Methylene blue àti nitric oxide: NOS, cGMP, àti ìfiránṣẹ́ àmì nínú àwọn ọ̀nà ẹ̀jẹ̀

Ìbéèrè náà dà bí ohun tó rọrùn: ṣé methylene blue ń dènà nitric oxide? Nínú yàrá ìwádìí, ìdáhùn náà pín sí ìbéèrè mẹ́rin ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, ọ̀kọ̀ọ̀kan sì ní àyẹ̀wò ìdánwò tirẹ̀. Dídà wọ́n pọ̀ ni ìdí pàtàkì tí àwọn àkọsílẹ̀ nípa methylene blue àti nitric oxide fi máa ń dà bí èyí tí ó dájú ṣùgbọ́n tí kò ṣe kedere.

Wo àmì nitric oxide bí ẹ̀wọ̀n tó ní ìsopọ̀ mẹ́rin. A ń ṣe ìkọ̀wé àbùdá kan láti ṣe nitric oxide synthase. Ensáyímù náà ń yí arginine padà sí nitric oxide. Gáàsì náà ń tàn dé ibi tí ó fẹ́ ṣiṣẹ́ kí ó tó ṣe ìhùwà kẹ́míkà pẹ̀lú ohun mìíràn. Soluble guanylate cyclase ń rí i, ó sì ń ṣe cyclic GMP. Àwọn ìwádìí tí a ti tẹ̀ jáde ti fi ipa methylene blue hàn ní gbogbo ìsopọ̀ wọ̀nyí, ṣùgbọ́n ẹ̀rí náà wá láti inú àwọn ètò ìdánwò tó yàtọ̀, àwọn ìfojúsùn tó yàtọ̀, àti àwọn isoform tó yàtọ̀. Àbájáde ní ìsopọ̀ kan kò fi hàn pé ìṣe kan ṣẹlẹ̀ ní òmíràn.

Ẹ̀wọ̀n ìṣiṣẹ́ àṣà, ní èdè tó ṣe kedere

Nínú ògiri ọ̀nà ẹ̀jẹ̀, ìtẹ̀lé ìṣiṣẹ́ tí a mọ̀ sábà máa ń rí báyìí. Ohun amúnilára kan ń ṣiṣẹ́ lórí sẹ́ẹ̀lì endothelium. Endothelial nitric oxide synthase, tí a ń pè ní eNOS tàbí NOS3, ń mú ìwọ̀nba nitric oxide kékeré jáde fún ìṣẹ́jú díẹ̀. Gáàsì náà ń tàn wọ inú sẹ́ẹ̀lì iṣan dídán tó wà lẹ́gbẹ̀ẹ́ rẹ̀, ó ń so mọ́ heme tí irin inú rẹ̀ wà ní ipò ìdínkù nínú soluble guanylate cyclase, ó sì ń mú yíyí GTP padà sí cyclic GMP yára. Cyclic GMP ń mú protein kinase G ṣiṣẹ́, ìṣàkóso calcium ń yí padà, iṣan náà sì ń sinmi.

Ẹ̀wọ̀n ìṣiṣẹ́ kejì tún wà tí ó yẹ kí a yà sọ́tọ̀. Nígbà àkóràn tàbí ìfarahàn sí cytokine, àwọn sẹ́ẹ̀lì ń ṣe ìkọ̀wé ensáyímù mìíràn, inducible nitric oxide synthase tàbí iNOS, tí a tún ń pè ní NOS2. Ó ń ṣe nitric oxide jáde ní ìwọ̀nba tó pọ̀ sí i àti fún àkókò tó gùn ju eNOS lọ. Isoform kẹta, neuronal NOS tàbí nNOS, jẹ mọ́ àyíká ìṣiṣẹ́ mìíràn. Nígbà tí àpilẹ̀kọ ìwádìí bá sọ nitric oxide synthase láì sọ isoform náà pàtó, dúró kí o sì ṣàyẹ̀wò èyí tí a wọ̀n. Àkótán bí methylene blue ṣe ń gbé àwọn elekitironi ṣe àlàyé kan náà nípa àwọn ibi tí redox ti ń ṣiṣẹ́ lápapọ̀: ohun tó ń gbé elekitironi kò ṣe ohunkóhun fúnra rẹ̀, ohun tó ń bá a ṣiṣẹ́ ní òpin kọ̀ọ̀kan sì ni ń pinnu àbájáde.

