کیا آکسیجن کا زیادہ استعمال زیادہ ATP بننے کی علامت ہے؟ میتھیلین بلیو کے مطالعات سے حاصل ہونے والے اسباق

ایک الگ کیا گیا مائٹوکانڈریون ایک چیمبر میں موجود ہے، جہاں ایندھن تو ہے مگر ADP نہیں۔ وہ آکسیجن آہستہ آہستہ استعمال کرتا ہے۔ ADP شامل کریں تو آکسیجن کا استعمال کئی گنا بڑھ جاتا ہے۔ ADP ختم ہونے تک انتظار کریں تو آکسیجن کا استعمال دوبارہ کم ہو جاتا ہے۔ ایندھن میں کوئی تبدیلی نہیں ہوئی۔ صرف ATP کی طلب بدلی۔

یہ مختصر سلسلہ اس پورے فرق کو واضح کرتا ہے جس پر یہ مضمون مبنی ہے۔ آکسیجن کا استعمال اس رفتار کو ناپتا ہے جس سے الیکٹران تنفسی زنجیر سے گزر کر آکسیجن تک پہنچتے ہیں۔ ATP کی پیداوار یہ ناپتی ہے کہ اس بہاؤ کی کتنی توانائی قابلِ استعمال صورت میں محفوظ ہوتی ہے۔ ان دونوں کے درمیان ایک مشترک مرحلہ ہے: مائٹوکانڈریا کی اندرونی جھلی کے آر پار پروٹون کا میلان۔ جو بھی عامل اس میلان اور ATP کی ترکیب کے درمیان کپلنگ، یعنی باہمی وابستگی، کی مضبوطی بدلتا ہے، وہ ان دو پیمائشی نتائج کو مختلف سمتوں میں لے جا سکتا ہے۔ میتھیلین بلیو اس فرق کو سمجھنے کے لیے مفید ہے، کیونکہ اسے دونوں طرح عمل کرتے دیکھا گیا ہے: بعض تجرباتی تیاریوں میں ATP کے ساتھ آکسیجن کا استعمال بڑھاتے ہوئے، اور بعض میں آکسیجن کا استعمال بڑھاتے ہوئے جبکہ ATP برقرار رہتا ہے یا کم ہو جاتا ہے۔

جو قارئین پہلے الیکٹرانوں کی منتقلی کی وسیع تر تصویر سمجھنا چاہتے ہیں، وہ اس وضاحت سے آغاز کر سکتے ہیں کہ میتھیلین بلیو تنفسی زنجیر میں الیکٹرانوں کو کیسے منتقل کرتا ہے۔ اور جو ابتدائی آکسیجن تجربات کی اصطلاحات سمجھنا چاہتے ہیں، وہ پڑھ سکتے ہیں کہ تنفس کی پہلی پیمائشوں نے حقیقت میں کیا دکھایا تھا۔

تنفس، ATP اور ان کے درمیان میلان

NADH اور FADH2 سے آنے والے الیکٹران کمپلیکس I اور II پر زنجیر میں داخل ہوتے ہیں، کمپلیکس III سے گزر کر سائٹوکروم c تک پہنچتے ہیں، پھر کمپلیکس IV سے ہوتے ہوئے آکسیجن تک جاتے ہیں۔ کمپلیکس I، III اور IV پر خارج ہونے والی توانائی پروٹونوں کو میٹرکس سے باہر، جھلیوں کے درمیان کی جگہ میں پمپ کرتی ہے۔ برقی بار اور تیزابیت کی یہ علیحدگی پروٹون محرک قوت بناتی ہے، اور اس کا برقی جزو، یعنی جھلی کا برقی پوٹینشل، عموماً غالب ہوتا ہے۔

ATP سنتھیز پروٹونوں کو واپس میٹرکس میں بہنے دیتا ہے اور خارج ہونے والی توانائی استعمال کرکے ADP اور فاسفیٹ کو جوڑ کر ATP بناتا ہے۔ یوں سلسلہ یہ ہے:

آکسیجن کا استعمال، پھر پروٹونوں کی پمپنگ، پھر میلان، پھر ATP کی ترکیب۔

مسئلہ یہ ہے کہ پروٹون دوسرے راستوں سے بھی واپس آ سکتے ہیں۔ واپسی کا کوئی بھی راستہ جو ATP سنتھیز کو بائی پاس کرے، پروٹون کا رساؤ کہلاتا ہے۔ رساؤ زنجیر کو مجبور کرتا ہے کہ وہ جھلی کا پوٹینشل برقرار رکھنے کے لیے انہی پروٹونوں کو دوبارہ پمپ کرے۔ اس میں زیادہ آکسیجن استعمال ہوتی ہے، مگر زیادہ ATP نہیں بنتا۔ کافی شدید رساؤ اَن کپلنگ، یعنی اس وابستگی کے ٹوٹنے، کا باعث بنتا ہے: آکسیجن کا استعمال بڑھتا ہے جبکہ ATP برقرار رہتا ہے یا کم ہو جاتا ہے، اور ضائع ہونے والی توانائی حرارت کی صورت میں خارج ہوتی ہے۔

حالت 3، حالت 4 اور تنفسی کنٹرول کا تناسب

اس کی روایتی اصطلاحات الگ کیے گئے مائٹوکانڈریا کے تجربات سے آئی ہیں۔ حالت 3 وہ تنفس ہے جس میں سبسٹریٹ کے ساتھ ADP بھی موجود ہو: ATP سنتھیز میلان کو کم کرتا ہے، جھلی کا پوٹینشل گرتا ہے، زنجیر اسے دوبارہ قائم کرنے کے لیے تیز ہو جاتی ہے، اور آکسیجن کا استعمال زیادہ ہوتا ہے کیونکہ ATP بن رہا ہوتا ہے۔ حالت 4 وہ تنفس ہے جو ADP ختم ہونے کے بعد ہوتا ہے: ATP سنتھیز تقریباً غیر فعال ہو جاتا ہے، میلان بڑھتا ہے، جھلی کا بلند پوٹینشل مزید پمپنگ کی مزاحمت کرتا ہے، اور آکسیجن کا استعمال صرف اس سطح تک رہ جاتا ہے جو رساؤ کی تلافی کے لیے ضروری ہو۔

اس لیے تنفسی کنٹرول کا تناسب، یعنی حالت 3 کو حالت 4 سے تقسیم کرنے کا حاصل، یہ ظاہر کرتا ہے کہ تجرباتی تیاری میں کپلنگ کتنی مضبوط ہے۔ بلند تناسب کا مطلب ہے کہ ADP تنفس کو مضبوطی سے کنٹرول کرتا ہے۔ اگر حالت 4 بڑھنے کے ساتھ تناسب گرے تو اس کا مطلب ہے کہ رساؤ غالب آ رہا ہے۔ اسی زاویے سے نیچے دیے گئے میتھیلین بلیو کے نتائج سمجھ میں آتے ہیں۔

ایک تصور ذہن میں رکھنا مفید ہے۔ جھلی کا بلند پوٹینشل زنجیر کو سست کرتا ہے۔ پوٹینشل کا زائل ہونا اسے تیز کرتا ہے۔ زنجیر اس بات پر ردِعمل دیتی ہے کہ پمپنگ کتنی مشکل ہو گئی ہے، براہِ راست اس بات پر نہیں کہ ATP بن رہا ہے یا نہیں۔

جب دونوں پیمائشی نتائج ساتھ بدلتے ہیں

کپلنگ کی سب سے واضح مثال گنی پگ کے دماغ سے الگ کیے گئے مائٹوکانڈریا سے ملتی ہے، جن کے تنفسی کمپلیکس بند کر دیے گئے تھے۔ میتھیلین بلیو کی 100 nanomolar سے 1 micromolar تک کی ارتکازی سطحوں پر، جب گلوٹامیٹ کے ساتھ میلیٹ، سکسینیٹ یا گلیسروفاسفیٹ بطور ایندھن موجود تھا، آرام کی حالت میں آکسیجن کا استعمال بڑھا، جبکہ ADP سے تحریک یافتہ تنفس میں کوئی تبدیلی نہیں ہوئی۔ جن مائٹوکانڈریا میں زہریلے عامل سے کمپلیکس I یا کمپلیکس III کو روکا گیا تھا، ان میں اس رنگ دار مادے نے ATP کی پیداوار میں معمولی اضافہ کیا، جھلی کا پوٹینشل بحال کیا اور کیلشیم کے جذب کو بہتر بنایا۔ مجوزہ راستہ ایک مختصر متبادل راستہ ہے: یہ مادہ رکاوٹ سے پہلے الیکٹران قبول کرتا ہے اور انہیں سائٹوکروم c کے حوالے کر دیتا ہے، یوں خراب کمپلیکس کو بائی پاس کرتا ہے۔

