Spektrum ng pagsipsip ng methylene blue at molar absorptivity: isang sangguniang may nakatalang mga kondisyon

Mukhang simple ang spektrum ng methylene blue hanggang sa subukan mong muling gamitin ang isang bilang mula rito. Isang laboratoryo ang nag-uulat ng molar extinction coefficient na malapit sa 82,000. Isa naman ang nag-uulat ng 67,000. Ang ikatlo ay nag-uulat ng mahigit 100,000. Maaaring tama ang tatlo bilang paglalarawan ng kani-kanilang pagsukat, at wala sa mga ito ang isang unibersal na constant para sa tina.

Nagmumula ang kalituhan sa paghahalo ng dalawang magkaibang konsepto. Ang absorbance ay isang pagsukat sa isang partikular na solusyon sa isang partikular na selula. Ang molar absorptivity, na madalas isulat bilang epsilon, ay isang parameter sa modelo ng solusyong iyon. Kapag nagbago ang estado ng pagkakaugnay ng mga molekula ng methylene blue, nagbabago ang modelo, kaya nagbabago rin ang parameter. Kapaki-pakinabang na ituring ang bawat koepisyente bilang isang halagang may nakatalang mga kondisyon: dapat laging kasama ng bilang ang wavelength, solvent, pH o buffer, temperatura, saklaw ng konsentrasyon, at haba ng landas.

Ang banda ng monomer sa malabnaw na solusyon sa tubig

Sa malabnaw na solusyon sa tubig, ang nangingibabaw na banda ng kation ng methylene blue ay malapit sa 664 hanggang 665 nm, at karaniwang binabanggit sa loob ng 664 hanggang 668 nm depende sa instrumento at piniling kalibrasyon. Ang bandang iyon ang tamang piliin para sa kuwantipikasyon kapag sapat ang pagkalabnaw ng solusyon upang karamihan ng tina ay nasa anyong monomer.

Ipinapakita ng tatlong halaga mula sa literatura kung bakit mas mahalaga ang mga kondisyon kaysa sa pangunahing bilang. Ang mga mananaliksik ng luwad na nagpapanatili ng mga sampol sa tubig sa ibaba ng humigit-kumulang 7 micromolar sa mga selulang 1 cm ay nag-ulat ng epsilon na humigit-kumulang 82,000 M-1 cm-1 sa 665 nm. Ang halagang iyon ay may pambihirang linaw ng dokumentasyon bilang empirikal na slope ng kalibrasyon para sa napakalalabnaw na sampol sa tubig. Isang mas huling pangunahing kalibrasyon sa deionized na tubig, na gumamit ng 2.34 hanggang 37.52 micromolar at landas na 1 cm, ang nagbigay ng humigit-kumulang 67,100 M-1 cm-1 sa 665 nm para sa kabuuang tina. Inaasahan ang mas mababang resulta at hindi ito salungat sa nauna, dahil may kapansin-pansin nang dami ng dimer sa itaas na kalahati ng saklaw ng kalibrasyong iyon. Ang ikatlong halaga, humigit-kumulang 73,460 M-1 cm-1 sa 664 nm, ay mula sa pag-aaral sa pH 6.86 at 293 K na naghiwalay sa naobserbahang spektrum sa mga bahagi ng monomer at dimer, gaya ng binuod sa isang kamakailang kritikal na pagsusuri ng photophysics ng methylene blue. Ang bilang na iyon ay isang bahaging monomer na inihiwalay sa pamamagitan ng deconvolution, hindi isang direktang slope ng absorbance laban sa kabuuang tina.

Ang praktikal na punto: piliin ang koepisyenteng may mga kondisyong tumutugma sa iyong mga sampol, o gumawa ng sarili mong kalibrasyon. Huwag basta gamitin ang 82,000 sa isang assay na may phosphate buffer at 30 micromolar at ipagpalagay na nananatiling linear ang relasyon.

Ang balikat sa mas maikling wavelength ay isang halo

Habang tumataas ang konsentrasyon, lumalaki ang isang balikat malapit sa 600 hanggang 615 nm kaugnay ng rurok sa 664 nm. Karaniwang inilalagay ng mga makabagong pag-aaral ang ambag ng dimer na uri H malapit sa 605 hanggang 610 nm. Ang pangkalahatang pagsusuri ng spektrum ng methylene blue sa tubig ay naghihiwalay ng isang maksimum ng dimer sa 607 nm at isang maksimum ng mas mataas na agregato sa 600 nm, na may mga bahagi ng resonance ng monomer sa 664 at 650 nm. Makukuha ang buong teksto nito sa pamamagitan ng tala na may bukas na akses para sa PMID 33251415.

