Búlúù mẹ́tílínì àti àútófágì: AMPK, mTOR, àti àwọn ìdánwò néúrónù

Fojú inú wò ó pé o ṣe ìdánwò sẹẹli kan, o fi búlúù mẹ́tílínì kún un, o sì rí i pé ìlà prótínì kan tí a ń pè ní LC3-II dúdú sí i lórí àwòrán blot rẹ. Ó lè wù ọ́ láti kéde pé èròjà náà “ń mú àútófágì pọ̀ sí i” kí o sì tẹ̀ síwájú. Ìtumọ̀ yẹn ti tètè dé jù. Ìlà LC3-II tí ó dúdú sí i lè túmọ̀ sí pé sẹẹli náà ń dá àwọn àpò ìmọ́tótó púpọ̀ sí i, tàbí pé àwọn àpò náà ń kó jọ nítorí pé ìgbésẹ̀ ìmúkúrò ti dí. Àwọn ìtumọ̀ méjèèjì yìí ń tọ́ka sí ọ̀nà tí ó lòdì sí ara wọn, àwọn ìwé ìwádìí búlúù mẹ́tílínì lórí néúrónù sì ní àpẹẹrẹ ẹ̀rí fún ọ̀kọ̀ọ̀kan. Àpilẹ̀kọ yìí ṣàlàyé ohun tí a wọn ní tòótọ́, àyẹ̀wò kọ̀ọ̀kan lẹ́yìn òmíràn.

Mákróàútófágì, irú àútófágì tí a kẹ́kọ̀ọ́ níbí, jẹ́ ètò sẹẹli fún àtúnlò àwọn ohun èlò lọ́pọ̀lọpọ̀. Àpò awọ kan tí a ń pè ní phagophore ń dàgbà yí àwọn prótínì àti àwọn ẹ̀yà inú sẹẹli tí ó ti gbó ká, ó ń pa dé láti di autophagosome, ó ń darapọ̀ mọ́ lysosome, a sì ń fọ́ ẹrù inú rẹ̀ túútúú kí a tú u sílẹ̀ fún àtúnlò. Àwọn néúrónù gbẹ́kẹ̀ lé ìlànà yìí nítorí wọn kì í pín, wọn kò sì lè dín ìpọ̀ àwọn ẹ̀yà tí ó bàjẹ́ kù nípa pípín. Nígbà tí àtúnlò bá dá dúró, ìdọ̀tí ń kó jọ. Nígbà tí ó bá ń ṣiṣẹ́, sẹẹli ń gba àwọn ohun èlò ìkọ́lé padà nígbà wàhálà.

Ohun tí ìdánwò hippocampus kan fi hàn

Ìwádìí pàtàkì lórí ìbẹ̀rẹ̀ àútófágì lo àwọn sẹẹli hippocampus eku HT22 tí a fi sí wàhálà nípa fífi sérọ́ọ̀mù dù wọ́n fún wákàtí 24. Ipò yìí yọ àwọn ohun tí ń mú ìdàgbàsókè ṣẹlẹ̀ àti àwọn àmì tí ń ṣètìlẹ́yìn fún ìtọ́jú sẹẹli kúrò, ó sì ń fa apoptosis àti àútófágì méjèèjì. Àwọn olùwádìí ròyìn pé búlúù mẹ́tílínì dín ikú sẹẹli kù ní ìbámu pẹ̀lú ìwọ̀n tí a fi sí i, àti pé ààbò yìí wá pẹ̀lú àwọn àmì mákróàútófágì.

