Ìdí tí a fi ń lo búlúù methylene gẹ́gẹ́ bí àwọ̀ àfikún nínú àyẹ̀wò ìfaradà ásíìdì

Onímọ̀ iṣẹ́ yàrá kan ń wo àtànkálẹ̀ àpẹẹrẹ kẹ́lẹ́bẹ́ lẹ́yìn tí gbogbo ìpele fífi àwọ̀ sí i ti parí. Àwọn ọ̀pá pupa yọ kedere lórí ẹ̀yìn búlúù, a sì kọ sínú ìròyìn pé a rí àwọn basílì tó fara da ásíìdì. Ní ọjọ́ kejì, gíláàsì àyẹ̀wò mìíràn fi ẹ̀yìn búlúù tó dọ́gba hàn láìsí ọ̀pá pupa kankan, a sì ròyìn rẹ̀ pé kò sí ikọ́ ẹ̀gbẹ. Ọ̀kan nínú àwọn ìròyìn wọ̀nyí sọ ju ohun tí gíláàsì àyẹ̀wò náà lè fìdí múlẹ̀ lọ, kì í sì í ṣe èyí àkọ́kọ́.

Àìlóye èrò tó wà lẹ́yìn ìlànà náà ló fa ìdàrúdàpọ̀. Onímọ̀ iṣẹ́ yàrá náà ka àwọ̀ búlúù sí apá kan nínú kẹ́míkà ìṣàwárí, bí ẹni pé búlúù methylene ṣe ìrànlọ́wọ́ láti rí mycobacteria. Kò ṣe bẹ́ẹ̀. Nígbà tí búlúù methylene bá kan gíláàsì àyẹ̀wò, ìdánwò náà ti parí. Àwọ̀ náà kàn ń fi àwọ̀ sí ẹ̀yìn kí a lè ka àbájáde náà. Àpilẹ̀kọ yìí ṣàlàyé iṣẹ́ búlúù methylene nínú àyẹ̀wò ìfaradà ásíìdì, ìdí tí àwọ̀ rẹ̀ fi jẹ́ búlúù dípò àwọ̀ mìíràn, àti ohun tí pupa lórí búlúù fún ọ ní ẹ̀tọ́ láti parí èrò sí.

Ìdáhùn ní ṣókí

Fífi àwọ̀ ṣe àyẹ̀wò ìfaradà ásíìdì jẹ́ ìdánwò ìyàtọ̀ tí a gbé kalẹ̀ lórí èrò mẹ́ta. A ń fi agbára mú carbol fuchsin, àwọ̀ àkọ́kọ́, wọ gbogbo sẹ́ẹ̀lì, títí kan mycobacteria tí ògiri wọn dà bí epo-eti. Àdàpọ̀ ásíìdì àti ọtí, tó ń yọ àwọ̀ kúrò, ń yọ àwọ̀ pupa kúrò nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì lásán, ṣùgbọ́n kò lè yọ ọ́ kúrò nínú àwọn tó fara da ásíìdì. Lẹ́yìn náà, búlúù methylene, àwọ̀ àfikún, ń fi àwọ̀ sí gbogbo ohun tí àdàpọ̀ náà ti mú àwọ̀ rẹ̀ kúrò, kí àwọn sẹ́ẹ̀lì tí kò fara da ásíìdì, àwọn sẹ́ẹ̀lì ara tó gbà wọ́n lálejò, àti àwọn àjẹkù lè hàn ní búlúù, nígbà tí àwọn basílì tó fara da ásíìdì ṣì wà ní pupa. Àwọ̀ àfikún náà ń mú ìyàtọ̀ àwọ̀ hàn. Kò ní ipa kankan nínú kẹ́míkà tó ń mú kí sẹ́ẹ̀lì fara da ásíìdì.

Ohun tí ìpele kọ̀ọ̀kan ń ṣe

Àwòrán tó wà nísàlẹ̀ fi bí a ṣe pín iṣẹ́ náà hàn. Kà á láti òsì sí ọ̀tún gẹ́gẹ́ bí ìlànà iṣẹ́, kí o sì ka ìlà ìsàlẹ̀ gẹ́gẹ́ bí ìránnilétí pé ọ̀kọ̀ọ̀kan àwọn ẹbí ìlànà fífi àwọ̀ ń béèrè ìbéèrè tó yàtọ̀.