Hindi dapat lagyan ng tatak ang balikat na iyon bilang absorbance ng purong dimer. May ambag din ang vibronic na estruktura ng monomer sa parehong rehiyon, kaya ang nasusukat na taas ay resulta ng pagpapatong ng mga ambag. Natuklasan sa isang pangkalahatang pag-aangkop ng modelo na hindi sapat ang modelong monomer kasama ang dimer sa buong saklaw na 1.1 micromolar hanggang 3.4 millimolar, samantalang ang pagdaragdag ng tetramer ang nagbigay ng pinakamahusay na pag-aangkop, at natutukoy na ang signal ng tetramer kahit sa ibaba ng 34 micromolar. Malalaki ang mga halaga ng lakas ng mga bahaging nakuha sa pag-aangkop: humigit-kumulang 107,800 M-1 cm-1 sa 664 nm para sa pangunahing bahaging monomer, humigit-kumulang 101,400 para sa dimer sa 607 nm, at humigit-kumulang 138,500 para sa tetramer sa 600 nm, sa deionized na tubig na walang buffer, na may sodium chloride mula 0 hanggang 0.15 M at mga temperaturang mula 282 hanggang 333 K. Mga bahaging inihiwalay gamit ang modelo ang mga ito, kaya hindi dapat ipalit sa isang empirikal na slope ng Beer Lambert.

Direktang nasukat ang lakas ng dimerisasyon. Sa pH 6.86 at 293 K, nakakuha ang isang pag-aaral ng constant ng dimerisasyon na malapit sa 3,900 M-1. Ipinapaliwanag ng laki ng halagang iyon kung bakit halos linear ang asal ng isang gumaganang solusyon na 5 micromolar ngunit hindi ng isang stock na 50 micromolar. Isang kapaki-pakinabang na pagsusuri habang binubuo ang pamamaraan ang ratio ng absorbance malapit sa 610 nm sa absorbance malapit sa 665 nm. Kapag tumataas ang ratio na iyon kasabay ng konsentrasyon, hindi na inilalarawan ng epsilon sa 664 nm ang iisang species na hindi nagbabago.

Sa isang pagitan ng konsentrasyon na pinangingibabawan ng isang pares ng mga species na nagpapalitan ng anyo, maaaring magkaroon ang mga spektrum ng iisang isosbestic point, na naobserbahan sa eksperimento malapit sa 625 nm sa mga serye ng solusyon sa tubig. Ang isang malinaw at hindi gumagalaw na punto ay naaayon sa pagkakaroon ng dalawang nangingibabaw na species. Kapag lumilipat o nawawala ang puntong iyon habang tumataas ang konsentrasyon, ituring ito bilang babala na may lumitaw nang mas mataas na mga agregato o nagbabagong mga ekilibriyo, hindi bilang pagkakamali ng instrumento.

Binabago ng solvent, pH, at temperatura ang spektrum

Pinapaboran ng tubig ang pagkakaugnay ng mga molekula. Ang pagdaragdag ng dimethyl sulfoxide ay pumipigil sa dimerisasyon, naglilipat sa mga maksimum ng pagsipsip at fluorescence patungo sa mas mahabang wavelength, at nagpapataas ng fluorescence quantum yield nang humigit-kumulang apat na beses, ayon sa pag-aaral ng solvent para sa methylene blue sa mga halo ng tubig at DMSO, na nakatala bilang PMID 30933781. Itinuturing ng pag-aaral na iyon ang mga spektrum sa tubig bilang isang ekilibriyo ng monomer at dimer, na may absorbance ng monomer malapit sa 650 hanggang 670 nm at absorbance ng dimer malapit sa 580 hanggang 615 nm, at kinukuha nito ang mga constant ng dimerisasyon mula sa mga spektrum sa 293.15 K.

Binabago ng mga alkohol ang parehong posisyon at tila lakas, ngunit hindi nila inaalis ang pagbuo ng mga agregato. Sa isang pangunahing paghahambing sa 31.3 micromolar at temperatura ng silid, na iniulat sa isang pag-aaral ng solvent para sa methylene blue, ang maksimum sa mahabang wavelength ay 665 nm sa tubig ngunit 655 nm sa methanol, na may mga tila halaga para sa kabuuang solusyon na malapit sa 37,100 sa tubig at 60,800 sa methanol. Isang hiwalay na pagpapatunay sa absolute ethanol sa 298 K ang nagbigay ng maksimum sa 655 nm na may epsilon na malapit sa 68,000.