Cyclic GMP tí a wọ̀n tún jẹ́ àbájáde àpapọ̀, kì í ṣe àyẹ̀wò ensáyímù ní tààrà. Ìpele rẹ̀ ń fi iye tí cyclase ṣe hàn, lẹ́yìn yíyọ iye tí phosphodiesterases fọ́ túútúú kúrò, pàápàá PDE5 nínú iṣan dídán àwọn ọ̀nà ẹ̀jẹ̀. Nítorí náà, dídín cyclic GMP kù túmọ̀ sí pé àmì díẹ̀ sí i ló dé ohun tó ń rí i. Kò fi ìsopọ̀ tí ó kùnà hàn fúnra rẹ̀.

Ìsopọ̀ 1: ensáyímù iNOS díẹ̀ sí i ni a ń ṣe

Nínú àwọn macrophage eku kékeré tí a mú ṣiṣẹ́ pẹ̀lú lipopolysaccharide bakitéríà, interferon gamma, tàbí méjèèjì, methylene blue dènà ìlọsíwájú protein iNOS tí a ń retí, ó sì tẹ RNA oníṣẹ́ iNOS mọ́lẹ̀ gidigidi nínú àwọn ìdánwò ìkọ̀wé àbùdá nínú macrophage. Apá tó fún wa ní ìmọ̀ ni ohun tí kò yí padà. Fífọ́ olùdènà I kappa B alpha túútúú, fífi phosphate kún NF kappa B àti STAT1, àti gbígbé àwọn ohun wọ̀nyẹn wọ inú kókó sẹ́ẹ̀lì dúró bí wọ́n ṣe rí ní ọ̀pọ̀lọpọ̀. Ohun tó dín kù ni sísopọ̀ wọn mọ́ DNA, tí chromatin immunoprecipitation fìdí rẹ̀ múlẹ̀ nípa fífi hàn pé wọ́n dín kù ní agbègbè promoter iNOS.

Èyí jẹ́ ipa lórí ìṣàkóso àbùdá tí ó ṣáájú iye ensáyímù tí ó wà, kì í ṣe ìdènà lójú ẹsẹ̀ sí ensáyímù kan tí ó ti wà tẹ́lẹ̀. Ó jẹ mọ́ ìfiránṣẹ́ àmì ìgbóná ara, níbi tí àwọn ohun tó ń ṣàkóso ìkọ̀wé àbùdá gbọ́dọ̀ so mọ́ promoter kí protein tó farahàn. Kò sọ ohunkóhun ní tààrà nípa eNOS tó ń ṣiṣẹ́ déédéé nínú ọ̀nà ẹ̀jẹ̀ tó wà ní ìsinmi, ó sì yẹ kí a ṣàpèjúwe rẹ̀ ní ọ̀nà yẹn.

