowel die posisie as die skynbare sterkte, maar skakel nie aggregasie uit nie. In een primêre vergelyking by 31.3 micromolar en kamertemperatuur, gerapporteer in ’n oplosmiddelstudie van metileenblou, was die maksimum by langer golflengtes 665 nm in water maar 655 nm in metanol, met skynbare waardes vir die totale oplossing naby 37,100 in water en 60,800 in metanol. ’n Afsonderlike validering in absolute etanol by 298 K het ’n maksimum by 655 nm met epsilon naby 68,000 opgelewer.

Gewone pH-veranderings verskuif die spektrum minder as wat baie protokolle aanneem. Die kritiese oorsig wat hierbo aangehaal is, rapporteer dat die maksimum van ongeveer pH 2 tot pH 12 naby 665 nm gebly het, met slegs klein veranderinge in sterkte tot en met pH 11. Die identiteit van die buffer en die ioniese sterkte kan resultate net soveel as die nominale pH verskuif; teken dus die werklike buffer en sout aan, nie net die pH-meterlesing nie. Sterk suur of sterk alkali is ’n afsonderlike geval omdat die kleurstof ’n chemiese verandering kan ondergaan eerder as omkeerbare assosiasie. Temperatuur en sout verskuif ook die ewewig, en daarom het die waterstudie van 2020 albei doelbewus gevarieer.

Meet sodat die getal geldig bly

Kwantitatiewe werk berus op die Beer-Lambert-verband: absorbansie is gelyk aan epsilon maal konsentrasie maal padlengte, tesame met bewys dat die lineêre interval werklik onder jou toestande geld.

Gebruik ’n 1 cm-sel vir werk met lae micromolar-konsentrasies. Met epsilon naby 82,000 gee 5 micromolar ’n absorbansie naby 0.41 en 10 micromolar ongeveer 0.82. Vir metings wat op die monomeer in gewone water fokus, is dit veiliger om naby of onder ongeveer 5 tot 7 micromolar te bly as om tot diep in die tientalle micromolar te kalibreer. Vir gekonsentreerde voorraadoplossings, verkort die padlengte eerder as om absorbansie ver bo 1 te aanvaar.

Gebruik die identiese matriks vir die blanko: dieselfde watergraad, dieselfde ko-oplosmiddelfraksie, dieselfde buffer en soute, sonder die kleurstof. Berei kalibrasiestandaarde in daardie selfde matriks by dieselfde temperatuur voor. Skandeer die volle sigbare gebied tydens ontwikkeling, verkieslik ongeveer 550 tot 750 nm, eerder as om ’n enkele golflengte te meet. Volg die vorm, nie net die hoogte nie. As reeksverdunning die genormaliseerde vorm verander, is die stelsel chemies afhanklik van konsentrasie. ’n Stabiele maksimum en ’n stabiele verhouding van 610 tot 665 nm is sterker bewys van ’n aanvaarbare bereik as bloot ’n hoë R-kwadraat.

Dokumenteer die reagensvorm. Kommersiële materiaal kan watervrye metieltioniniumchloried of ’n hidraat soos die trihidraat wees, dus moet die molêre massa wat vir voorraadoplossingberekeninge gebruik word, met die inhoud van die werklike bottel ooreenstem. Hierdie stap alleen verklaar ’n deel van die verskille tussen nominale molêre konsentrasies in verskillende laboratoriums. Soortgelyke noukeurigheid geld wanneer resultate in kwantitatiewe bepalingsberekeninge gebruik word, wanneer spektra stabiliteitskontroles van formulerings ondersteun, en wanneer onsuiwerheidsprofiele ’n hersiening van suiwerheid en spesifikasies vereis.

Opsomming met aangeduide toestande

Gebruik hierdie tabel as ’n beginsjabloon vir ’n laboratoriumrekord, nie as ’n bron van uitruilbare konstantes nie.

Metileenblou se absorbansiegolflengte is dus ’n kort antwoord met ’n lang voetnoot. Rapporteer die piek wat jy gemeet het, in die oplossing wat jy gemeet het, by die konsentrasie wat jy gemeet het. Daardie gewoonte keer dat een waarde vir ’n verdunde waterige oplossing naby 664 nm in ’n valse universele konstante verander.