Mas kaunti ang paggalaw ng spektrum dahil sa karaniwang mga pagbabago sa pH kaysa sa ipinapalagay ng maraming protokol. Iniulat ng kritikal na pagsusuring binanggit sa itaas na mula sa humigit-kumulang pH 2 hanggang pH 12, nanatiling malapit sa 665 nm ang maksimum, na may maliliit lamang na pagbabago sa lakas hanggang pH 11. Maaaring baguhin ng uri ng buffer at ionic strength ang mga resulta nang kasinglaki ng nominal na pH, kaya itala ang aktuwal na buffer at asin, hindi lamang ang pagbasa ng pH meter. Hiwalay na kaso ang malakas na asido o malakas na alkali dahil maaaring sumailalim ang tina sa pagbabagong kemikal sa halip na nababaligtad na pagkakaugnay ng mga molekula. Binabago rin ng temperatura at asin ang ekilibriyo, kaya sadyang binago ang dalawang ito sa pag-aaral sa tubig noong 2020.

Pagsukat upang manatiling wasto ang bilang

Nakabatay ang gawaing kuwantitatibo sa relasyon ng Beer Lambert, kung saan ang absorbance ay katumbas ng epsilon na minumultiplika sa konsentrasyon at haba ng landas, kasama ang patunay na talagang nananatiling linear ang pagitan sa iyong mga kondisyon.

Gumamit ng selulang 1 cm para sa gawain sa mababang konsentrasyong micromolar. Kung ang epsilon ay malapit sa 82,000, ang 5 micromolar ay nagbibigay ng absorbance na malapit sa 0.41 at ang 10 micromolar ay nagbibigay ng humigit-kumulang 0.82. Para sa pagsukat na nakatuon sa monomer sa tubig lamang, mas ligtas na manatili malapit sa o mas mababa sa humigit-kumulang 5 hanggang 7 micromolar kaysa magkakalibrasyon hanggang sa hanay ng sampu-sampung micromolar. Para sa mga konsentradong stock, paikliin ang landas sa halip na tanggapin ang absorbance na lubhang lampas sa 1.

Gumamit ng blank na may eksaktong kaparehong matrix: parehong grado ng tubig, parehong proporsyon ng kasamang solvent, parehong buffer at mga asin, ngunit walang tina. Ihanda ang mga pamantayan ng kalibrasyon sa parehong matrix at sa parehong temperatura. I-scan ang buong saklaw ng nakikitang liwanag habang binubuo ang pamamaraan, mas mainam kung humigit-kumulang 550 hanggang 750 nm, sa halip na magbasa sa iisang wavelength. Subaybayan ang hugis, hindi lamang ang taas. Kung binabago ng sunud-sunod na pagpapalabnaw ang hugis na na-normalize, nakadepende sa konsentrasyon ang sistemang kemikal. Ang isang matatag na maksimum at isang matatag na ratio sa 610 hanggang 665 nm ay mas matibay na ebidensiya para sa isang katanggap-tanggap na saklaw kaysa sa mataas na R squared lamang.

Idokumento ang anyo ng reagent. Ang komersiyal na materyal ay maaaring anhydrous methylthioninium chloride o isang hydrate gaya ng trihydrate, kaya dapat tumugma sa aktuwal na laman ng bote ang molar mass na ginagamit sa mga pagkalkula ng stock. Ang hakbang na ito lamang ay nagpapaliwanag na ng bahagi ng pagkakaiba sa mga nominal na molar na konsentrasyon sa iba't ibang laboratoryo. Kailangan ang katulad na disiplina kapag ginagamit ang mga resulta sa mga kalkulasyon ng kuwantitatibong assay, kapag sinusuportahan ng mga spektrum ang pagsusuri sa katatagan ng pormulasyon, at kapag nangangailangan ang mga profile ng dumi ng pagsusuri sa kadalisayan at mga espesipikasyon.

Buod na may nakatalang mga kondisyon

Gamitin ang talahanayang ito bilang panimulang template para sa tala ng laboratoryo, hindi bilang pinagmumulan ng mga constant na maaaring basta pagpalitin.

Samakatuwid, ang wavelength ng absorbance ng methylene blue ay isang maikling sagot na may mahabang talababa. Iulat ang rurok na sinukat mo, sa solusyong sinukat mo, sa konsentrasyong sinukat mo. Pinipigilan ng ganitong gawi na maging isang maling unibersal na constant ang isang halagang malapit sa 664 nm mula sa malabnaw na solusyon sa tubig.