Nígbà tí methylene blue bá fa ìdàrúdàpọ̀ nínú àdánwò tí a fi ń wọn òun náà

Ilé ìwádìí kan ń tọ́jú àwọn ẹja zebrafish ní ìpele oyún nínú methylene blue ní ìfojúsùn tí a sábà máa ń lò fún títọ́jú wọn, lẹ́yìn náà ó ń wọn ìṣiṣẹ́ kẹ́míkà inú ẹ̀dá ní ọ̀nà méjì. Ní ọjọ́ kìíní, ẹ̀rọ ìtúpalẹ̀ Seahorse ròyìn pé lílo oxygen ń pọ̀ sí i. Ní ọjọ́ kẹrin àti karùn-ún, àwo àdánwò Alamar Blue ròyìn pé lílo agbára ń dín kù. Àwọ̀ kan náà, ìran ẹja kan náà, ṣùgbọ́n àwọn ìpinnu tí ó tako ara wọn. Lẹ́yìn náà ni àdánwò àfiwé tí kò pariwo dé: àwọn ihò àwo tí ó ní methylene blue pẹ̀lú ohun ìdánwò Alamar Blue, láìsí ẹja kankan, tún fúnni ní ìmọ́lẹ̀ tí ó dín kù ju ohun ìdánwò nìkan lọ. Apá kan àbájáde náà jẹ́ ohun tí ń ṣẹlẹ̀ nínú ẹ̀dá. Apá mìíràn jẹ́ pé àwọ̀ náà ń fún ìdánwò ara rẹ̀ ní máàkì. Ìpínyà yẹn, tí a ṣàkọsílẹ̀ nínú ìwádìí Communications Biology ti 2025 lórí methylene blue nínú zebrafish tí ń dàgbà, ni ìrísí tí ìdàrúdàpọ̀ methylene blue nínú àdánwò sábà máa ń ní, ó sì jẹ́ ìdí tí àwọn àwọ̀ tí ń ṣiṣẹ́ ní redox fi nílò àwọn àdánwò àfiwé tí àwọn èròjà ìdánwò lásán kò nílò.

Ohun tí àdánwò resazurin ń ròyìn gan-an

Alamar Blue jẹ́ orúkọ àmì ọjà fún ojútùú resazurin, nítorí náà ìdàrúdàpọ̀ methylene blue nínú Alamar Blue àti ìdàrúdàpọ̀ methylene blue nínú àdánwò resazurin ń ṣàpèjúwe ìkọlù kan náà. Resazurin tí ó ti pàdánù ẹlẹ́ktrọ́n jẹ́ aláwọ̀ búlúù, kò sì fẹ́rẹ̀ẹ́ tan ìmọ́lẹ̀ fluorescence. Àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ìṣiṣẹ́ kẹ́míkà inú wọn ń lọ dáadáa ń fún un ní ẹlẹ́ktrọ́n láti yí i padà sí resorufin, tí ó jẹ́ aláwọ̀ pínkì tí ó sì ń tan ìmọ́lẹ̀ fluorescence gidigidi ní àyíká ìmúṣiṣẹ́ 560 nm àti ìtújáde ìmọ́lẹ̀ 590 nm, pẹ̀lú àwọn àlàfo tí a lè lò ní àyíká ìmúṣiṣẹ́ 530 sí 570 nm àti ìtújáde ìmọ́lẹ̀ 580 sí 610 nm gẹ́gẹ́ bí ìlànà àwo kékeré ti olùpèsè ṣe sọ. Bí fífúnni ní ẹlẹ́ktrọ́n bá lọ síwájú sí i, resorufin yóò yí padà sí dihydroresorufin, tí ìmọ́lẹ̀ fluorescence rẹ̀ kò lágbára; nítorí náà, sẹ́ẹ̀lì tó pọ̀ jù tàbí àkókò tó gùn jù nínú ihò àwo máa ń tẹ ìlà ìṣètò ìwọ̀n sílẹ̀ ní apá iye gíga.