Ìwọlé ni ó kọ́kọ́ wá. Mycobacteria ń kọjú ìwọlé àwọn àwọ̀ olómi lásán nítorí ìbòrí wọn ń kọ omi sílẹ̀ ju bó ṣe wọ́pọ̀ lọ, nítorí náà ìlànà náà ń fi agbára mú àwọ̀ wọlé. Nínú ọ̀nà Ziehl-Neelsen, gbígbóná pẹ̀lú oru ń mú carbol fuchsin tó ní phenol kọjá ògiri tó dà bí epo-eti. Nínú ọ̀nà tútù Kinyoun, àdàpọ̀ àwọ̀ àkọ́kọ́ tó lágbára púpọ̀ sí i ni a fi ń rọ́pò ooru, àwọn ẹ̀yà tí a tún ṣe láìlo ooru sì ń fi àwọn ohun tó ń dín ìfàjú ojú omi kù kún un. Àwọn ìlànà àwọ̀ ìfaradà ásíìdì ti American Society for Microbiology ṣàkọsílẹ̀ àwọn àdàpọ̀ méjèèjì lẹ́gbẹ̀ẹ́ ara wọn, ìyàtọ̀ nínú ìwọ̀n agbára wọn sì pọ̀: nǹkan bí 0.3 g fuchsin alákáláì fún 100 mL nínú ọ̀nà tó ń lo ooru, ní ìfiwéra pẹ̀lú nǹkan bí 4 g fún ọ̀nà tútù.

Ṣíṣe ìyàtọ̀ ni ó tẹ̀ lé e. Àdàpọ̀ ásíìdì àti ọtí, tí ó sábà jẹ́ 3 mL hydrochloric acid alágbára nínú 97 mL ethanol tó jẹ́ 95 nínú ọgọ́rùn-ún, ń fọ àwọ̀ pupa kúrò nínú gbogbo sẹ́ẹ̀lì tí ògiri rẹ̀ kò ní ìfaradà àkànṣe. Àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ìbòrí ọ̀rá mycobacteria wọn ṣì pé ń di àwọ̀ náà mú. Ìpele yìí ni gbogbo ọ̀nà náà gbára lé, òun sì ni ó rọrùn jù lọ fún àṣìṣe ọ̀nà iṣẹ́ láti ní ipa lórí, bí a ṣe jíròrò nísàlẹ̀.

Ìyàtọ̀ àwọ̀ ni ó wá ní ìkẹyìn. Gíláàsì àyẹ̀wò náà ti ní àwọn sẹ́ẹ̀lì pupa tó fara da ásíìdì lórí ẹ̀yìn àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a ti yọ àwọ̀ kúrò nínú wọn, tí ẹ̀yìn náà fẹ́rẹ̀ẹ́ má ní àwọ̀ rárá. Búlúù methylene ní 0.3 nínú ọgọ́rùn-ún w/v ń mú ẹ̀yìn náà hàn lẹ́ẹ̀kan sí i, ní àwọ̀ tí ìyàtọ̀ rẹ̀ sí pupa pọ̀ jù lọ. Fífi àwọ̀ àfikún sí i kì í pẹ́, ó sábà jẹ́ ìṣẹ́jú-àáyá 20 sí 30 nínú ọ̀nà tó ń lo ooru, ó sì lè tó ìṣẹ́jú díẹ̀ nínú àwọn ẹ̀yà ọ̀nà tútù kan. Àkókò náà dá lórí ìlànà iṣẹ́, kì í ṣe àbùdá àwọ̀ náà fúnra rẹ̀.

Kí ló dé tí a fi yan àwọ̀ yìí, kí ló sì dé tí ó fi jẹ́ búlúù

Búlúù methylene jẹ́ àwọ̀ alákáláì tó ní ion rere; ìyẹn túmọ̀ sí pé ion rẹ̀ tó ní àwọ̀ ń gbé ẹrù iná rere, ó sì ń so mọ́ àwọn ojú tí ó ní ẹrù iná òdì lórí àwọn kòkòrò tí a ti yọ àwọ̀ kúrò nínú wọn, àwọn sẹ́ẹ̀lì ara tó gbà wọ́n lálejò, àti àwọn àjẹkù. Ìmọ̀ nípa àwọn ohun alààyè kéékèèké ti OpenStax ṣàpèjúwe ìlànà ẹrù iná yìí gẹ́gẹ́ bí ìlànà gbogbogbò tó wà lẹ́yìn àwọn àwọ̀ alákáláì. Ṣùgbọ́n búlúù methylene kò dá yàtọ̀ nípa kẹ́míkà níbí. Crystal violet àti safranin náà jẹ́ àwọ̀ alákáláì. Ohun tí ojú yóò rí ló pinnu yíyan náà, kì í ṣe kẹ́míkà.