Àwọn àmì tí wọ́n tọ̀ lé ṣe kedere. Àbàwọ́n LC3B tí ó tàn ká sẹẹli tún pín sí àwọn àmì kéékèèké ní àyíká arin sẹẹli láti nǹkan bí 20 nM búlúù mẹ́tílínì, pẹ̀lú ìdáhùn LC3-I àti LC3-II tí ó lágbára jù lọ ní àgbègbè 1 μM. LC3B-I àti LC3B-II méjèèjì pọ̀ sí i ní ìbámu pẹ̀lú ìwọ̀n àti àkókò. Ohun pàtàkì ni pé ẹgbẹ́ náà ṣe ìgbésẹ̀ kan kọjá àwòrán blot LC3 tí ó fi ipò àkókò kan ṣoṣo hàn. Wọ́n fi 10 μM chloroquine kún un, tí ó ń dí ìmúkúrò nípasẹ̀ lysosome, wọ́n sì rí LC3-II tí ó ga sí i àti p62 tí ìpele rẹ̀ dúró ṣinṣin nínú àwọn sẹẹli tí a fi búlúù mẹ́tílínì ṣe ìtọ́jú. Àpẹẹrẹ yẹn ń ṣe àtìlẹ́yìn fún ìyípo ìparun àti àtúnlò tí ó gbára lé lysosome, kì í ṣe kíkó àwọn àpò jọ lásán. Wọ́n tún fi hàn pé chloroquine dín ipa dídènà apoptosis kù lápá kan, èyí tí ó so ààbò náà mọ́ ipa-ọ̀nà àútófágì àti lysosome nínú àwòṣe yìí.

Àbájáde ìfiranṣẹ́ àmì ni apá tí a sábà máa ń tọ́ka sí lọ́nà tí kò tọ́. Ìfiranṣẹ́ àmì AMPK, tí a fi AMPK tí a ti fi fosiféètì kún àti ACC tí a ti fi fosiféètì kún, tí AMPK ń darí lẹ́yìn rẹ̀, ṣe àyẹ̀wò, pọ̀ sí i ní wákàtí 12 àti 24 ní ìbámu pẹ̀lú ìwọ̀n. Compound C tí ń dènà AMPK, tí a lò ní 20 μM ní wákàtí 4 tó gbẹ̀yìn, dín fífi fosiféètì kún ACC àti mímú LC3 ṣiṣẹ́ méjèèjì kù. Ní ìdàkejì, mTOR tí a ti fi fosiféètì kún kò fi ìdínkù tí a lè rí hàn. Nítorí náà, nínú àwọn sẹẹli hippocampus tí ó wà lábẹ́ wàhálà, ohun tí a rí jẹ́ ìbẹ̀rẹ̀ àútófágì tí ó ní í ṣe pẹ̀lú AMPK nípasẹ̀ ọ̀nà tí ó dà bí ẹni pé kò gbára lé mTOR. Àpẹẹrẹ kan náà farahàn nínú àwọn eku alààyè, níbi tí ìtọ́jú pẹ̀lú búlúù mẹ́tílínì ti fa àwọn àmì mákróàútófágì nínú cortex àti hippocampus.

Ìbẹ̀rẹ̀ kì í ṣe ìṣàn tí ó ti parí

Níhìn-ín ni ìyàtọ̀ láàárín àwọn èrò méjèèjì ti ṣe pàtàkì jù lọ. Ìbẹ̀rẹ̀ túmọ̀ sí pé ẹ̀rọ tí ó wà ní ìbẹ̀rẹ̀ ipa-ọ̀nà ń dá àwọn autophagosome púpọ̀ sí i. Ìṣàn túmọ̀ sí pé ẹrù ń gba gbogbo ọ̀nà kọjá: yíya sọ́tọ̀, dídàgbà dé ipò tí ó pé, dídarapọ̀ mọ́ lysosome, fífọ́ túútúú, àti àtúnlò. Gbogbo ìlọsíwájú LC3-II jẹ́ ẹ̀rí ìbẹ̀rẹ̀ nìkan títí àyẹ̀wò ìṣàn yóò fi jẹ́rìí sí ìyókù ìrìnàjò náà.