Ìsopọ̀ 2: ensáyímù NOS tó ti wà ń ṣiṣẹ́ lọ́ra sí i

Ìwádìí kan lórí eku ńlá ṣe àyẹ̀wò ní ìpele mìíràn. Àwọn eku ńlá akọ tí wọ́n wà lójúfò gba lipopolysaccharide sínú iṣan ẹ̀jẹ̀, lẹ́yìn náà ní wákàtí mẹ́ta wọ́n gba omi iyọ̀ tàbí methylene blue ní 3 mg fún kg sínú iṣan ẹ̀jẹ̀, a sì wọ̀n ìṣiṣẹ́ nitric oxide synthase ní apá medial basal ti hypothalamus nípasẹ̀ yíyí arginine tí a ti fi àmì sí padà sí citrulline nínú ìwádìí ìṣiṣẹ́ NOS ní hypothalamus. Ìdààmú pẹ̀lú omi iyọ̀ nìkan mú ìṣiṣẹ́ kan tí kò gbára lé calcium bẹ̀rẹ̀, lipopolysaccharide sì gbé e ga sí nǹkan bí ìlọ́po mẹ́wàá ìpele ẹgbẹ́ ìṣàkóso. Methylene blue mú àwọn apá méjèèjì tí a mú bẹ̀rẹ̀ náà kúrò. Ìṣiṣẹ́ déédéé tó gbára lé calcium kò yí padà nínú àsopọ̀ yẹn ní ìwọ̀nba yẹn àti ní àkókò tí a ṣe àyẹ̀wò náà.

Ka àbájáde yẹn gẹ́gẹ́ bí a ṣe kọ ọ́ gan-an: a tẹ ìṣiṣẹ́ irú iNOS tí a wọ̀n mọ́lẹ̀ lábẹ́ àwọn ipò wọ̀nyẹn. Kì í ṣe ìwọ̀n ìfihàn àbùdá, kò sì jẹ́ ẹ̀rí pé yíyan iNOS dípò eNOS tàbí nNOS máa ń wà títí láé. Ìwádìí ensáyímù tí a ti sọ di mímọ́ mú ìkìlọ̀ yìí ṣe kedere sí i. Nínú àwọn àyẹ̀wò tààrà ti nitric oxide synthase tí a ti sọ di mímọ́, methylene blue dènà dídá citrulline sílẹ̀ pátápátá ní 30 micromolar, pẹ̀lú ìfojúsùn tó dènà ìdajì ìṣiṣẹ́ ní nǹkan bí 5.3 micromolar láìsí superoxide dismutase àti 9.2 micromolar pẹ̀lú rẹ̀, gẹ́gẹ́ bí a ṣe ròyìn nínú ìfiwéra NOS àti guanylate cyclase tí a ti sọ di mímọ́. Ìwádìí mìíràn lórí nNOS tí a ti sọ di mímọ́ tọ́ka sí oxidation heme tó so mọ́ ensáyímù náà. Ẹ̀kọ́ tó wúlò ni pé ìdènà NOS ní tààrà jẹ́ ohun gidi nínú àwọn ètò tí a ti yà sọ́tọ̀, ṣùgbọ́n a kò lè na àbájáde hypothalamus dé ìsọ̀rọ̀ gbogbogbò pé methylene blue kò kan gbogbo NOS tó ń ṣiṣẹ́ déédéé ní gbogbo ibi.

Ìsopọ̀ 3: nitric oxide ń sọnù kí ó tó dé

Ẹ̀rí tó ṣe kedere jù lọ pé ohun mìíràn yàtọ̀ sí ìdènà ensáyímù lè ṣàlàyé dídín cyclic GMP kù wá láti inú àwọn sẹ́ẹ̀lì iṣan dídán iṣan àlọ́dọ̀ ẹ̀jẹ̀ ẹ̀dọ̀fóró ehoro tí a tọ́ dàgbà nínú yàrá ìwádìí. Ètò ìdánwò náà fo NOS tí àwọn sẹ́ẹ̀lì ń ṣe fúnra wọn kọjá pátápátá nípa fífi àwọn ohun tó ń tú nitric oxide jáde kún un ní tààrà, lẹ́yìn náà ó béèrè bóyá methylene blue ṣì ń tẹ ìdáhùn cyclic GMP mọ́lẹ̀ nínú ìwádìí superoxide nínú iṣan dídán ọ̀nà ẹ̀jẹ̀.