کپلنگ کی دوسری مثال میں ATP کا ماخذ بالکل مختلف ہے۔ دماغ سے الگ کیے گئے ایسے مائٹوکانڈریا میں جن کا ATP سنتھیز روک دیا گیا تھا، میتھیلین بلیو نے پھر بھی ہر آزمائے گئے سبسٹریٹ پر تنفس کو تحریک دی۔ لیکن ATP کی ترکیب صرف الفا کیٹوگلوٹاریٹ اور گلوٹامیٹ پر بڑھی، یعنی ان دو سبسٹریٹس پر جو سکسینائل CoA بناتے ہیں۔ اولیگومائسن کے ذریعے ATP سنتھیز بند ہونے کی حالت میں اضافی ATP، سٹرک ایسڈ چکر میں سکسینائل CoA لائگیز کے ذریعے سبسٹریٹ کی سطح پر فاسفوریلیشن سے بنا، آکسیڈیٹو فاسفوریلیشن سے نہیں۔ جب کمپلیکس I اور ATP سنتھیز دونوں کو ایک ساتھ روکا گیا تو اس مادے نے جھلی کا پوٹینشل بھی بحال کیا۔ یہاں آکسیجن کا استعمال اور ATP ساتھ بڑھے، مگر صرف وہاں جہاں سبسٹریٹ نے ATP بنانے کے دوسرے راستے کی گنجائش دی۔ سکسینیٹ یا میلیٹ پر تنفس بڑھا، مگر اضافی ATP نہیں بنا۔ وہی رنگ دار مادہ، وہی چیمبر، مختلف ایندھن اور مختلف نتیجہ۔

جب دونوں پیمائشی نتائج الگ سمتوں میں جاتے ہیں

نتائج کے الگ ہونے کی مثالیں بھی شائع ہو چکی ہیں اور اتنی ہی سبق آموز ہیں۔ 1997 میں چوہے کے جگر سے الگ کیے گئے مائٹوکانڈریا کے ایک مطالعے میں، میتھیلین بلیو نے مضبوط کپلنگ والے، سکسینیٹ پر تنفس کرنے والے مائٹوکانڈریا میں حالت 4 کا تنفس تیز کیا، جس سے تنفسی کنٹرول کا تناسب گر گیا۔ یہ اثر 0.5 micromolar سے نظر آنے لگا اور 5 micromolar پر شدید تھا۔ یہ ارتکاز، 100 milligram کی ایک بار میں دی جانے والی وریدی خوراک کے بعد پلازما کی سطحوں کے قریب ہے۔ 5 micromolar پر مائٹوکانڈریا پھولے بھی، لیکن کپلنگ کا نقص پہلے ہی کم ارتکازی سطحوں پر ظاہر ہو گیا تھا۔ اس سے یہ تائید ہوتی ہے کہ رساؤ ساختی نقصان سے پہلے شروع ہوا، اس کے نتیجے میں نہیں۔ اَن کپل شدہ مائٹوکانڈریا میں اس مادے نے تنفس کو ارتکاز پر منحصر انداز میں تحریک دی، اور یہ اثر ایک حد پر پہنچ کر مزید نہیں بڑھتا تھا۔ دونوں تجرباتی تیاریوں میں آکسیجن کا استعمال بڑھا۔ استعمال ہونے والی آکسیجن کے مقابلے میں ATP کی ترکیب نہیں بڑھی۔ ایک ہی سالمے میں اَن کپلنگ اور الیکٹرانوں کی منتقلی کی یہ درسی مثال ہے۔

سب سے نمایاں فرق شبکیے میں سامنے آتا ہے۔ AIF کی کمی والے چوہوں اور روٹینون سے برتے گئے فوٹوریسیپٹر خلیوں میں، میتھیلین بلیو نے شبکیے کی موٹائی، فوٹوریسیپٹر کے نشانگر اور مائٹوکانڈریا کی ساخت برقرار رکھی۔ اس نے NADH اور NAD کا تناسب بھی کم کیا اور دباؤ کے ردِعمل کے راستوں کو کم فعال کیا، جن میں غیر تہہ شدہ پروٹین کا ردِعمل اور مائٹوفیجی شامل تھے۔ یہ سب ATP کی کمی دور کیے بغیر ہوا۔ توانائی بحال کیے بغیر تحفظ ملنے کا مطلب ہے کہ فائدہ ریڈوکس توازن اور مائٹوکانڈریا کی سالمیت کے ذریعے حاصل ہوا، اضافی ATP کے ذریعے نہیں۔ جو کوئی بافت کے برقرار رہنے کو توانائی کی پیداوار بحال ہونے کے برابر سمجھے گا، وہ اس تجربے کی مکمل طور پر غلط تشریح کرے گا۔