Àwọn ọ̀pá pupa nílò ẹ̀yìn tí àwọ̀ rẹ̀ yàtọ̀ sí tiwọn, búlúù sì tako pupa lọ́nà tó wúlò jù lọ fún àyẹ̀wò maikirosikopu pẹ̀lú ẹ̀yìn ìmọ́lẹ̀. Safranin kì yóò jẹ́ àwọ̀ àfikún tó dára nítorí àwọ̀ pupa fẹ́ẹ́rẹ́ tó ń fi sílẹ̀ sún mọ́ carbol fuchsin tí sẹ́ẹ̀lì dì mú jù, ó sì máa pa ìyàtọ̀ tí ìlànà náà dá sílẹ̀ rẹ́. Crystal violet yóò fi ẹ̀yìn àwọ̀ àlùkò dúdú sílẹ̀, tí yóò bá àwọn basílì pupa tín-ín-rín dije fún àfiyèsí. Ẹ̀rí tó lágbára jù lọ pé iṣẹ́ náà jẹ́ ìyàtọ̀ àwọ̀ dípò kẹ́míkà ni pé a lè rọ́pò rẹ̀: àwọn àwọ̀ àfikún aláwọ̀ ewé bí malachite green àti brilliant green ń ṣiṣẹ́ nínú àwọn ìlànà kan fún ẹranko àti àwọn ìlànà tí a tún ṣe, ìdánwò náà sì ṣì ń ṣiṣẹ́, nítorí àwọ̀ èyíkéyìí tí ó yàtọ̀ kedere ń ṣe iṣẹ́ kan náà.

Àwọn àbájáde méjì fún iṣẹ́ gidi jáde láti inú èyí. Àkọ́kọ́, àdàpọ̀ tí a sábà ń lò kò sọ pé kí a ṣàtúnṣe pH; má ṣe da ojútùú olómi lásán yìí tó jẹ́ 0.3 nínú ọgọ́rùn-ún pọ̀ mọ́ àwọn àdàpọ̀ alákáláì bí búlúù methylene ti Loeffler, tí ó jẹ́ ti èrò fífi àwọ̀ mìíràn. Èkejì, lílo rẹ̀ lọ́pọ̀ jù ń ṣe ìpalára. Àwọn ìwé ìmọ̀ àyẹ̀wò àsopọ̀ kìlọ̀ ní pàtó pé ẹ̀yìn búlúù tó ní àwọ̀ púpọ̀ jù lè bo àwọn basílì tí kò pọ̀ mọ́lẹ̀. Nítorí náà, fífi àwọ̀ bo gíláàsì àyẹ̀wò fún àkókò tó ju èyí tí ìlànà gbà lọ ń dín bí a ṣe lè kà á kù láìsí àǹfààní kankan.