Ọ̀pọ̀ àwọn ẹlẹ́ktrọ́n náà ń wá láti NADH àti NADPH nípasẹ̀ àwọn reductase àti diaphorase inú sẹ́ẹ̀lì ní cytosol, microsomes, àti mitochondria. Èyí túmọ̀ sí pé àbájáde ìwọ̀n náà jẹ́ àpapọ̀ agbára láti fúnni ní ẹlẹ́ktrọ́n, kì í ṣe kíkà iye sẹ́ẹ̀lì tí ó wà láàyè, kì í sì í ṣe ìwọ̀n mitochondria. Àmì tó ga sí i lè túmọ̀ sí sẹ́ẹ̀lì tó pọ̀ sí i, ìṣàn ẹlẹ́ktrọ́n tó pọ̀ sí i fún sẹ́ẹ̀lì kọ̀ọ̀kan, tàbí méjèèjì. Èròjà kan tí ó yí ọ̀nà NADH padà lè yí àmì náà padà láìpa sẹ́ẹ̀lì kan ṣoṣo. Má ṣe gbàgbé gbólóhùn yẹn, nítorí yíyí ọ̀nà NADH padà jẹ́ ohun tí methylene blue máa ń ṣe.

Ọ̀nà ìdàrúdàpọ̀ méjì, àmì kan tí ó dín kù

Methylene blue ń yí àbájáde ìwọ̀n resazurin po nípasẹ̀ ọ̀nà méjì tí kò gbára lé ara wọn, ọ̀kọ̀ọ̀kan wọn nìkan sì lè dín ìmọ́lẹ̀ fluorescence tí a rí kù.

Ọ̀nà 1 jẹ mọ́ ìmọ́lẹ̀. Methylene blue ń fa ìmọ́lẹ̀ wọlé gidigidi ní apá pupa, pẹ̀lú ẹgbẹ́ monomer rẹ̀ ní àyíká 660 sí 665 nm àti ìgbéga kékeré dimer ní àyíká 607 sí 610 nm, tí ìrù rẹ̀ nà padà sí ìtújáde ìmọ́lẹ̀ resorufin ní àyíká 590 nm. Àwọ̀ tí ó wà ní ọ̀nà ìmọ́lẹ̀ ń fa díẹ̀ lára ìmọ́lẹ̀ ìmúṣiṣẹ́ wọlé, ó sì tún ń fa díẹ̀ lára ìmọ́lẹ̀ fluorescence tí a tú jáde wọlé. Èyí jẹ́ ipa àlẹ̀mọ́ inú, tí ń mú kí ìmọ́lẹ̀ ihò àwo dín kù bí iye resorufin tí a ń ṣe kò tilẹ̀ yí padà. Àwòrán àwọn ìgbi ìmọ́lẹ̀ náà tún ń yí padà pẹ̀lú ipò àwọ̀ náà: ìtúpalẹ̀ àwọn ifosiwewe nínú àwòrán ìgbi ìmọ́lẹ̀ methylene blue nínú omi àti àwọn ojútùú cyclodextrin ya monomer, dimer, àti àkójọpọ̀ olùgbà-àlejò sọ́tọ̀ gẹ́gẹ́ bí irú mẹ́ta tí ó ní àwọn olùsọdipúpọ̀ ìdínkù ìmọ́lẹ̀ tí ó yàtọ̀ láti 500 sí 700 nm. Nítorí náà, bí àṣìṣe ìmọ́lẹ̀ ṣe tó ń yí padà pẹ̀lú ìfojúsùn, àkójọpọ̀, àti ìsopọ̀. Nínú àdánwò, ya ìdínkù ìmọ́lẹ̀ lásán sọ́tọ̀ kúrò ní pípa ìtànṣán rẹ́ ní ipele molecule, nípasẹ̀ ìdánwò ìmúpadà iye àfikún tí a ṣàpèjúwe ní ìsàlẹ̀, nítorí ọ̀nà àtúnṣe wọn yàtọ̀.

