ATP at methylene blue: ang mas maraming paggamit ng oksiheno ba ay nangangahulugang mas maraming enerhiya?

Nasa isang silid ng pagsukat ang isang inihiwalay na mitochondrion na may gatong ngunit walang ADP. Mabagal itong kumonsumo ng oksiheno. Magdagdag ng ADP at tataas nang ilang ulit ang pagkonsumo ng oksiheno. Hintaying maubos ang ADP at bababa muli ang pagkonsumo ng oksiheno. Hindi nagbago ang gatong. Ang pangangailangan lamang para sa ATP ang nagbago.

Nakapaloob sa maikling pagkakasunod-sunod na iyon ang buong pagkakaibang tinatalakay ng artikulong ito. Sinusukat ng pagkonsumo ng oksiheno kung gaano kabilis dumadaloy ang mga elektron sa kadena ng respirasyon patungo sa oksiheno. Sinusukat naman ng produksiyon ng ATP kung gaano karami sa daloy na iyon ang nakukuha bilang nagagamit na enerhiya. May iisang hakbang sa pagitan ng dalawa: ang gradiente ng proton sa magkabilang panig ng panloob na membrana ng mitochondrion. Anumang nagbabago sa higpit ng pagkakaugnay ng gradiente sa sintesis ng ATP ay maaaring magtulak sa dalawang sinusukat na kinalabasan sa magkaibang direksiyon. Kapaki-pakinabang na halimbawa rito ang methylene blue dahil naobserbahan itong gawin ang pareho: pinapataas nito ang paggamit ng oksiheno kasabay ng ATP sa ilang paghahanda, at pinapataas ang paggamit ng oksiheno habang hindi nagbabago o bumababa ang ATP sa iba.

Ang mga mambabasang nais munang makita ang mas malawak na larawan ng pagpapasa ay maaaring magsimula sa kung paano inililipat ng methylene blue ang mga elektron sa kadena ng respirasyon. Ang mga nais namang maunawaan ang mga terminong ginamit sa mga unang eksperimento sa oksiheno ay maaaring magbasa tungkol sa kung ano talaga ang ipinakita ng mga unang pagsukat ng respirasyon.

Respirasyon, ATP, at ang gradiente sa pagitan nila

Ang mga elektron mula sa NADH at FADH2 ay pumapasok sa kadena sa mga complex I at II, dumaraan sa complex III patungo sa cytochrome c, at pagkatapos ay sa complex IV patungo sa oksiheno. Ang enerhiyang inilalabas sa mga complex I, III, at IV ang nagbobomba ng mga proton palabas ng matrix patungo sa espasyo sa pagitan ng mga membrana. Ang paghihiwalay na iyon ng kargang elektrikal at kaasiman ang puwersang nagtutulak sa mga proton, at ang elektrikal na bahagi nito, ang potensiyal ng membrana, ang karaniwang nangingibabaw na bahagi.

Hinahayaan ng ATP synthase na dumaloy pabalik sa matrix ang mga proton at ginagamit ang inilalabas na enerhiya upang pagsamahin ang ADP at pospato bilang ATP. Kaya ganito ang pagkakasunod-sunod:

pagkonsumo ng oksiheno, pagkatapos ay pagbobomba ng proton, pagkatapos ay gradiente, pagkatapos ay sintesis ng ATP.

Ang problema ay maaaring bumalik ang mga proton sa ibang mga ruta. Anumang pagbalik na lumalampas sa ATP synthase ay pagtagas ng proton. Pinipilit ng pagtagas ang kadena na muling ibomba ang parehong mga proton upang mapanatiling matatag ang potensiyal ng membrana. Kumokonsumo ito ng mas maraming oksiheno nang hindi gumagawa ng mas maraming ATP. Kapag sapat ang lakas ng pagtagas, humihiwalay ang pagkakaugnay: tumataas ang paggamit ng oksiheno habang hindi nagbabago o bumababa ang ATP, at lumalabas bilang init ang nasayang na enerhiya.

State 3, state 4, at ang proporsiyon ng kontrol sa respirasyon

Nagmula sa mga inihiwalay na mitochondria ang mga klasikong termino para rito. Ang state 3 ay respirasyon kapag may substrato at ADP: binabawasan ng ATP synthase ang gradiente, bahagyang bumababa ang potensiyal ng membrana, bumibilis ang kadena upang muling buuin ito, at mataas ang paggamit ng oksiheno dahil gumagawa ng ATP. Ang state 4 ay respirasyon matapos maubos ang ADP: hindi aktibo ang ATP synthase, tumataas ang gradiente, nahahadlangan ng mataas na potensiyal ng membrana ang karagdagang pagbobomba, at bumababa ang paggamit ng oksiheno sa antas na kailangan lamang upang mapunan ang pagtagas.

