Methylene blue at Bartonella: mga natuklasan sa laboratoryo at mga limitasyon ng klinikal na ebidensiya

Parehong ginagamit ang salitang impeksiyon sa isang culture dish at sa isang pasyente, ngunit magkaiba ang konseptong tinutukoy nito. Sa dish, ang impeksiyon ay bilang ng mga kolonya sa agar. Sa pasyente, ito ay bakterya sa loob ng mga selula at daluyan ng dugo, mga gamot na dumadaloy sa dugo at tisyu, at isang sistemang panlaban sa sakit na gumagawa ng bahagi ng trabaho. Kapag pinagkamalan mong magkatumbas ang dalawa, magsisimulang magmukhang paggamot ang isang kapansin-pansing bilang mula sa laboratoryo. Kapag malinaw mong pinaghiwalay ang mga ito, ang parehong bilang ay mananatiling kung ano talaga ito: isang dahilan upang isagawa ang susunod na eksperimento.

Ang paghihiwalay na iyon ang pangunahing layunin ng pagsusuring ito tungkol sa methylene blue at Bartonella. Sinubukan ng dalawang pag-aaral sa laboratoryo mula sa iisang pangkat ng mga mananaliksik ang methylene blue laban sa Bartonella henselae sa mga kalagayang hindi ito lumalaki. Pareho silang nag-ulat ng malakas na aktibidad sa mga lalagyang salamin at plastik. Wala sa dalawa ang sumubok nito sa isang tao.

Bakit sinusubukan ng mga mananaliksik ang stationary phase

Gumagamit ang karamihan ng pagsusuri sa mga antibiyotiko ng mga selulang lumalaki. Hindi nasasaklaw ng modelong iyon ang isang mas mahirap na kaso: mga selulang tumigil na sa paghahati at nakatatagal sa mga gamot na pumapatay sa mga kapwa nilang selulang lumalaki.

Maaaring manatili ang Bartonella sa katawan, kabilang ang loob ng mga erythrocyte at endothelial cell. Kaya tinanong ng pangkat kung aling mga aprubadong gamot ang makapapatay sa B. henselae matapos itong pumasok sa stationary phase. Hindi nahulaan ng mababang MIC laban sa mga selulang lumalaki ang pagpatay sa mga nasa stationary phase. Napakababa ng MIC ng rifampin ngunit mahina itong pumatay sa mga selulang nasa stationary phase, samantalang mahusay silang napatay ng mga compound na may mas mataas na MIC. Makikita sa gabay sa pagbasa ng pananaliksik tungkol sa methylene blue ang isang pangkalahatang paraan para sa mga mambabasang gustong suriin ang ganitong uri ng papel.

Unang pagsasala: Li at mga kasamahan, 2019

Gumamit ang 2019 na pagsasala sa stationary phase sa Antibiotics ng iisang strain, B. henselae JK53, na pinalaki sa Schneider medium na may 10 percent fetal bovine serum sa 37 C na may 5 percent CO2. Ang mga kulturang isang araw ang edad ay karamihang binubuo ng magkakahiwalay na selulang naghahati. Itinuring na nasa stationary phase ang mga kulturang limang araw ang edad, na may humigit-kumulang 10 na itinaas sa ika-8 na power na colony forming units per mL, at mayroon itong nakikitang mga kumpol.

Gumamit ang assay ng SYBR Green I kasama ng propidium iodide, na kinalibra gamit ang mga pinaghalong buhay na selula at mga selulang pinatay ng isopropanol. Dahil matindi ang kulay ng methylene blue, kinumpirma sa pamamagitan ng mikroskopiya ang mga natukoy na aktibong sangkap, at pagkatapos ay sa pamamagitan ng pagbibilang ng mga kolonya sa blood agar, ang mas mahigpit na panukat ng resulta.

Mula sa 1,581 aprubadong gamot sa 50 micromolar, nag-iwan ang methylene blue ng 16 percent na nabubuhay na selula ayon sa plate reader at 25 percent ayon sa mikroskopiya. Nagtala ang daptomycin ng 21 percent, ilang azole ng 22 hanggang 27 percent, gentamicin ng 32 percent, erythromycin ng 66 percent, at ciprofloxacin ng 74 percent. Mukhang mas malakas ang pyrvinium pamoate ayon sa reader ngunit hindi ito masuri sa mikroskopiya dahil sa sarili nitong fluorescence.