Àyẹ̀wò ìṣàn tí a sábà máa ń lò ń wọn LC3-II nígbà tí a dí iṣẹ́ lysosome fún ìgbà kúkúrú, fún àpẹẹrẹ pẹ̀lú bafilomycin A1 tàbí chloroquine, àti nígbà tí a kò dí i. Bí ìtọ́jú náà bá ń mú ìṣẹ̀dá yára sí i ní tòótọ́, dídí ìparun yẹ kí ó mú LC3-II ga sí i síbẹ̀. Ẹ̀rọ àmì mCherry-GFP-LC3 tí a so pọ̀ ń fi ọ̀nà kejì hàn: àwọn àkójọpọ̀ náà ń tàn ní àwọ̀ ofeefee kí wọ́n tó darapọ̀ mọ́ lysosome, wọ́n sì ń tàn ní àwọ̀ pupa nìkan lẹ́yìn tí ásíìdì bá pa àmì GFP. Nítorí náà, àwọn àmì kéékèèké tí ó jẹ́ pupa nìkan tí ó pọ̀ sí i ń ṣe àtìlẹ́yìn fún ìlọsíwájú sí inú àwọn autolysosome tí ó ní ásíìdì. Ìpele prótínì p62 tí ó ń ṣubú lè jẹ́rìí sí ìyípo ìparun àti àtúnlò ẹrù, ṣùgbọ́n a gbọ́dọ̀ rántí pé ṣíṣẹ̀dà ìsọfúnni p62 fúnra rẹ̀ ń dáhùn sí wàhálà, a sì yẹ kí a ṣàyẹ̀wò rẹ̀ ní ìpele mRNA.

Àtòjọ àyẹ̀wò tó wà nísàlẹ̀ so àyẹ̀wò kọ̀ọ̀kan tí a lò nínú àwọn ìwé ìwádìí yìí mọ́ ohun tí ó ń wọn àti ohun tí kò lè fi hàn fúnra rẹ̀. Àwọn òǹkàwé lè tún lò ó fún èyíkéyìí ẹ̀sùn ọjọ́ iwájú nípa mákróàútófágì, títí kan àwọn àríyànjiyàn ààwẹ̀ àti ẹ̀mí gígùn tí ń gbára lé àwọn àmì wọ̀nyí.

Ṣàkíyèsí àṣìṣe ọ̀rọ̀ kan tí tábìlì náà ń dáàbò bo wa lọ́wọ́. ACC tí a ti fi fosiféètì kún ni irú rẹ̀ tí a ti dènà iṣẹ́ ensáímù rẹ̀. Bí ó ṣe ń pọ̀ sí i fi àbájáde iṣẹ́ AMPK hàn, kì í ṣe mímú ACC ṣiṣẹ́.

Gbólóhùn náà “dídènà mákróàútófágì mú ààbò néúrónù kúrò” nílò ìpéye kan náà. Nínú àwòṣe HT22, ó túmọ̀ sí pé dídí ipa-ọ̀nà àútófágì àti lysosome mú àǹfààní ìwàláàyè búlúù mẹ́tílínì kúrò nígbà tí a fi sérọ́ọ̀mù dù àwọn sẹẹli. Ó ń ṣe àtìlẹ́yìn fún pé àútófágì ṣe pàtàkì tàbí pé ó ní ipa nínú àwo ìdánwò yẹn. Kò fi ìdí rẹ̀ múlẹ̀ pé àútófágì ni ọ̀nà ààbò kan ṣoṣo tí èròjà náà ní, kò fi hàn pé chloroquine ń ṣiṣẹ́ nípasẹ̀ àútófágì nìkan, a sì nílò ìyípadà sí ATG5, ATG7, tàbí ULK1 ní ìpele jínì láti fún ẹ̀rí pé èyí ló fa àbájáde náà lókun.

Ọ̀nà méjì sí inú ẹ̀rọ kan náà

Àwòrán ọ̀nà tí a mú rọrùn lè ràn wá lọ́wọ́. Wàhálà agbára ń mú AMPK ga sí i, AMPK ń mú àkójọpọ̀ ULK1 ṣiṣẹ́, àútófágì sì ń bẹ̀rẹ̀. Àwọn ohun tí ń mú ìdàgbàsókè ṣẹlẹ̀ àti àwọn èròjà oúnjẹ ń mú mTORC1 ga sí i, mTORC1 ń dènà ULK1, àútófágì sì ń dúró ní ipò àìṣiṣẹ́. Lẹ́yìn ULK1, àkójọpọ̀ Beclin-1 àti VPS34 ń bẹ̀rẹ̀ ìṣẹ̀dá phagophore, a ń fi ọ̀rá kún LC3-I láti di LC3-II, autophagosome ń pa dé, ó ń darapọ̀ mọ́ lysosome, a sì ń fọ́ ẹrù túútúú bí p62 ṣe ń kọjá ìyípo ìparun àti àtúnlò.