Ọ̀nà 2 jẹ́ ìdíje redox. Methylene blue tí ó ti pàdánù ẹlẹ́ktrọ́n ń gba ẹlẹ́ktrọ́n láti NAD(P)H láti di leuco methylene blue tí kò ní àwọ̀. Oxygen alámólékù máa ń tún mú kí ó pàdánù ẹlẹ́ktrọ́n, ó sì ń dá a padà sí irú búlúù, nígbà tí ó ń ṣe àwọn àbájáde oxygen tí ó ti gba ẹlẹ́ktrọ́n, títí kan hydrogen peroxide. Ìyípo kọ̀ọ̀kan nínú àyíká yẹn ń lo àwọn ẹlẹ́ktrọ́n tí ìbá lọ sí resazurin, ó sì ń lo oxygen nígbà tí ó ń ṣe peroxide lẹ́gbẹ̀ẹ́ rẹ̀. Nítorí náà, àmì Alamar Blue tí ó dín kù lè túmọ̀ sí pé àwọn ẹlẹ́ktrọ́n gba inú àyíká methylene blue dípò kí wọ́n lọ sí resorufin. Èyí máa ń hàn lórí àwo gẹ́gẹ́ bí ìṣiṣẹ́ kẹ́míkà inú ẹ̀dá tí ó dín kù, láìka ohun tí àwọn sẹ́ẹ̀lì ṣe sí. Kẹ́míkà kan náà ṣàlàyé ìdẹkùn òdìkejì nínú àwọn ẹ̀rọ ìwọ̀n oxygen: àwọ̀ tí ó ti gba ẹlẹ́ktrọ́n, tí oxygen sì tún mú kí ó pàdánù wọn, ń fa lílo oxygen nípa kẹ́míkà láìsí ẹ̀dá kankan. Nítorí náà, àwọn àdánwò òfo tí ó ní àwọ̀ yẹ kí ó wà nínú ìwọ̀n ìmímí pẹ̀lú, gẹ́gẹ́ bí ìfiwéra àwọn ìwọ̀n oxygen, ATP, àti ìyàtọ̀ foliteji kọjá mẹ́ńbírénì ṣe ṣàlàyé fún ọ̀ràn mitochondria.

Àmì tí ó yí padà àti ohun tí ó yí padà nínú ẹ̀dá lè jẹ́ òtítọ́ méjèèjì

Ìwádìí zebrafish ṣe pàtàkì gan-an nítorí pé kò gba ìpinnu tó rọrùn pé ọ̀kan ṣoṣo ni ó lè jẹ́ òtítọ́. Ohun tí ń ṣẹlẹ̀ nínú ẹ̀dá jẹ́ gidi: lílo oxygen ní ìpele ìpìlẹ̀ pọ̀ sí i nínú àwọn ẹja ní ìpele oyún tí ọjọ́-orí wọn jẹ́ 1 ní ìfojúsùn àtọ́jú méjèèjì, ìmímí tí ó ní ìsopọ̀ pẹ̀lú ATP pọ̀ sí i ní ìfojúsùn kékeré, ìyàtọ̀ foliteji kọjá mẹ́ńbírénì tí a wọn pẹ̀lú ohun èlò ìtọ́pinpin JC-10 pọ̀ sí i ní ọjọ́ kejì, àwọn ẹ̀dà RNA fún àwọn àkójọpọ̀ amuaradagba mitochondria sì dín kù ní ọjọ́ kìíní àti kẹrin. Àbájáde èké tí ọ̀nà ìwọ̀n fa náà jẹ́ gidi: ẹja tí a fọ̀ lẹ́ẹ̀mẹ́ta kí a tó ṣe ìgbésẹ̀ Alamar Blue ṣì ní àbàwọ́n búlúù tí a lè rí ní orí, ẹnu, àti agbègbè ìmọ̀ òórùn; àwọn ihò àwo tí kò ní sẹ́ẹ̀lì, tí ó ní àwọ̀ pẹ̀lú ohun ìdánwò, sì pàdánù ìwọ̀nba ìmọ́lẹ̀ fluorescence tí ó kéré ṣùgbọ́n tí ó ṣe pàtàkì ní ìṣirò fúnra wọn. Ìdínkù Alamar Blue nínú ẹja ní ọjọ́ kẹrin àti karùn-ún tóbi ju ipa tí a rí láìsí sẹ́ẹ̀lì lọ, nítorí náà àwọn òǹkọ̀wé túmọ̀ àbájáde náà sí ìyípadà gidi nínú ìṣiṣẹ́ kẹ́míkà inú ẹ̀dá tí a ń wò nípasẹ̀ lẹ́ńsì tí ó ti yí po díẹ̀. Èyí ni àwòrán tó tọ́ láti ní lọ́kàn. Èròjà tí ń yípo nínú redox, tí ó sì tún ń fa ìmọ́lẹ̀ wọlé nítorí àwọ̀ búlúù rẹ̀, sábà máa ń da ọ̀nà tí a ń ṣe ìwádìí rẹ̀ àti kẹ́míkà ohun tó ń fúnni ní àmì rú lẹ́ẹ̀kan náà. Iṣẹ́ àwọn àdánwò àfiwé ni láti wọn bí ọkọọkan ṣe kópa tó, kì í ṣe láti sọ pé ọ̀kan nínú wọn kò sí rárá. Ẹ̀kọ́ tó jọ èyí tún wá láti inú iṣẹ́ ìsopọ̀ cyclodextrin: nígbà tí molecule olùgbà kan mú àwọ̀ náà mọ́, àbàwọ́n àti ìmúṣiṣẹ́ gbígba glucose wọlé dín kù papọ̀. Èyí tọ́ka sí pé ipa lórí ìṣiṣẹ́ kẹ́míkà inú ẹ̀dá nílò ìbáṣepọ̀ taara pẹ̀lú àwọ̀, dípò ìdàrúdàpọ̀ redox tí ó tàn ká. Sísopọ̀ ìwọ̀n ti ara àwọ̀ pẹ̀lú ìwọ̀n iṣẹ́ rẹ̀ gan-an ni ọ̀nà tí ń ya ìlànà iṣẹ́ sọ́tọ̀ kúrò ní àbájáde èké, ìtọ́sọ́nà sí kíkà àwọn ẹ̀sùn ìṣiṣẹ́ kẹ́míkà inú ẹ̀dá tí ó dá lórí àwọ̀ sì ṣàlàyé àṣà yẹn sí i.

