Methylene blue sa pananaliksik sa stroke at cerebral hypoperfusion: ano talaga ang ipinapakita ng tatlong modelo

Ang isang baradong arterya, isang kultura ng mga selulang pinagkaitan ng sustansiya, at isang dagang may makikitid na arterya sa leeg ay tila tatlong bersiyon ng iisang eksperimento. Hindi sila ganoon. Magkakaiba ang tanong ng bawat isa, at magkakaiba rin ang sagot ng methylene blue sa bawat isa. Kapag pinaghalo ang mga ito, tila magkakasalungat ang mga pag-aaral. Kapag pinaghiwalay, lumilitaw ang isang malinaw na padron na pangunahing nakasalalay sa tiyempo.

Ang paghihiwalay na iyon ang mismong layunin ng pagsusuring ito. Ang tatlong modelo ay biglaang stroke sa isang tiyak na bahagi ng utak, pagkakait ng oxygen at glucose na sinusundan ng muling pagbibigay ng oxygen sa mga selulang pinalaki sa kultura, at pangmatagalang cerebral hypoperfusion sa loob ng ilang linggo. Ang iminungkahing mekanismong nag-uugnay sa mga ito ay may kinalaman sa mitochondria, ngunit magkakaiba ang mga kinalabasan dahil magkakaiba ang kalagayang metaboliko.

Magkakaibang tanong ang sinasagot ng tatlong modelo

Ang biglaang stroke sa isang tiyak na bahagi ng utak ng mga daga ay karaniwang ginagawa sa pamamagitan ng pagbara sa middle cerebral artery, na pinaikli bilang MCAO. Ang isang baradong kahawig ng pamumuo ng dugo ay lumilikha ng sentrong ischemic na napapalibutan ng penumbra, isang tisyu na nanganganib ngunit maaari pang mailigtas kung bumalik ang daloy. Ang tanong dito ay kung napapabagal ng isang interbensiyon ang paglaki ng infarct o napapanatili ang paggana sa panahon ng reperfusion, o pagbabalik ng daloy ng dugo.

Ang pagkakait ng oxygen at glucose, na pinaikli bilang OGD, ay isinasagawa sa kabaligtarang antas. Ang mga selula ng utak na pinalaki sa kultura ay inilalagay sa halos walang oxygen at walang glucose, saka ibinabalik sa normal na medium. Walang namuong dugo, walang alternatibong sirkulasyon, walang presyon ng dugo, at walang sistemang panlaban ng katawan. Ang tanong ay nakatuon lamang sa selula: ano ang nangyayari sa respirasyon, ATP, at kaligtasan ng mga selula kapag nawala at pagkatapos ay bumalik ang mga substrate.

Ginagamit sa pangmatagalang cerebral hypoperfusion ang permanenteng pagbara sa magkabilang carotid artery ng mga daga, na tinatawag na modelong 2VO. Bumababa ang daloy ng dugo sa harapang bahagi ng utak at nananatiling mababa sa loob ng ilang linggo. Walang biglaang infarct sa isang tiyak na bahagi at walang pang-emerhensiyang reperfusion. Ang tanong ay kung napapanatili ng ilang linggong suportang metaboliko ang mga daluyan ng dugo, mitochondria, at memorya habang matagal na mababa ang daloy.

Samakatuwid, ang pagbuti ng memorya matapos ang isang buwang paggamot sa modelong 2VO ay walang direktang sinasabi tungkol sa pagliligtas sa utak ng tao sa panahon ng pang-emerhensiyang thrombectomy. Mahalaga ang pagkakaibang ito dahil nilalaktawan ito ng karamihan sa mga optimistikong buod.