Samakatuwid, ipinapakita ng proporsiyon ng kontrol sa respirasyon, ang state 3 na hinati sa state 4, kung gaano kahigpit ang pagkakaugnay sa paghahanda. Ang mataas na proporsiyon ay nangangahulugang malakas na kinokontrol ng ADP ang respirasyon. Ang bumababang proporsiyon kasabay ng tumataas na state 4 ay nangangahulugang nangingibabaw na ang pagtagas. Sa ganitong pananaw mauunawaan ang mga resulta ng methylene blue sa ibaba.

May isang konseptong mahalagang tandaan. Pinapabagal ng mataas na potensiyal ng membrana ang kadena. Pinapabilis naman ito ng pagwawaldas ng potensiyal. Tumutugon ang kadena sa kung gaano kahirap ang pagbobomba, hindi tuwiran sa kung gumagawa ng ATP o hindi.

Kapag magkasabay na nagbabago ang mga kinalabasan

Ang pinakamalinaw na halimbawa ng magkakaugnay na pagbabago ay mula sa mga inihiwalay na mitochondria ng utak ng guinea pig na may mga nakaharang na complex sa respirasyon. Sa 100 nanomolar hanggang 1 micromolar na methylene blue, tumaas ang pagkonsumo ng oksiheno habang nagpapahinga kapag glutamate kasama ang malate, succinate, o glycerophosphate ang gatong, samantalang hindi nagbago ang respirasyong pinasigla ng ADP. Sa mga mitochondria na nilason sa complex I o complex III, bahagyang pinataas ng tina ang produksiyon ng ATP, ibinalik ang potensiyal ng membrana, at pinahusay ang pagpasok ng calcium. Ang iminungkahing ruta ay isang mas maikling daan: tumatanggap ang tina ng mga elektron bago ang harang at ipinapasa ang mga ito sa cytochrome c, kaya nalalampasan ang napinsalang complex.

Gumagamit ang ikalawang kaso ng magkasabay na pagbabago ng lubos na naiibang pinagmumulan ng ATP. Sa mga inihiwalay na mitochondria ng utak na may hinadlangang ATP synthase, pinasigla pa rin ng methylene blue ang respirasyon sa bawat substratong sinubukan. Ngunit tumaas lamang ang sintesis ng ATP sa alpha ketoglutarate at glutamate, ang dalawang substratong bumubuo ng succinyl CoA. Dahil hinaharangan ng oligomycin ang ATP synthase, nagmula ang karagdagang ATP sa posporilasyon sa antas ng substrato na isinasagawa ng succinyl CoA ligase sa siklo ng citric acid, hindi sa oksidatibong posporilasyon. Ibinalik din ng tina ang potensiyal ng membrana nang sabay na hinadlangan ang complex I at ATP synthase. Dito, magkasabay na nagbago ang paggamit ng oksiheno at ATP, ngunit kapag pinahintulutan lamang ng substrato ang ikalawang landas ng paggawa ng ATP. Sa succinate o malate, tumaas ang respirasyon nang walang karagdagang ATP. Parehong tina, parehong silid ng pagsukat, ibang gatong, ibang sagot.

Kapag magkaiba ang pagbabago ng mga kinalabasan

Nailathala rin ang mga kasong may magkaibang pagbabago, at marami ring matututuhan sa mga ito. Sa isang pag-aaral noong 1997 sa mga inihiwalay na mitochondria ng atay ng daga, pinabilis ng methylene blue ang state 4 na respirasyon sa mga mitochondria na may mahigpit na pagkakaugnay at gumagamit ng succinate sa respirasyon, kaya bumaba ang proporsiyon ng kontrol sa respirasyon. Nakikita na ang epekto mula sa 0.5 micromolar at malakas ito sa 5 micromolar, isang konsentrasyong malapit sa mga antas sa plasma matapos ang isang 100 milligram na bolus na ibinigay sa ugat. Sa 5 micromolar, namaga rin ang mga mitochondria, bagaman unang lumitaw ang depekto sa pagkakaugnay sa mas mababang mga konsentrasyon. Ipinahihiwatig nito na nauna ang pagtagas sa pinsala sa estruktura sa halip na nagmula rito. Sa mga mitochondria na hiwalay na ang pagkakaugnay, pinasigla ng tina ang respirasyon sa paraang nakadepende sa konsentrasyon at may hangganan ang pagtaas. Tumaas ang paggamit ng oksiheno sa parehong paghahanda. Hindi tumaas ang sintesis ng ATP sa bawat oksihenong nakonsumo. Iyan ang klasikong halimbawa ng paghihiwalay ng pagkakaugnay kasama ng paglilipat ng elektron, sa iisang molekula.