A ṣe àyẹ̀wò ohun mẹ́ta tó ń tú nitric oxide jáde láti 1 sí 100 micromolar: S nitroso L cysteine, sodium nitroprusside, àti àfọwọ́ṣe tó dúró ṣinṣin tí a ti yọ ẹgbẹ́ amine rẹ̀ kúrò, tí a ń pè ní MPANO. Gbogbo wọn gbé cyclic GMP ga láàrín nǹkan bí ìlọ́po 1.5 àti ìlọ́po 12. Methylene blue ní 10 micromolar dènà àwọn méjì àkọ́kọ́ ní 51 sí 100 percent, kò sì yí ìdáhùn MPANO padà. Bí methylene blue bá kàn ń dènà ibi ìṣiṣẹ́ kátálísì cyclase nìkan, yíyan láàárín àwọn ohun tó ń tú nitric oxide jáde yẹn yóò ṣòro láti ṣàlàyé, nítorí gbogbo àwọn mẹ́tẹ̀ẹ̀ta ń parí sí ensáyímù kan náà tó wà ní ìsàlẹ̀ ẹ̀wọ̀n náà.

Àwọn àyẹ̀wò ìṣàkóso mẹ́ta wá so ọ̀nà ìṣiṣẹ́ náà mọ́ superoxide. Àkọ́kọ́, ṣíṣe superoxide ní òde sẹ́ẹ̀lì pẹ̀lú xanthine àti xanthine oxidase tún mú àpẹẹrẹ kan náà wá: a dènà CYSNO àti nitroprusside, a kò sì kan MPANO. Ẹlẹ́ẹ̀kejì, methylene blue mú àwọn sẹ́ẹ̀lì iṣan dídán ṣe superoxide ní ìwọ̀nba tó gbára lé ìwọ̀nba methylene blue àti àkókò, tí a wọ̀n nípasẹ̀ ìdínkù cytochrome c. Ẹlẹ́ẹ̀kẹta, superoxide dismutase dènà ìdènà náà pátápátá nígbà tí catalase kò ṣe bẹ́ẹ̀, èyí tó tọ́ka sí superoxide dípò hydrogen peroxide gẹ́gẹ́ bí ohun kẹ́míkà tó ń fa ipa náà ní tààrà nínú ètò ìdánwò yẹn.

Ẹ̀yà ìdánwò tí a ti tọ́ àwọn irú sẹ́ẹ̀lì méjì dàgbà papọ̀ yẹ kí a mẹ́nu kàn nítorí ó fi ibi tí ipa náà ti ṣẹlẹ̀ hàn. A tọ́ àwọn sẹ́ẹ̀lì endothelium lórí àwọn gíláàsì kékeré tó ń bo àpẹẹrẹ dàgbà papọ̀ fún ìgbà díẹ̀ pẹ̀lú àwọn sẹ́ẹ̀lì iṣan dídán, kí ohun tí endothelium ń tú jáde ní ìpele ìsinmi lè gbé cyclic GMP iṣan dídán ga ní ìlọ́po mẹ́ta sí mẹ́jọ. Lílo methylene blue lórí èyíkéyìí nínú àwọn apá méjì ṣáájú ìdánwò dín àmì yẹn kù, superoxide dismutase sì dá apá kan nínú ipa ìtọ́jú ṣáájú yẹn lórí endothelium padà. Ní ọ̀rọ̀ mìíràn, methylene blue kò pọn dandan láti ṣiṣẹ́ nínú sẹ́ẹ̀lì iṣan dídán tó ń rí àmì náà rárá. Ó lè dín àmì náà kù nípa yíyọ ohun tó ń gbé àmì náà kúrò nígbà tí ó ń rìn lọ sí ibi ìṣiṣẹ́ rẹ̀. Ìtọ́sọ́nà kíkà ìwádìí methylene blue ka èyí sí òfin gbogbogbò: sọ apá tí ìlò náà ti ṣẹlẹ̀ kí o tó sọ ohun molikula tí ó ń ṣiṣẹ́ lé lórí.

Pípè èyí ní ìdènà NOS kò tọ́. Kò sí ìgbésẹ̀ synthase tí a nílò kí àwọn ohun tó ń tú nitric oxide jáde lè ṣiṣẹ́, síbẹ̀ àmì náà dín kù.