Àwọn àdánwò àfiwé tí ń ya wọn sọ́tọ̀

Ṣe àwọn wọ̀nyí kí o tó túmọ̀ àbájáde methylene blue kankan láti inú àwo resazurin. Ìfojúsùn, àdàpọ̀ àtọ́jú, àkókò ìtọ́jú, àti ìtànmọ́lẹ̀ gbọ́dọ̀ bá ti àdánwò sẹ́ẹ̀lì mu pátápátá, nítorí gbogbo ọ̀nà tí a sọ lókè gbára lé wọn.

Àdánwò àfiwé 3 àti 4 ni tọkọtaya tí ọ̀pọ̀ ìwé ìwádìí máa ń fo, tí ọ̀pọ̀ ìwé ìwádìí methylene blue sì nílò. Àdánwò àfiwé 3 ń mú ipa kẹ́míkà, àdánwò àfiwé 4 ń mú ipa ìmọ́lẹ̀, papọ̀ ni wọ́n sì ń fi ààlà sí àbájáde èké kí a tó sọ ẹ̀sùn kankan nípa ohun tí ń ṣẹlẹ̀ nínú ẹ̀dá.

Àwọn ìwọ̀n olómìnira, ọkọọkan pẹ̀lú àwọn àlàyé pàtàkì tirẹ̀

Kò sí àdánwò kejì kan ṣoṣo tí ó lè jẹ́rìí pé àkọ́kọ́ tọ́. Ìwọ̀n olómìnira kọ̀ọ̀kan yàgò fún ọ̀nà kan, ṣùgbọ́n ó ṣì lè fara hàn sí òmíràn. Nítorí náà, yan àkójọpọ̀ tí àwọn ibi tí wọn kò lè rí kò fi ara wọn lé ara. Tábìlì yíyan àdánwò fún àwọn èròjà tí ń ṣiṣẹ́ ní redox ṣàlàyé ìdí tí a fi ń so wọ́n pọ̀ lọ́kọ̀ọ̀kan, ìtọ́sọ́nà àwọn ohun èlò ìtọ́pinpin ìyàtọ̀ foliteji kọjá mẹ́ńbírénì sì ṣàlàyé àwọn ohun tí a gbọ́dọ̀ ṣọ́ra fún nípa fluorescence ní kíkún.