Laban sa lumalaking B. henselae, ang MIC ng methylene blue ay 0.08 hanggang 0.16 micrograms per mL. Laban sa mga selulang limang araw nang nasa kultura at nasa stationary phase, sa 5 micrograms per mL, bumaba ang bilang ng kolonya hanggang sa wala nang matukoy na kolonya matapos ang isang araw ng pagkakalantad, katulad ng daptomycin at pyrvinium pamoate sa mga konsentrasyong sinubukan para sa mga ito. Gumamit ang isang hiwalay na pagsubok ng pagpatay sa paglipas ng panahon ng 10 micrograms per mL. Mga antas iyon ng pagkakalantad sa laboratoryo, hindi mga dosis, at ganoon ang pagkakalahad ng papel sa mga ito. Ang binanggit na pinakamataas na antas sa plasma ng tao na malapit sa 3.9 micrograms per mL ay lumilitaw sa papel bilang konteksto lamang. Ipinapaliwanag ng pangkalahatang pagtalakay sa pharmacokinetics ng methylene blue kung bakit hindi maaaring ituring na antas sa tisyu ang isang bilang mula sa plasma.

Hayagang nakasaad sa papel ang dalawang limitasyon. Walang modelo ng biofilm at walang pagsusuri ng mga kombinasyong may methylene blue. Ang mga kumpol sa mga kulturang limang araw ang edad ay mga pangkat ng selula sa likidong kulturang nasa stationary phase, hindi isang napatunayang eksperimento sa biofilm. Nanawagan ang mga may-akda ng mga pag-aaral sa hayop, mga kombinasyon, biofilm, at iba pang species ng Bartonella.

Mga kombinasyon at mga selulang mula sa biofilm: Zheng at mga kasamahan, 2020

Pinanatili ng 2020 na kasunod na pag-aaral sa BMC Microbiology ang parehong strain at medium ngunit gumamit ng mga kulturang anim na araw ang edad na nasa stationary phase at nagdagdag ng dalawang bagay na wala sa unang papel: mga kombinasyon ng dalawang gamot at isang modelo ng mga selulang mula sa biofilm.

Para sa mga gamot na sinubukan nang paisa-isa sa pare-parehong 5 micrograms per mL sa loob ng 24 hours, nag-iwan ang methylene blue ng 3.2 na minultiplika sa 10 na itinaas sa ika-4 na power na colony forming units per mL, kumpara sa kontrol na malapit sa 2.8 na minultiplika sa 10 na itinaas sa ika-10 na power. Mas kaunting kolonya ang iniwan ng ciprofloxacin, gentamicin, at nitrofurantoin sa parehong oras ng pagsusuri. Naiiba iyon sa resulta noong 2019, kung saan walang matukoy na kolonya matapos ang isang araw sa parehong nominal na antas. Magkaiba ang edad, densidad, at paghawak sa kultura, kaya nauulit ang epekto ng pagpatay ngunit hindi magkapareho ang laki nito. Ang pagbabagong ito sa bawat pagsubok ay isang dahilan kung bakit itinuturing ng mga karaniwang pagsusuri sa kaligtasan at interaksiyon na hiwalay ang lakas sa laboratoryo sa klinikal na epekto.

Ang pagsasala ng mga kombinasyon ang pinakamadalas sipiing bahagi. Nakatakda ang bawat sangkap sa 5 micrograms per mL. Parehong walang matukoy na kolonya sa stationary phase sa 24 hours ang azithromycin kasama ng methylene blue at rifampin kasama ng methylene blue, gayundin ang dalawang pares na may ciprofloxacin. Ang apat na iyon lamang ang nagkaroon ng ganitong resulta sa 25 pares na sinubukan. Walang pormal na pagsusuri ng synergy na isinagawa, kaya ang tamang termino ay aktibong kombinasyon sa ilalim ng mga kondisyong ito, hindi napatunayang synergy.

Sinubukan sa eksperimento sa biofilm ang mga selulang kinuha mula sa isang bata at ginambalang biofilm, hindi ang pagtagos sa isang buo at hinog nang biofilm. Pinalaki ang mga kultura sa loob ng limang araw, nilabnaw at inilagay sa mga well plate para sa limang araw pa, kinumpirma sa pamamagitan ng crystal violet staining, at pagkatapos ay kinayod bago ilantad sa gamot. Sa 5 micrograms per mL, ibinaba ng methylene blue lamang ang bilang sa 2.3 na minultiplika sa 10 na itinaas sa ika-2 na power pagsapit ng araw 6, kabilang sa pinakamahusay na mga gamot na ginamit nang mag-isa, ngunit hindi naging zero. Umabot sa zero ang parehong kombinasyong may methylene blue pagsapit ng araw 6, gayundin ang parehong kombinasyong may ciprofloxacin.