Ìsopọ̀ 4: ohun tó ń rí àmì náà fúnra rẹ̀ ń dáhùn díẹ̀ sí i

Àwọn ipa tààrà lórí soluble guanylate cyclase wà, ṣùgbọ́n ìfojúsùn ṣe pàtàkì. Nínú ìfiwéra ensáyímù tí a ti sọ di mímọ́ tí a tọ́ka sí lókè, cyclase tí nitric oxide mú ṣiṣẹ́ nílò nǹkan bí 60 micromolar methylene blue fún ìdènà ìdajì ìṣiṣẹ́, ní ìfiwéra pẹ̀lú ìdènà ìdajì ìṣiṣẹ́ NOS ní nǹkan bí 5 sí 9 micromolar, kódà 1 millimolar mú ìdènà tó ga jù lọ tí kò pé pátápátá wá. Èyí jẹ́ ìyàtọ̀ nǹkan bí ìlọ́po mẹ́fà sí mọ́kànlá. Nítorí náà, a kò lè pe ìdánwò sẹ́ẹ̀lì ní ìfojúsùn micromolar kékeré tí ó dín cyclic GMP kù ní ìdènà cyclase tí a yàn pàtó nítorí iye cyclic GMP nìkan.

Ìwádìí redox tó wá lẹ́yìn náà fi ìkìlọ̀ kejì kún un: methylene blue mú cyclase tí nitric oxide ti mú ṣiṣẹ́ dá iṣẹ́ dúró nípasẹ̀ ọ̀nà tí ó yàtọ̀ sí oxidation irin heme nípasẹ̀ afẹ́fẹ́ lásán. Nítorí náà, a lè ba ìṣiṣẹ́ ohun tó ń rí àmì náà jẹ́, ṣùgbọ́n a kò tíì parí òye kẹ́míkà rẹ̀, ìyàtọ̀ ìfojúsùn náà sì túmọ̀ sí pé ó yẹ kí a kọ́kọ́ yọ àwọn ipa superoxide àti NOS kúrò lára àwọn àlàyé tó ṣeé ṣe nígbà ìfarahàn sí ìfojúsùn micromolar kékeré. Ibí yìí tún ni àyẹ̀wò ìṣàkóso phosphodiesterase ti yẹ. Àyàfi bí a bá wọ̀n tàbí dènà fífọ́ cyclic GMP túútúú, dídín àkójọpọ̀ cyclic GMP kù bá ṣíṣe díẹ̀ sí i, fífọ́ túútúú tó yára sí i, tàbí méjèèjì mu.

Ìdí tí èyí kò fi lè di ìsọ̀rọ̀ kan ṣoṣo nípa ìfúnpá ẹ̀jẹ̀

A fìdí ìsopọ̀ kọ̀ọ̀kan múlẹ̀ nínú ètò tó yàtọ̀. Ìkọ̀wé àbùdá macrophage kì í ṣe ìṣiṣẹ́ ensáyímù hypothalamus. Ìṣiṣẹ́ hypothalamus lẹ́yìn lipopolysaccharide kì í ṣe ìpele ìhámọ́ ọ̀nà ẹ̀jẹ̀ tí endothelium ń ṣàkóso ní ìsinmi. Ohun tí endothelium ń tú jáde ní ìpele ìsinmi nígbà tí a tọ́ àwọn sẹ́ẹ̀lì dàgbà papọ̀ kì í ṣe fífẹ̀ ọ̀nà ẹ̀jẹ̀ tí ohun amúṣiṣẹ́ ń fa. Àwọn sẹ́ẹ̀lì iṣan àlọ́dọ̀ ẹ̀jẹ̀ ẹ̀dọ̀fóró tí a tọ́ dàgbà pẹ̀lú methylene blue ní 10 micromolar kì í ṣe ètò ìṣàn ẹ̀jẹ̀ ènìyàn. Dídà wọ́n pọ̀ sínú ìsọ̀rọ̀ bíi pé methylene blue ń gbé ìfúnpá ẹ̀jẹ̀ ga nípa dídènà nitric oxide ń sọ àwọn ìyàtọ̀ tí a dá àwọn àyẹ̀wò ìṣàkóso sílẹ̀ láti pa mọ́ gan-an nù.