Ìwọ̀n lílo oxygen ti Seahorse ń tẹ̀lé àwọn ẹlẹ́ktrọ́n sí oxygen dípò sí resorufin, èyí sì yàgò fún kẹ́míkà ohun tó ń fúnni ní àmì pátápátá. Ṣùgbọ́n àwọ̀ náà tún ń lo oxygen nípa kẹ́míkà, nítorí náà àdánwò òfo àwọ̀ láìsí mitochondria nínú àdàpọ̀ àtọ́jú tó pé jẹ́ dandan. Àwọn àdánwò ATP luciferase ń lo ìmọ́lẹ̀ tí ìṣe ẹ̀dá ń mú jáde dípò ìmọ́lẹ̀ fluorescence resorufin, nítorí náà wọ́n yàgò fún ìkọjá ara àwọn ìgbi ìmọ́lẹ̀ àti ìdíje reductase méjèèjì. Ohun tí a pàdánù níbẹ̀ ni pé wọ́n ń ròyìn ìwọ̀ntúnwọ̀nsì gbogbo ATP tó wà, dípò ìṣàn ṣíṣe ATP. Àwọn ohun èlò ìtọ́pinpin ìyàtọ̀ foliteji kọjá mẹ́ńbírénì bí TMRM tàbí JC-10 ń dáhùn bóyá ìyàtọ̀ ẹ̀rù iná mànàmáná ṣì dúró, ṣùgbọ́n wọ́n ń tan ìmọ́lẹ̀ fluorescence ní ààlà ìmọ́lẹ̀ tí ojú lè rí kan náà tí àwọ̀ náà ń fà wọlé. Nítorí náà, àbàwọ́n búlúù tó ṣẹ́kù tún ń jẹ́ kí ìtumọ̀ wọn nira, wọ́n sì nílò àdánwò òfo àwọ̀ nìkan ní ìwọ̀n àwọ̀ kọ̀ọ̀kan. Ìwọ̀n àwọn ẹ̀dà RNA fún àwọn ẹ̀ka àkójọpọ̀ amuaradagba ìmímí yàgò fún ipa ìmọ́lẹ̀ pátápátá, ó sì ń kó ohun tí ń ṣẹlẹ̀ jọ fún ọ̀pọ̀ wákàtí. Èyí ń ṣàfikún sí àwọn ìwọ̀n àwo tí a ṣe ní àkókò ìṣẹ́jú.

Nítorí náà, àkójọpọ̀ tó kéré jù tí ó ṣeé gbàgbọ́ fún ẹ̀sùn ìṣiṣẹ́ kẹ́míkà inú ẹ̀dá nípa methylene blue ni: àbájáde resazurin pẹ̀lú àdánwò àfiwé 1 sí 4, pẹ̀lú ìwọ̀n àbájáde kan tí kì í ṣe resazurin, tí ó dá lórí ìlànà fisiksi tó yàtọ̀, pẹ̀lú àlàyé bóyá ìyípadà náà ń fi iye sẹ́ẹ̀lì hàn, ìṣàn ẹlẹ́ktrọ́n fún sẹ́ẹ̀lì kọ̀ọ̀kan, tàbí méjèèjì. Ohunkóhun tí kò tó èyí kò jẹ́ kí òǹkàwé lè ya ìṣiṣẹ́ kẹ́míkà tí ó dín kù sọ́tọ̀ kúrò ní ihò àwo tí ìmọ́lẹ̀ rẹ̀ dín kù.

Ìwé iṣẹ́ fún ṣíṣàkóso ìdàrúdàpọ̀

Da ìwé iṣẹ́ yìí sínú ìwé àkọsílẹ̀ ilé ìwádìí fún àdánwò kọ̀ọ̀kan tí ó so àwọ̀ náà pọ̀ mọ́ ohun tó ń fúnni ní àmì redox. Ó jẹ́ ohun èlò ìpilẹ̀ṣẹ̀ fún àpilẹ̀kọ yìí: kọ ìlà kan fún ìfojúsùn àwọ̀ kọ̀ọ̀kan.