Kẹ́míkà ògiri tó mú kí ìdánwò náà ṣeé ṣe

Ìdí tí àdàpọ̀ ásíìdì àti ọtí fi lè ṣe ìyàtọ̀ wà nínú ìbòrí mycobacteria. Àárín ìṣètò rẹ̀ ni àkópọ̀ mycolyl-arabinogalactan-peptidoglycan: peptidoglycan tó so mọ́ arabinogalactan, tí àwọn ìpẹ̀kun òde rẹ̀ gbé àwọn mycolic acid onípq gígùn púpọ̀, tí wọ́n ń dá ìbòrí òde mycobacteria tó kún fún ọ̀rá sílẹ̀, tí ohun kò sì rọrùn láti kọjá sínú rẹ̀ rárá. Àtúnyẹ̀wò ìbòrí òde mycobacteria ṣàlàyé ìṣètò yìí ní ẹ̀kúnrẹ́rẹ́. Ìdènà náà ń ṣiṣẹ́ ní ìhà méjèèjì. Ó ń tako ìwọlé àwọ̀, ìdí nìyẹn tí ìwọlé fi nílò ooru tàbí àwọ̀ àkọ́kọ́ tí a mú lágbára sí i. Ó sì ń tako yíyọ àwọ̀ jáde, ìdí nìyẹn tí àdàpọ̀ ásíìdì àti ọtí kò fi lè yọ carbol fuchsin kúrò lẹ́yìn tí ó bá ti wọ inú rẹ̀. Àwọn kòkòrò lásán kò ní ìbòrí yìí, wọ́n sì ń pàdánù àwọ̀ náà. Nítorí náà, ó dára jù láti lóye ìfaradà ásíìdì gẹ́gẹ́ bí ohun tó ṣẹlẹ̀ nítorí ìdènà ọ̀rá, kì í ṣe pé fuchsin so mọ́ mycolic acid nípasẹ̀ kẹ́míkà.

Kẹ́míkà yìí tún ṣàlàyé ìṣòro kan tó wọ́pọ̀: mycobacteria kì í gba àwọ̀ dáadáa tàbí lọ́nà tó ṣeé sọ tẹ́lẹ̀ nípa ọ̀nà Gram; nígbà míì wọ́n máa ń hàn bí àwọn ìrísí fẹ́ẹ́rẹ́ tó dà bí ìlẹ̀kẹ̀, tàbí bí àwọn òjìji tí kò gba àwọ̀. Ògiri wọn tó ń kọ omi sílẹ̀ ń dí ìwọlé crystal violet lọ́wọ́. Àyẹ̀wò ìfaradà ásíìdì kì í ṣe àwọ̀ Gram tí a tún ṣe. Ó jẹ́ ìlànà ìyàtọ̀ mìíràn tí a gbé kalẹ̀ lórí àbùdá ògiri mìíràn, bí àfiwé àwọ̀ ẹyọ kan àti àwọ̀ Gram ṣe fi hàn fún àwọn ọ̀nà méjì yòókù.

Ọ̀nà mẹ́ta, ìbéèrè mẹ́ta

Fún ẹbí àwọn ọ̀nà àyẹ̀wò kòkòrò tí ń lo àwọ̀ ẹyọ kan tó gbòòrò sí i, wo àkójọpọ̀ àwòrán fífi àwọ̀ fún àyẹ̀wò maikirosikopu.

Ohun tí pupa lórí búlúù kò lè fìdí múlẹ̀

Àwọn ọ̀pá pupa túmọ̀ sí pé àwọn ohun alààyè náà di carbol fuchsin mú nígbà tí wọ́n kọjá nínú àdàpọ̀ ásíìdì àti ọtí. Àbájáde yẹn bá Mycobacterium tuberculosis mu, ṣùgbọ́n ìtọ́sọ́nà CDC fún ìdánimọ̀ ikọ́ ẹ̀gbẹ sọ ní kedere pé àwọn mycobacteria mìíràn náà fara da ásíìdì. Nítorí náà, ìdánimọ̀ ẹ̀yà nílò dídàgbà wọn nínú yàrá àti àyẹ̀wò ásíìdì nucleic, kì í ṣe àwọ̀.

Àwọn àṣìṣe ọ̀nà iṣẹ́ sábà ń ṣẹlẹ̀ ní àyíká àwọn ìfọ̀ méjì náà. Yíyọ àwọ̀ tí kò tó ń fi àwọn ohun tó wà lẹ́yìn sílẹ̀ ní pupa, ó sì lè mú kí a ka àbájáde sí rere lọ́nà àṣìṣe. Yíyọ àwọ̀ tó pọ̀ jù ń yọ àwọ̀ àkọ́kọ́ tí a kò dì mú ṣinṣin kúrò, ó sì ń kópa nínú àbájáde òdì èké. Àwọ̀ àfikún tí a fi sí i lọ́pọ̀ jù ń sin àwọn basílì tí kò pọ̀ sínú búlúù. Àwọn àtànkálẹ̀ àpẹẹrẹ tó nípọn, àwọn èròjà ìdánwò tó ti di kẹ́lẹ́ sílẹ̀, àti omi ìfọ̀ tó ti ní èérí tún ń fi àwọn àmì àṣìṣe tiwọn kún un.