Àwọn àyẹ̀wò mẹ́ta ń jẹ́ kí àlàyé náà jẹ́ òótọ́. Àkọ́kọ́, sọ isoform náà: eNOS fún ìpele ìhámọ́ ọ̀nà ẹ̀jẹ̀ ní ìsinmi, iNOS fún ìtújáde nitric oxide tí ìgbóná ara mú bẹ̀rẹ̀, nNOS fún àwọn àyíká sẹ́ẹ̀lì iṣan ara àti díẹ̀ lára àwọn ètò ensáyímù tí a ti sọ di mímọ́. Ẹlẹ́ẹ̀kejì, sọ bí àmì nitric oxide ṣe dé: ṣíṣe rẹ̀ láti inú ara, títú u jáde láti endothelium ní ìpele ìsinmi, tàbí ohun tó ń tú u jáde pàtó bí CYSNO, nitroprusside, tàbí MPANO, nítorí ohun tó dúró ṣinṣin náà kọjú ìdènà methylene blue nígbà tí àwọn tó tètè yí padà kò ṣe bẹ́ẹ̀. Ẹlẹ́ẹ̀kẹta, sọ ìfojúsùn àti ohun tó dá ìṣiṣẹ́ padà: dídá ìṣiṣẹ́ padà nípasẹ̀ superoxide dismutase tọ́ka sí ipa superoxide, ìkùnà catalase tako pé hydrogen peroxide ni ó fa ipa náà nínú ètò ìdánwò yẹn, àfarawé xanthine oxidase fi hàn pé ọ̀nà náà tó láti fa ipa náà, àwọn àyẹ̀wò ensáyímù tí a ti sọ di mímọ́ sì ń ya ipa tààrà lórí kátálísì sọ́tọ̀ kúrò nínú pípadanu àmì nígbà tí ó ń rìn lọ.

Àkótán ṣókí ni èyí. Ó dára jù láti ka methylene blue sí ohun tó ń dà ìfiránṣẹ́ àmì nitric oxide sí cyclic GMP rú ní ọ̀pọ̀ ibi, dípò olùdènà cyclase tí ó yàn án pàtó. Ó sinmi lórí ètò ìdánwò àti ìfojúsùn: ó lè dín sísopọ̀ àwọn ohun tó ń ṣàkóso ìkọ̀wé àbùdá iNOS kù, dènà àwọn ensáyímù NOS ní tààrà, dín nitric oxide tí ó wà fún ìṣiṣẹ́ kù nípasẹ̀ ṣíṣe superoxide, kí ó sì ba ìṣiṣẹ́ cyclase tí nitric oxide mú ṣiṣẹ́ jẹ́. Ipa ìfiránṣẹ́ àmì cyclic GMP nínú àwọn ìwádìí ọ̀nà ẹ̀jẹ̀ àti ìfiwéra àwọn ohun tó ń tú nitric oxide jáde tí a lò nínú àwọn àyẹ̀wò sẹ́ẹ̀lì ṣàlàyé ẹ̀ka kọ̀ọ̀kan lára wọn ní kíkún sí i, àwọn ọ̀nà tí a lò láti ya ipa redox sọ́tọ̀ kúrò nínú ipa ensáyímù sì ṣàlàyé ìdí tí superoxide dismutase pẹ̀lú catalase àti ohun tó ń tú nitric oxide jáde tó dúró ṣinṣin fún àyẹ̀wò ìṣàkóso fi máa ń farahàn léraléra nínú àwọn àkọsílẹ̀ ìwádìí wọ̀nyí.

Iye cyclic GMP kékeré lẹ́yìn methylene blue fi ẹ̀wọ̀n tó já hàn. Àwọn àyẹ̀wò ìṣàkóso nìkan ló sọ ìsopọ̀ tí ó já.