Ang pinakamatingkad na paghihiwalay ng mga kinalabasan ay mula sa retina. Sa mga dagang kulang sa AIF at mga selulang photoreceptor na nilapatan ng rotenone, napanatili ng methylene blue ang kapal ng retina, mga pananda ng photoreceptor, at estruktura ng mitochondria. Pinababa rin nito ang proporsiyon ng NADH sa NAD at pinahupa ang mga landas ng tugon sa stress, kabilang ang tugon sa mga protinang hindi natiklop at mitophagy. Nagawa nito ang lahat ng iyon nang hindi itinatama ang kakulangan sa ATP. Ang proteksiyon nang walang pagbabalik ng enerhiya ay nangangahulugang dumaan ang benepisyo sa balanse ng redox at integridad ng mitochondria, hindi sa karagdagang ATP. Lubos na mamamali ng pagbasa sa eksperimentong iyon ang sinumang itutumbas ang pananatiling buhay ng tisyu sa naibalik na produksiyon ng enerhiya.

Nagdagdag ng usapin ng kapalit ang pag-aaral sa mitochondria ng utak. Ang parehong mabababang konsentrasyong nagpahusay sa mga proseso ng enerhiya ay nagpalakas din sa pagbuo ng hydrogen peroxide sa bawat kondisyong sinubukan at nagpabagal sa pag-aalis nito. Sinukat ito gamit ang isang nakalibrang Amplex assay sa halip na isang tinang hindi espesipiko. Magkasabay na dumating ang mas maraming ATP at mas maraming oksidante.

Praktikal na talaan ng mga dapat suriin sa pagbasa

Apat na tanong ang naghihiwalay sa resultang may pagkakaugnay at sa resultang wala nito.

Una, aling kinalabasan ang aktuwal na sinukat. Hindi maipapakita ng pagkonsumo ng oksiheno lamang ang ATP. Ang sintesis ng ATP, potensiyal ng membrana, at proporsiyon ng kontrol sa respirasyon ay bawat isang nagdaragdag ng impormasyong hindi nakikita ng elektrod ng oksiheno. Detalyadong tinatalakay ng gabay sa pagbasa ng mga pahayag mula sa pananaliksik sa methylene blue ang disiplinang ito sa pagpili at pag-unawa sa mga sinusukat na kinalabasan.

Ikalawa, aling substrato ang ipinakain sa mga mitochondria. Ipinapakita ng resulta sa succinyl CoA na maaaring magtakda ang pagpili ng gatong kung ang karagdagang respirasyon ay maaari bang maging karagdagang ATP.

Ikatlo, aling konsentrasyon ang ginamit. Ang nanomolar hanggang mababang micromolar na methylene blue sa mitochondria ng utak ay nagbigay ng katamtamang pagpapahusay sa mga proseso ng enerhiya na may kapalit na pagtaas ng oksidante; ang kalahating micromolar at pataas sa mitochondria ng atay ay nagpahina sa pagkakaugnay; sa 5 micromolar, nadagdagan pa ito ng pamamaga. Bahagi ng mekanismo ang konsentrasyon, hindi lamang isang detalye ng konteksto.

Ikaapat, sa aling modelo nakuha ang resulta. Inilalantad ng mga inihiwalay na mitochondria ang mga koneksiyon, ngunit nagdaragdag ang mga buo at hindi nasirang selula at tisyu ng transportasyon, reduksiyon tungo sa anyong walang kulay, at mga nagkakumpitensiyang tagasalo ng elektron. Ang mga pag-aaral sa dami ng ginagamit sa laboratoryo, kabilang kung paano hinuhubog ng konsentrasyon at protokol ang mga epekto ng methylene blue, ang tulay sa pagitan ng mga bilang sa silid ng pagsukat at anumang pahayag tungkol sa isang tao.

Ipinapakita ng pagkonsumo ng oksiheno ang daloy ng elektron. Ipinapakita ng ATP kung gaano karami sa daloy na iyon ang nakuhang enerhiya. Maaaring baguhin ng methylene blue ang alinman sa dalawa, at ipinapakita ng mga eksperimento sa itaas ang lahat ng apat na sumusunod na kumbinasyon: parehong tumataas, tumataas lamang ang respirasyon kung pinahihintulutan ng substrato, tumataas ang respirasyon habang humihina ang pagkakaugnay, at napananatili ang tisyu habang hindi nagbabago ang ATP. Ang bilang sa elektrod ng oksiheno ay simula ng interpretasyon, hindi ang katapusan nito.