Àwòrán náà gbé àbájáde búlúù mẹ́tílínì kọ̀ọ̀kan sí orí àwòrán ọ̀nà yìí: àbájáde hippocampus lẹ́gbẹ̀ẹ́ ẹ̀ka AMPK, àbájáde sẹẹli ìpilẹ̀ lẹ́gbẹ̀ẹ́ ẹ̀ka mTOR.

Ọ̀nà àlàyé yìí yanjú ohun tí ó dà bí àìbáramu pẹ̀lú ìwádìí Xie kejì. Nínú àwọn sẹẹli ìpilẹ̀ iṣan-ara eku ńlá tí ń pọ̀ sí i, ìdánwò mìíràn rí i pé 5 μM búlúù mẹ́tílínì dènà pípọ̀ sẹẹli sí i, ó sì mú wọn wọ ipò ìsinmi. Àwọn sẹẹli tí ó fi àmì Ki67 hàn dín kù ní ọjọ́ 1 àti 3, nígbà tí ìyípadà àwọn sẹẹli tí ó ti gba ọ̀nà néúrónù sí néúrónù ṣì wà láìbàjẹ́. Níbẹ̀, ọ̀nà iṣẹ́ náà gba ìdínkù ìfiranṣẹ́ àmì mTOR kọjá: gbogbo mTOR àti mTOR tí a ti fi fosiféètì kún dín kù, pẹ̀lú ìdínkù ìṣejáde p70S6K àti 4EBP1, àti dídín ìṣejáde cyclin E1, B1, D1, àti D2 kù. Àbùdá tí ó hàn jù lọ ni ìsinmi àwọn sẹẹli ìpilẹ̀, èyí tí àwọn òǹkọ̀wé so mọ́ dídádúró ọjọ́ ogbó sẹẹli, kì í ṣe gbígba àwọn sẹẹli hippocampus tí ó wà lábẹ́ wàhálà là.

Kò sí ìtakora láàárín àwọn ìwé méjèèjì. AMPK àti mTOR jẹ́ àwọn olùṣàkójọpọ̀ àmì tí ń dáhùn sí ipò tí wọ́n wà, kì í ṣe àwọn yíyí tí ipò wọn dúró ṣinṣin. Sẹẹli tí ó dà bí néúrónù tí ó wà lábẹ́ wàhálà lè mú AMPK ṣiṣẹ́ láìsí ìdènà mTOR tí a lè wọn, nígbà tí sẹẹli ìpilẹ̀ tí àwọn ohun tó ń ru pípín sẹẹli ń darí lè dáhùn sí èròjà kan náà nípa dídín iṣẹ́ ẹ̀rọ ìdàgbàsókè tí ó gbára lé mTOR kù. Irú sẹẹli, ipò wàhálà, ìfojúsí èròjà, àti àkókò tí a wọn ni ń pinnu ẹ̀ka tí ó lágbára jù lọ. Èyí tún ni ìdí tí àwọn ipa búlúù mẹ́tílínì lórí agbára mitochondria àti redox fi yẹ kí wọ́n wà nínú àlàyé kan náà: gẹ́gẹ́ bí àtúnyẹ̀wò àwọn ọ̀nà iṣẹ́ ààbò néúrónù ṣe ṣàlàyé, èròjà náà ń ṣiṣẹ́ bí olùgbé ẹlẹ́kítírónù mìíràn, ó ń mú ìfiranṣẹ́ àmì tó ń koju oxidation àti apoptosis ṣiṣẹ́, ó ń dènà MAO àti NOS, ó sì ní ìsopọ̀ pẹ̀lú àtúnsọ mitochondria di tuntun nípasẹ̀ ìṣẹ̀dá tuntun àti àútófágì. Àútófágì jẹ́ ẹ̀ka kan nínú àkójọpọ̀ àwọn ipa ọ̀pọ̀lọpọ̀, kì í ṣe gbogbo ìtàn náà.