Iye àwọn ohun alààyè tó wà nínú àpẹẹrẹ ń fi ààlà sí agbára ìṣàwárí, bó ti wù kí ọ̀nà iṣẹ́ mọ́ tó. Àyẹ̀wò àtànkálẹ̀ àpẹẹrẹ pẹ̀lú maikirosikopu ní ọ̀nà àṣà nílò nǹkan bí 5,000 sí 10,000 basílì nínú mílílítà kẹ́lẹ́bẹ́ kọ̀ọ̀kan, àwọn àtúnyẹ̀wò ẹ̀rí CDC àtijọ́ sì fi agbára ìṣàwárí rẹ̀ sí nǹkan bí 45 sí 80 nínú ọgọ́rùn-ún láàárín àwọn ọ̀ràn ikọ́ ẹ̀gbẹ ẹ̀dọ̀fóró tí dídàgbà kòkòrò nínú yàrá ti fìdí múlẹ̀. Nítorí náà, àtànkálẹ̀ àpẹẹrẹ tí àbájáde rẹ̀ jẹ́ òdì kò lè mú wa yọ ikọ́ ẹ̀gbẹ kúrò nínú ohun tó ṣeé ṣe. Ìtọ́sọ́nà CDC ìsinsìnyí ń pa dídàgbà kòkòrò nínú yàrá mọ́ lẹ́gbẹ̀ẹ́ gbogbo àyẹ̀wò àtànkálẹ̀ àpẹẹrẹ. Ó sì dámọ̀ràn àyẹ̀wò ìmúpọ̀ ásíìdì nucleic lórí ó kéré tán àpẹẹrẹ kan láti ọ̀nà mímí nígbà tí a bá ń ronú nípa ikọ́ ẹ̀gbẹ ẹ̀dọ̀fóró, tí àbájáde náà yóò sì yí ìṣàkóso ìtọ́jú padà.

Iṣẹ́ gidi gbọ́dọ̀ tẹ̀ lé àwọn ìlànà tí a fọwọ́ sí

Àwọn àlàyé fún ẹ̀kọ́, títí kan àpilẹ̀kọ yìí, kò fúnni ní àṣẹ láti ṣe iṣẹ́ ìṣègùn. Fún iṣẹ́ lórí tábìlì yàrá, tẹ̀ lé ìlànà iṣẹ́ boṣewa yàrá tí a ti fìdí ìṣeégbẹ́kẹ̀lé rẹ̀ múlẹ̀, tí ó sì bá àwọn ìwé CDC, APHL, tàbí CLSI ti ìsinsìnyí mu; ìwé ìtọ́kasí CDC fún fífi àwọ̀ ṣe àyẹ̀wò ìfaradà ásíìdì tí a fi pamọ́ sínú àkójọpọ̀ Stacks rẹ̀ fi bí irú àwọn ìlànà bẹ́ẹ̀ ṣe ń sọ àwọn èròjà ìdánwò àti àwọn àbájáde tí a ó kà hàn. Iṣẹ́ lórí àpẹẹrẹ ikọ́ ẹ̀gbẹ nílò ìdènà ìtànkálẹ̀: a ń pèsè àwọn àtànkálẹ̀ àpẹẹrẹ nínú àpótí ààbò ẹ̀dá alààyè nítorí ìpèsè náà ń dá àwọn patikulu kéékèèké inú afẹ́fẹ́ àti ìtàn omi sílẹ̀. Ìtọ́sọ́nà ààbò yàrá CDC sì sọ pé kódà àwọn àtànkálẹ̀ àpẹẹrẹ tí a ti fi ooru lẹ̀ mọ́ gíláàsì lè ṣì ní àwọn basílì ikọ́ ẹ̀gbẹ tó wà láàyè, a sì gbọ́dọ̀ ṣì mú wọn gẹ́gẹ́ bí ohun tó ní èérí. Àkọsílẹ̀ inú Àkójọpọ̀ Àwòrán Ìlera Gbogbogbò CDC fún àtànkálẹ̀ àpẹẹrẹ carbol-fuchsin àti búlúù methylene tí a yẹ̀ wò fún M. leprae jẹ́ ìránnilétí tó wúlò nípa bí ọ̀nà náà ṣe ń ṣiṣẹ́ kọjá ikọ́ ẹ̀gbẹ: ìyàtọ̀ pupa lórí búlúù kan náà ń ṣiṣẹ́ níbikíbi tí a bá ń wá àwọn ohun alààyè tó fara da ásíìdì, kíkà àbájáde òdì pẹ̀lú ìṣọ́ra sì jẹ́ àbájáde tó yẹ kí a ṣàkọsílẹ̀ fúnra rẹ̀.