Biglaang stroke: proteksiyon sa pagbabalik ng daloy, pagpapabagal kapag hindi ito bumalik

Ang pinakamalinaw na resulta sa biglaang stroke ay mula sa pansamantalang MCAO na may reperfusion. Isinailalim ang mga daga sa pagbara sa loob ng 60 minutes, saka binigyan ng mababang dosis ng methylene blue sa ugat simula sa reperfusion, na may mga karagdagang dosis makalipas ang 3 hours at sa araw 2. Ipinakita ng MRI na lumaki nang humigit-kumulang 19 percent ang lesyon sa grupong tumanggap lamang ng pantunaw na walang aktibong gamot pagsapit ng araw 2, samantalang lumiit nang humigit-kumulang 17 percent ang lesyon sa grupong ginamot. Humigit-kumulang 30 percent na mas maliit ang mga huling infarct, at mas maganda ang mga iskor ng paggana ng sistemang nerbiyos sa mga araw 2 at 7. Batay sa imaging, mas maraming tisyu ang nanatiling buhay sa sentro at sa penumbra. Inilalagay ng mas malawak na literatura tungkol sa proteksiyon ng sistemang nerbiyos ang proteksiyong ito na itinapat sa reperfusion kasabay ng mga natuklasan sa global ischemia at trauma.

Nagbabago ang larawan kapag nananatiling barado ang arterya. Sa isang eksperimento ng permanenteng MCAO, pinabagal ng methylene blue na ibinigay habang nagpapatuloy ang ischemia ang paglawak ng lesyong nakikita sa diffusion imaging at panandaliang pinahaba ang perfusion-diffusion mismatch, na may bahagyang mas magandang lokal na daloy. Gayunman, walang makabuluhang pagkakaiba sa huling dami ng infarct sa 24 hours. Naantala nito ang pagiging infarct ng nanganganib na tisyu ngunit hindi nito napalitan ang muling pagbubukas ng daluyan.

Nagdaragdag ang ikatlong pag-aaral sa biglaang stroke ng detalye tungkol sa mekanismo at dosis. Ang isang dosis na ibinigay sa lukab ng tiyan kaagad pagkatapos ng pagbara ay nagpakita ng pinakamalaking pagbawas sa infarct, humigit-kumulang 50 percent, sa gitnang dosis na 5 mg/kg sa halip na sa 1 o 10 mg/kg, kasabay ng mas magandang mga iskor sa pandama at paggalaw. Iniugnay ito ng mga may-akda sa napangalagaang istruktura ng mitochondria at pagtaas ng mitophagy, ang piling pag-aalis ng mga sirang mitochondria. Samakatuwid, mahalaga ang dosis, paraan ng pagbibigay, at iskedyul, at ang mga halagang mg/kg para sa daga ay hindi mga dosis para sa stroke sa tao.

Kultura ng selula: nakatutulong o nakapipinsala ang parehong gamot depende sa kung kailan ito ibinibigay

Ang eksperimento sa astrocyte ang pinakanakapagpapalinaw at pinakamadalas sipiin nang mali. Ang mga pangunahing astrocyte mula sa cerebral cortex ng mga daga ay isinailalim sa 6 hours ng matinding pagkakait sa 0.1 percent oxygen sa medium na walang glucose, pyruvate, o serum, na sinundan ng 24 hours ng muling pagbibigay ng oxygen at pagpapanumbalik ng mga substrate. Namatay ang halos kalahati ng mga selula, kaya may sapat na puwang ang pagsusuri upang maipakita ang alinmang direksiyon ng epekto.

Kapag naroon ang methylene blue sa yugto ng pagkakait, lumala ang kaligtasan ng mga selula sa halip na bumuti. Kapag ipinakilala ito sa muling pagbibigay ng oxygen, napabuti ng mabababang micromolar na konsentrasyon ang kakayahang manatiling buhay ng mga selula at pinataas ang pagkonsumo ng oxygen, pagkuha ng glucose, at paggawa ng ATP. Sa normal na mga kondisyon, pinataas ng parehong mga konsentrasyon ang pagkuha ng glucose nang humigit-kumulang 89 percent sa 0.1 micromolar at mga 200 percent sa 1 micromolar, na may napangalagaang glycogen at aktibidad ng hexokinase pagkatapos ng pinsala at walang nasukat na pagtaas ng superoxide.