Tinukoy ng mga may-akda ang parehong mga limitasyong mapapansin ng isang maingat na mambabasa: batang kinayod na biofilm sa halip na matanda at buong biofilm, iisang konsentrasyong madaling gamitin para sa lahat ng gamot sa halip na ang makatotohanang pinakamataas na antas ng bawat gamot, mga piling pares lamang na nakasentro sa azithromycin o rifampin, iisang strain, walang hayop, at walang pasyente. Iminungkahi ang susunod na pag-aaral ng tatlong gamot, ngunit hindi ito iniulat.

Paghahambing ng disenyo ng mga pag-aaral

Ang talahanayan ang pinaikling buod ng punto ng artikulong ito. Lahat ng nasa kaliwa ng huling kolum ay pag-aaral sa kultura. Walang bahagi ng alinmang papel ang pumapaloob sa huling kolum.

Ang Bartonella ay hindi Borrelia

Binabanggit ng parehong papel ang Borrelia burgdorferi, ang spirochete na sanhi ng Lyme disease, dahil nagmula ang assay na gumagamit ng pangkulay sa naunang pag-aaral ng Borrelia sa stationary phase sa parehong laboratoryo, kung saan natukoy ding aktibo ang methylene blue at daptomycin. Kapaki-pakinabang na konteksto ang kasaysayang iyon at karaniwang pinagmumulan din ng pagkakamali.

Walang eksperimento sa alinman sa mga papel tungkol sa Bartonella na sumusubok sa Borrelia kasabay ng Bartonella para sa tuwirang paghahambing. Magkaiba ang mga organismo, medium, at konsentrasyon, at ang ipinapalagay na epekto ng methylene blue sa lamad ng Bartonella ay inilahad bilang haka-hakang nangangailangan pa ng pag-aaral. Hindi dapat ilapat ang mga resulta sa ibang species, at walang papel sa dalawa ang sumusuporta sa malawak na mga pahayag tungkol sa mga parasito. Dahil dito, pinananatiling hiwalay ng paghahambing ng mga persister ng Borrelia at Bartonella ang dalawang hanay ng literatura.

Bakit hindi nagiging protokol ang mga resulta sa kultura

Nauunawaan ang interes sa paghahanap ng isang protokol ng methylene blue para sa bartonella. Ang mga papel na ito ang dahilan kung bakit dapat ituring ang pariralang iyon bilang babala sa halip na listahan ng mga bibilhin.

Una, ang 5 micrograms per mL sa isang well ay hindi reseta. Wala itong kaakibat na impormasyon tungkol sa pagsipsip, pamamahagi sa katawan, pagbigkis sa protina, pagtagos sa loob ng selula, o kakayahang tiisin ito. Pinili ito ng mga may-akda bilang magaspang na average ng pinakamataas na antas ng mga antibiyotiko at sinabi nilang dapat gamitin sa susunod na mga pag-aaral ang makatotohanang antas ng bawat gamot.

Ikalawa, ang zero na kolonya ay nangangahulugang walang kolonya sa ilalim ng mga kondisyong iyon ng paglalagay sa agar, hindi tisyung walang mikrobyo. Hindi nasasaklaw ng agar plate ang mga persister, bakterya sa loob ng selula, at mga limitasyon ng pagkuha ng sample.

Ikatlo, ang mga kombinasyong nag-aalis ng lahat ng matukoy na bakterya sa isang well ay maaaring hindi gumana o makapinsala sa katawan. Ang azithromycin kasama ng methylene blue at rifampin kasama ng methylene blue ay mga pares sa laboratoryo sa mga antas ng pagkakalantad sa laboratoryo. Kung walang pharmacokinetics sa hayop at kontroladong datos sa tao, walang maitatakdang dosis, tagal, o proporsiyon ng benepisyo sa panganib. Dapat talakayin ng sinumang nagtitimbang ng mga opsiyon ang mga ito sa isang clinician at suriin kung kailan nangangailangan ng medikal na pangangasiwa ang paggamit ng methylene blue bago bumuo ng anumang konklusyon mula sa datos sa dish.

Ito ang makitid na konklusyong sinusuportahan ng mga papel na ito: may nauulit na aktibidad ang methylene blue laban sa hindi lumalaking B. henselae JK53 in vitro, kabilang ang mga kombinasyon ng dalawang gamot sa laboratoryo, at nagmula sa pag-aaral noong 2020 ang pinakamalalakas na resulta sa mga kombinasyon at mga selulang mula sa biofilm. Hindi pa nasusubukan ang lahat ng iba pa, kabilang ang kung may kabuluhan ang aktibidad na iyon para sa bartonellosis sa tao.