Kíkà gíláàsì àyẹ̀wò tí ó ti parí

Àwọ̀ àfikún ń fi ìwúlò rẹ̀ hàn nígbà ìwádìí àkọ́kọ́. Onímọ̀ maikirosikopu tó ń ṣàyẹ̀wò ní ìwọ̀n fífẹ̀ tó kéré kọ́kọ́ ń lo ẹ̀yìn búlúù láti ṣe ìdájọ́ bí àtànkálẹ̀ àpẹẹrẹ ṣe dára tó: kí àwọn sẹ́ẹ̀lì tàn ká lọ́nà tó dọ́gba, kí àwọn sẹ́ẹ̀lì ara tó gbà wọ́n lálejò pé fún ṣíṣe àfiyèsí kedere, kí ohun tí ó di kẹ́lẹ́ sílẹ̀ má sì pọ̀. Lẹ́yìn náà, àwọn ohun pupa tó ṣeé fura sí ń fa ojú sí ara wọn nítorí kò sí ohun mìíràn lórí gíláàsì àyẹ̀wò tó jẹ́ pupa. Ìmúdájú ń ṣẹlẹ̀ nípasẹ̀ fífi lẹ́ńsì sínú epo, níbi tí àwọn basílì gidi ti ń fi àwọn ọ̀pá tín-ín-rín tí a retí hàn, tí wọ́n lè tẹ̀ díẹ̀ tàbí dà bí ìlẹ̀kẹ̀ nígbà míì, dípò àwọn àjẹkù àwọ̀ tó ní ìrísí kan náà káàkiri.

Fífi àwọ̀ sí ẹ̀yìn tún ń pinnu àwọn ọ̀rọ̀ tí a ó lò nínú ìròyìn. Gíláàsì àyẹ̀wò tó ní basílì pupa ni a ń ròyìn pé a rí àwọn basílì tó fara da ásíìdì, a sì sábà ń fi ìpele ìṣírò iye tí kò péye kún un gẹ́gẹ́ bí òṣùwọ̀n yàrá náà. Gíláàsì àyẹ̀wò tí kò ní ohun alààyè pupa kankan ni a ń ròyìn pé a kò rí basílì tó fara da ásíìdì, kì í ṣe pé kò sí ikọ́ ẹ̀gbẹ. Ìyàtọ̀ náà ṣe pàtàkì nítorí ẹ̀yìn búlúù ń fìdí múlẹ̀ pé fífi àwọ̀ náà ṣiṣẹ́, pé àwọn sẹ́ẹ̀lì gba àwọ̀ àfikún, àti pé ètò ìríran péye, ṣùgbọ́n kò sọ ohunkóhun nípa àwọn ohun alààyè tí iye wọn wà ní ìsàlẹ̀ ààlà ìṣàwárí. Ẹ̀yìn búlúù tí kò ní àmì jẹ́ àbájáde tó bófin mu nípa gíláàsì àyẹ̀wò náà, kì í ṣe ìdájọ́ nípa aláìsàn.

Rántí bí a ṣe pín iṣẹ́ náà, kíkọ ìròyìn yóò sì rọrùn. Carbol fuchsin ń fi àwọn ohun tó ṣeé fura sí hàn. Àdàpọ̀ ásíìdì àti ọtí ń ṣe ìdánwò náà. Búlúù methylene kàn ń mú kí ìdáhùn ṣeé kà: pupa di àwọ̀ mú láìjẹ́ kí ásíìdì yọ ọ́, búlúù sì pàdánù rẹ̀. Gbogbo ohun mìíràn—ẹ̀yà, iye àwọn ohun alààyè, àti ìtumọ̀ rẹ̀ fún ìṣègùn—ń wá láti inú iṣẹ́ tí ó kọjá gíláàsì àyẹ̀wò náà.