Mas madaling maunawaan ang mekanismo kung ihahambing ito sa isang reserbang generator. Gumaganap ang methylene blue bilang alternatibong tagapagdala ng electron na tumatanggap ng mga reducing equivalent at ipinapasa ang mga ito patungo sa cytochrome c at complex IV. Sinusuportahan nito ang daloy ng electron at sintesis ng ATP habang binabawasan ang pagtagas ng electron sa mas naunang bahagi ng proseso. Sa matinding pagkakait, nagiging panganib ang pagpapasiglang iyon dahil pinatataas nito ang pangangailangang metaboliko habang halos walang oxygen at glucose, kaya maaaring mas mabilis maubos ang huling mga reserba. Matapos bumalik ang mga substrate, nagiging kapaki-pakinabang ang parehong katangian dahil tinutulungan nito ang mga sirang mitochondria na mahusay na gamitin ang naibalik na oxygen at glucose. Ito rin ang dahilan kung bakit kailangang isama ang konteksto ng pagkakait kapag tinatalakay ang mga natuklasan mula sa mga paliwanag tungkol sa paglilipat ng electron sa mitochondria.

Isang paalala: ang tuntuning ito tungkol sa tiyempo ay naaangkop sa partikular na paghahandang iyon ng astrocyte. Isang kaugnay na pag-aaral sa selula na gumamit ng ibang uri ng selula, mas banayad na pagkakait, at mas mababang konsentrasyon ang nakakita ng proteksiyon kahit ibinigay ito habang may pagkakait. Ang uri ng selula, natitirang oxygen, konsentrasyon, at pamamaraan ang tumutukoy kung kapaki-pakinabang o nakapipinsala ang epekto.

Pangmatagalang mababang daloy: memorya, cytochrome oxidase, at mga daluyan sa loob ng ilang linggo

Gumamit ang mga pangmatagalang eksperimento ng mababang dosis araw-araw sa loob ng ilang linggo, hindi ng iisang bolus na pang-emerhensiya. Sa unang pag-aaral, tumanggap ng 4 mg/kg araw-araw sa loob ng isang buwan ang mga dagang may permanenteng pagbara sa carotid artery. Ibinigay ito pagkatapos ng bawat pang-araw-araw na sesyon ng pagsasanay upang ituon sa pagpapatibay ng memorya sa halip na sa agarang pagganap. Mas mabagal matutuhan ng mga hayop na may pagbara ang mga gawaing nangangailangan ng pagkilala sa pagkakaiba ng mga nakikita, at mas mahina ang kanilang pagganap sa isang mahirap na pagsusulit sa memorya. Samantala, hindi naapektuhan ang kakayahang lumangoy, aktibidad sa paggalaw, at pagkilala sa amoy. Binawasan ng araw-araw na paggamot ang mga kakulangan sa pagkatuto at memorya nang hindi binabago ang pangkalahatang kilos sa paggalaw.

Sinuri sa isang kasunod na pag-aaral ang distribusyon ng cytochrome oxidase, na siyang mitochondrial complex IV, sa 44 na rehiyon ng utak pagkatapos ng parehong isang buwang iskedyul ng paggamot. Pinababa ng pagbara ang aktibidad ng enzyme sa visual, prefrontal, at perirhinal cortex pati sa hippocampus at amygdala, at pinahina ang magkakaugnay na aktibidad sa pagitan ng visual cortex at hippocampus. Napanatili ng paggamot ang aktibidad ng enzyme sa mga rehiyon at pinalakas ang mga metabolikong ugnayang iyon sa pagitan ng mga rehiyon, at ang napanatiling aktibidad ay naugnay sa mas magandang pagganap sa gawain. Inilalarawan ng mga ugnayang ito ang magkakaugnay na aktibidad ng mga metabolikong enzyme, hindi ang direktang pagsukat ng ugnayang panggana sa utak ng tao—isang puntong tinutulungang linawin ng mga pagsusuri tungkol sa metabolismo ng enerhiya sa utak.

Isang hiwalay na pag-aaral na tumagal ng isang linggo ang gumamit ng 2 mg/kg araw-araw at nagdagdag ng pampigil sa isang landas ng pagsesenyas upang subukin ang mekanismo. Sa paggamot, tumaas ang daloy ng dugo sa utak mula sa humigit-kumulang 60 hanggang mga 100 mL bawat 100 g kada minuto, at tumaas ang densidad ng mga daluyan sa hippocampus mula sa humigit-kumulang 15.1 hanggang 23 percent. Bahagyang nabawi ang parehong pagtaas nang harangin ang landas ng PI3K/Akt na sumusuporta sa kaligtasan ng selula, at tumaas ang phosphorylated Akt sa paggamot. Ang mga natuklasan tungkol sa daloy ng dugo, densidad ng mga daluyan, harang, at mga neuron ay tumutukoy sa proteksiyon ng mga ugat at daluyan ng dugo na kaugnay ng pagsesenyas ng PI3K/Akt, sa halip na sa purong metabolikong epekto.