A. Àwọn ọ̀nà àmì. Fún ìfojúsùn kọ̀ọ̀kan, ṣàkọsílẹ̀: ipò monomer ní ìfiwéra pẹ̀lú dimer tí a ń retí (micromolar kékeré ní ìfiwéra pẹ̀lú ọ̀pọ̀ mẹ́wàá micromolar àti ju bẹ́ẹ̀ lọ), bí àpapọ̀ tó wà nínú ihò àwo ní ìparí ṣe ń fa ìmọ́lẹ̀ wọlé ní 590 nm nínú ihò tí kò ní sẹ́ẹ̀lì, àti ìdá ọgọ́rùn-ún ìmúpadà iye àfikún resorufin. Bí ìmúpadà bá ṣubú sí ìsàlẹ̀ bí 90 nínú ọgọ́rùn-ún, ka gbogbo iye fluorescence ní ìwọ̀n àwọ̀ yẹn sí iye tí ipa ìmọ́lẹ̀ ti dín kù, kì í ṣe iye tó péye nípa ohun tí ń ṣẹlẹ̀ nínú ẹ̀dá.

B. Àyẹ̀wò kẹ́míkà. Ní àkókò ìwọ̀n kọ̀ọ̀kan, ṣàkọsílẹ̀ fluorescence àwọ̀-pẹ̀lú-ohun-ìdánwò láìsí sẹ́ẹ̀lì gẹ́gẹ́ bí ìdá ọgọ́rùn-ún iye ìpìlẹ̀ ohun ìdánwò nìkan. Bí ìyapa náà bá ń pọ̀ sí i bí àkókò ṣe ń lọ, àwọ̀ náà ń bá ètò ohun tó ń fúnni ní àmì ṣe ìbáṣepọ̀ kẹ́míkà nígbà àdánwò, ìwọ̀n ní ìparí nìkan yóò sì múni ṣìnà. Ronú nípa ṣíṣe ìwọ̀n bí àkókò ṣe ń lọ tàbí lílo ohun mìíràn tó ń fúnni ní àmì.

C. Àyẹ̀wò ìfiwéra ohun tí ń ṣẹlẹ̀ nínú ẹ̀dá. Dárúkọ ìwọ̀n olómìnira tí o yàn fún àdánwò yìí, àdánwò òfo àwọ̀ tirẹ̀, àti àbájáde tí a ń retí bí àbájáde resazurin bá jẹ́ gidi. Ìdínkù gidi nínú ìṣiṣẹ́ kẹ́míkà inú ẹ̀dá yẹ kí ó yí ìwọ̀n àbájáde olómìnira padà ní ọ̀nà tí ó bá a mu. Bí ìwọ̀n àbájáde olómìnira náà kò bá fara mọ́ ọn, má ṣe gbẹ́kẹ̀ lé èyíkéyìí lára àbájáde méjèèjì síbẹ̀; tún àdánwò náà ṣe dípò kí o ṣe àpapọ̀ ìpín iye méjèèjì.

D. Gb ólóhùn ìpinnu. Kọ gbólóhùn kan ní irú ọ̀nà yìí: ní ìwọ̀n àti ìpele tí a sọ, àmì resazurin yí padà ní iye tí a sọ, nínú èyí tí iye tí a sọ jẹ́ àbájáde èké tí ó wá láìsí sẹ́ẹ̀lì, ìwọ̀n àbájáde olómìnira sì (fara mọ́ ọn tàbí kò fara mọ́ ọn). Bí àyè kankan kò bá ní ohun tí a kọ sí i, àdánwò náà kò tíì parí.

Methylene blue ṣì jẹ́ ohun èlò ìwádìí tó wúlò fún ìṣiṣẹ́ kẹ́míkà inú ẹ̀dá, iṣẹ́ zebrafish sì fi àwọn ipa gidi lórí mitochondria hàn ní àwọn ìwọ̀n tí ọ̀pọ̀ ilé ìwádìí ń dà sínú ọ̀nà omi ìdọ̀tí lójoojúmọ́. Àwọ̀ náà kàn ń tẹnumọ́ pé a gbọ́dọ̀ wọn òun pẹ̀lú àwọn ẹ̀rọ tí òun kò lè ní ipa lórí. Fún un ní àwọn ihò àwo àwọ̀ nìkan, ìdánwò ìmúpadà iye àfikún, àti ìwọ̀n kan tí ó dá lórí fisiksi tó yàtọ̀; ìdàrúdàpọ̀ náà yóò sì jáwọ́ nínú jíjẹ́ ìdẹkùn, yóò sì di iye kan tí ó ní nọ́ńbà tí a so mọ́ ọn.