دماغ کے مائٹوکانڈریا پر ہونے والا کام اسی حساب میں ایک قیمت بھی دکھاتا ہے۔ انہی کم ارتکازی سطحوں نے، جن پر حیاتی توانائی کے عمل بہتر ہوئے، ہر آزمائی گئی حالت میں ہائیڈروجن پرآکسائیڈ کی پیداوار بھی بڑھائی اور اس کے خاتمے کو سست کیا۔ یہ پیمائش کسی غیر مخصوص رنگ دار مادے کے بجائے کیلیبریٹ شدہ Amplex جانچ سے کی گئی تھی۔ زیادہ ATP کے ساتھ زیادہ آکسیڈنٹ بھی آیا۔

مطالعہ پڑھنے کی ایک عملی جانچ فہرست

چار سوال کپلنگ والے نتیجے کو اَن کپلنگ والے نتیجے سے الگ کرتے ہیں۔

پہلا، حقیقت میں کون سا پیمائشی نتیجہ ناپا گیا تھا۔ صرف آکسیجن کا استعمال ATP کے بارے میں نہیں بتا سکتا۔ ATP کی ترکیب، جھلی کا پوٹینشل اور تنفسی کنٹرول کا تناسب، ہر ایک وہ معلومات فراہم کرتا ہے جو آکسیجن الیکٹروڈ نہیں دیکھ سکتا۔ میتھیلین بلیو کی تحقیق کے دعوے پڑھنے کی رہنما تحریر، پیمائشی نتائج کے بارے میں اس احتیاط کی تفصیلی وضاحت کرتی ہے۔

دوسرا، مائٹوکانڈریا کو کون سا سبسٹریٹ دیا گیا تھا۔ سکسینائل CoA والا نتیجہ دکھاتا ہے کہ ایندھن کا انتخاب یہ طے کر سکتا ہے کہ اضافی تنفس سے اضافی ATP بن بھی سکتا ہے یا نہیں۔

تیسرا، کون سا ارتکاز استعمال کیا گیا تھا۔ دماغ کے مائٹوکانڈریا میں میتھیلین بلیو کی nanomolar سے کم micromolar سطحوں نے حیاتی توانائی کے عمل میں معمولی بہتری دی، مگر اس کے ساتھ آکسیڈنٹ کی قیمت بھی تھی؛ جگر کے مائٹوکانڈریا میں آدھے micromolar اور اس سے زیادہ ارتکاز نے کپلنگ کمزور کی؛ 5 micromolar پر پھولنا بھی شامل ہو گیا۔ ارتکاز طریقۂ کار کا حصہ ہے، محض پس منظر کی تفصیل نہیں۔

چوتھا، نتیجہ کس تجرباتی ماڈل میں حاصل ہوا تھا۔ الگ کیے گئے مائٹوکانڈریا اندرونی راستے واضح کرتے ہیں، لیکن سالم خلیے اور بافتیں نقل و حمل، بے رنگ شکل میں تخفیف، اور الیکٹران قبول کرنے والے مسابقتی راستوں جیسے عوامل بھی شامل کرتی ہیں۔ تجربہ گاہ میں خوراک سے متعلق کام، جس میں یہ بھی شامل ہے کہ ارتکاز اور تجرباتی طریقۂ کار میتھیلین بلیو کے اثرات کو کیسے بدلتے ہیں، چیمبر میں حاصل ہونے والے اعداد اور کسی انسان کے بارے میں کسی بھی دعوے کے درمیان پل ہے۔

آکسیجن کا استعمال الیکٹرانوں کے بہاؤ کو ظاہر کرتا ہے۔ ATP ظاہر کرتا ہے کہ اس بہاؤ کی کتنی توانائی محفوظ کی گئی۔ میتھیلین بلیو ان میں سے کسی بھی ایک کو بدل سکتا ہے، اور اوپر دیے گئے تجربات اس سے پیدا ہونے والی چاروں صورتیں دکھاتے ہیں: دونوں بڑھتے ہیں، تنفس بڑھتا ہے مگر اضافی ATP صرف وہاں بنتا ہے جہاں سبسٹریٹ اجازت دے، تنفس بڑھتا ہے جبکہ کپلنگ کم ہوتی ہے، اور بافت برقرار رہتی ہے جبکہ ATP میں اضافہ نہیں ہوتا۔ آکسیجن الیکٹروڈ پر نظر آنے والا عدد تشریح کا آغاز ہے، اس کا اختتام نہیں۔