Bakit hindi katumbas ng pang-emerhensiyang pangangalaga sa stroke ang alinman dito

Ang kontroladong kalagayan sa laboratoryo ang dahilan kung bakit hindi direktang mailalapat ang mga resultang ito. Ang mga selulang pinalaki sa kultura ay walang namuong dugo o pharmacokinetics. Ang modelong 2VO ay matagal na mababang daloy sa kabuuan, hindi isang biglaang embolus sa isang tiyak na bahagi na may penumbra na ilang minuto pa lamang. Maging ang MCAO sa daga ay gumagamit ng mga batang malulusog na hayop, pampamanhid, magkakatulad na pagbara, at pagbibigay ng dosis sa eksaktong oras. Iba ito sa matatandang pasyenteng may sari-saring namuong dugo, atherosclerosis, hypertension, diabetes, at hindi matukoy na oras ng pagsisimula.

Walang nailathalang randomized na pagsubok sa tao ang nakapagpatunay sa methylene blue bilang pang-emerhensiyang paggamot para sa biglaang ischemic stroke. Isang pag-aaral ng imaging sa tao na paminsan-minsang binabanggit ang nagsama ng 26 na malulusog na nasa hustong gulang, hindi mga pasyenteng may stroke. Binago ng iisang dosis na iniinom ang mga signal ng utak na kaugnay ng gawain, na may bahagyang pagbuti sa pag-alala. Ipinapakita nito ang aktibidad sa sentral na sistemang nerbiyos, hindi ang bisa para sa stroke. Sa halip, nakatuon ang kasalukuyang gabay para sa emerhensiya sa mabilis na reperfusion gamit ang thrombolysis sa ugat sa mga pasyenteng karapat-dapat dito at thrombectomy para sa naaangkop na pagbara sa malalaking daluyan. Nananatiling tanging napatunayang paraan ang mga karaniwang proseso ng pang-emerhensiyang pangangalaga sa stroke. Hindi dapat kailanman ipagpaliban ang pangangalaga sa pinaghihinalaang stroke upang magbigay ng methylene blue. Ipinapaliwanag ng mga praktikal na limitasyon sa paglalapat ng mga dosis mula sa preclinical na pag-aaral kung bakit hindi maituturing na mga klinikal na iskedyul ng paggamot ang mga iskedyul para sa daga.

Pinatitibay ng konteksto ng kaligtasan ang hangganang ito. Ang methylene blue na ibinibigay sa ugat ay may babalang nakakahon tungkol sa malubha o nakamamatay na serotonin syndrome kapag isinabay sa mga serotonergic na gamot, kabilang ang SSRIs, SNRIs, at MAO inhibitors, na iniinom ng maraming pasyenteng nasa edad kung kailan karaniwan ang stroke. Kontraindikado ito sa kakulangan ng G6PD dahil sa panganib ng hemolysis. Pinipigil din nito ang pagsesenyas ng nitric oxide, na nagpapataas ng resistensiya ng mga daluyan at presyon sa ilang kalagayan, kaya hindi ito dapat basta ilarawan bilang gamot na nagpapataas ng daloy ng dugo sa utak. Ang aprubadong iskedyul na 1 mg/kg sa ugat para sa acquired methemoglobinemia ay hindi iskedyul para sa stroke.

Limitado ngunit may tunay na batayan ang tapat na buod. Sa panahon ng reperfusion sa pansamantalang ischemia sa isang tiyak na bahagi, binawasan ng mababang dosis ng methylene blue ang pag-usad ng lesyon sa mga daga. Sa permanenteng pagbara, naantala nito ang infarction ngunit hindi ito napigilan. Sa mga astrocyte, nakapinsala ito habang may matinding pagkakait at nakatulong sa muling pagbibigay ng oxygen. Sa pangmatagalang hypoperfusion, napanatili nito ang cytochrome oxidase, mga daluyan, at memorya sa loob ng ilang linggo. Isang tagapagdala, tatlong konteksto, tatlong sagot.