Ohun tí àwọn ìdánwò náà kò fi hàn

Fífi sérọ́ọ̀mù dù sẹẹli ń ṣe àwòṣe wàhálà àtìlẹ́yìn ìdàgbàsókè àti ìyípadà kẹ́míkà ara nínú àwo ìdánwò. Kò ṣe àwòṣe ààwẹ̀ gbogbo ẹ̀dá alààyè: glucose, àwọn amino acid, àti àwọn iyọ̀ ṣì wà nínú omi ìpilẹ̀ tí a fi ń tọ́jú sẹẹli, kò sì sí ìhùwàsí jíjẹ oúnjẹ. A kò lè yí àwọn ìfojúsí láti 20 nM sí 5 μM nínú ìtọ́jú sẹẹli padà sí ìwọ̀n fún ènìyàn nípa ìṣirò lásán, nítorí gbígbà wọ ara, sísopọ̀ mọ́ prótínì, ipò redox, ìyípadà kẹ́míkà ara, kíkójọ nínú àsopọ̀ ara, àti àkókò tí èròjà náà fi wà níbẹ̀ yàtọ̀ sí ara wọn.

Kò sí ìdánwò ènìyàn tí a ti ṣe ètò rẹ̀ láti fi ìṣàn àútófágì tí búlúù mẹ́tílínì fa hàn nínú àwọn aláìsàn. Ẹ̀rí lórí ọ̀nà iṣẹ́ náà ṣì jẹ́ iṣẹ́ lórí sẹẹli, àsopọ̀ tí a yọ kúrò nínú ara, àti ẹranko, àwọn àtúnyẹ̀wò sì ṣì ń ṣàpèjúwe ẹ̀rí fún fífi àbájáde sílò nínú ènìyàn gẹ́gẹ́ bí ẹ̀rí ìpilẹ̀. Nítorí náà, àwọn ìwádìí wọ̀nyí kò fi hàn pé búlúù mẹ́tílínì ń ṣe ohun kan náà bí ààwẹ̀, pé ó ń fa ẹ̀mí ènìyàn gùn nípasẹ̀ àútófágì, tàbí pé ó ń mú ìṣàn àútófágì parí nínú ọpọlọ ènìyàn. Àwọn ẹ̀sùn pé ó ń fara wé ààwẹ̀ tàbí mú ẹ̀mí gùn nílò ẹ̀rí ìwádìí ilé ìwòsàn tiwọn, àwọn ìdánwò búlúù mẹ́tílínì nínú ènìyàn fún àwọn ìdí mìíràn kò sì di ìdánwò àútófágì nítorí ìsopọ̀ lásán. A yẹ kí a ka ìwádìí lórí àwọn àwòṣe wàhálà àìtó èròjà oúnjẹ àti ẹ̀mí gígùn pẹ̀lú ààlà yẹn lọ́kàn.

Fún ìwé ìwádìí tí o bá kà lẹ́yìn èyí, lo àtòjọ àyẹ̀wò náà ní ìtòlẹ́sẹẹsẹ. Kọ́kọ́ béèrè pé ẹ̀ka wo ló yí padà: AMPK, mTOR, tàbí kò sí ọ̀kan nínú wọn. Lẹ́yìn náà, béèrè bóyá a so àbájáde LC3 pọ̀ mọ́ àyẹ̀wò ìṣàn tàbí pé ó dá dúró fúnra rẹ̀. Lẹ́yìn náà, ṣàyẹ̀wò bóyá dídí ipa-ọ̀nà náà mú àǹfààní kúrò, àti ọ̀nà tí a fi ṣe é. Ìwádìí tí ó bá dáhùn sí gbogbo mẹ́tẹ̀ẹ̀ta ní ẹ̀rí tó lágbára fún àlàyé ọ̀nà iṣẹ́. Èyí tí ó dáhùn sí àkọ́kọ́ nìkan ti fi àmì ìyọ̀nda hàn, ìyókù ìrìnàjò náà sì ṣì kò tíì ní àwòrán ọ̀nà.