Artikulo
Methylene Blue at Bitamina C: Bakit Maaaring Maging Walang Kulay ang Solusyon
Naglagay ka ng isang tableta ng bitamina C sa isang baso ng asul na solusyon ng methylene blue, hinalo ito, at pinanood ang pagkupas ng asul. Pagkalipas ng isang minuto, mukhang karaniwang tubig na ang likido. Madaling isipin na sinira o nineutralisa ng bitamina C ang pangkulay.
Mali ang ganitong pagkaunawa, at mahalaga ang pagkakamaling ito. Ang nakikita mo ay isang nababaligtad na pagbabago sa estado ng oksidasyon, hindi pagkasira. Naroon pa rin ang pangkulay. Sa tamang mga kondisyon, bumabalik ito.
Ang dalawang estado ng pangkulay
May dalawang mahusay nang nailarawang estado ang methylene blue. Ang anyong na-oxidize, na karaniwang isinusulat bilang MB+, ay may malawak na sistema ng magkakaugnay na singsing na may conjugation at malakas na sumisipsip ng liwanag malapit sa 664 nm. Ang pagsipsip na iyon ang pinagmumulan ng asul na kulay. Ang anyong sumailalim sa reduksiyon, ang leucomethylene blue (LMB), ay wala na ng malakas na bandang iyon sa nakikitang bahagi ng spectrum, kaya mukhang walang kulay ang isang malabnaw na solusyon.
Isipin ang pangkulay bilang isang maliit na imbakan ng elektron na maaaring muling kargahan. Kapag kinargahan ito ng mga elektron at isang proton, nawawala ang kulay nito. Kapag inalis ang mga elektron na iyon, bumabalik ang kulay:
MB+ + H+ + 2e- to LMB (colorless)
Bitamina C ang nagbibigay ng karga. Sumasailalim sa oksidasyon ang ascorbate tungo sa dehydroascorbate at nagbibigay ng dalawang katumbas na pampababa ng estado ng oksidasyon. Kaya sa isang pinasimpleng pagtutuos, ang isang mole ng ascorbate ay nagpapababa sa estado ng oksidasyon ng humigit-kumulang isang mole ng MB+. Sa mga aktuwal na solusyon sa laboratoryo, mas masalimuot ang pagtutuos dahil nakikipag-agawan ang natunaw na oksiheno para sa parehong mga elektron. Ito ang dahilan kung bakit karaniwang kailangan ang labis na ascorbate upang mapanatiling walang kulay ang solusyon.
Hindi kailangang mangyari ang mekanismo sa isang tuwirang hakbang na may dalawang elektron. Nakikilahok ang mga radikal at mga intermediate na bahagyang sumailalim sa reduksiyon, at nagbabago ang eksaktong landas depende sa pantunaw, kaasiman, at konsentrasyon. Gayunman, pareho ang huling resulta. Nagiging walang kulay na LMB ang asul na MB+, at nauubos ang bitamina C sa proseso.
Bakit ibinabalik ng pag-alog ang asul
May ikalawang yugto ang klasikong bersiyon ng eksperimentong ito sa silid-aralan. Hayaang nakatigil ang vial na walang kulay at mananatili itong walang kulay. Alugin ito, at babalik ang asul. Maghintay, at kukupas itong muli.
Oksiheno ang nagpapanumbalik ng kulay. Ino-oxidize ng natunaw na O2 ang LMB pabalik tungo sa MB+, kaya hindi inaaktiba ng pag-alog ang pangkulay. Dinadagdagan nito ang natunaw na oksiheno sa pamamagitan ng paghahalo ng hangin sa espasyo sa ibabaw ng likido papasok sa likido, na nagpapabilis sa pabalik na reaksiyon. Hangga't may natitirang ascorbate, muling sumasailalim sa reduksiyon ang nabuong MB+, kaya lumilitaw ang pamilyar na siklo: kapag nakatigil, walang kulay; kapag inalog, asul; kapag naghintay, walang kulay muli. Kapag naubos na ang ascorbate, tuluyang nangingibabaw ang oksiheno at nananatiling asul ang solusyon.
Ito ang dahilan kung bakit sensitibo sa hugis at sukat ng lalagyan ang demonstrasyon ng methylene blue at bitamina C. Mas matagal na nananatiling walang kulay ang isang cuvette na may takip at maliit na espasyo ng hangin sa ibabaw kaysa sa isang malapad na beaker. Pinaiikli ng masiglang pagpapasok ng hangin ang yugtong walang kulay. Kaya dapat ilahad ng sinumang nag-uulat ng eksperimento ang mga kondisyon ng oksiheno, hindi lamang ang dami ng mga reagent.
Isang kontroladong demonstrasyon at ang mga kondisyon nito
Ipinapakita ng larawan sa pabalat ng artikulong ito ang nilalayong paghahambing: isang asul na MB+ na kontrol katabi ng isang sampol ng LMB na sumailalim sa reduksiyon gamit ang ascorbate, sa ilalim ng magkaparehong pag-iilaw. Upang maulit ang resulta, panatilihing pare-pareho ang bawat salik na nagpapabago sa bilis:
| Salik | Iminungkahing kondisyon | Bakit ito mahalaga |
|---|---|---|
| Methylene blue | 10 hanggang 90 micromolar sa phosphate buffer, pH 7 | Tumutugma sa mga konsentrasyong ginamit sa mga nailathalang pag-aaral sa redox at pinananatili ang absorbansiya sa loob ng saklaw ng pagsukat |
| Ascorbate | 1 mM sodium ascorbate, bagong inihanda | Nagbibigay ng labis na mga katumbas na pampababa ng estado ng oksidasyon upang makumpleto ang pagkawala ng kulay |
| Buffer at pH | 50 mM phosphate, pH 7.0, temperatura ng silid | Nagtatakda sa mga kemikal na anyo ng ascorbate at sa katatagan ng LMB |
| Liwanag | Mahinang liwanag sa paligid, itala ang tagal ng pagkakalantad | Nagdaragdag ang maliwanag na ilaw ng mga landas ng photoredox at peroxide |
| Oksiheno | Isang vial na puspos ng hangin, isang vial na inalisan ng hangin gamit ang nitrogen | Naghihiwalay sa malinis na siklong redox mula sa muling oksidasyon |
| Mga metal | Mga reagent na analytical grade, kasama ang isang kontrol na may chelator | Nagbibigay-daan ang bakas na bakal sa kimikang Fenton (tingnan sa ibaba) |
Kunan ng larawan ang parehong vial sa mga takdang oras, halimbawa sa 0, 1, 5, at 15 minuto, pagkatapos ay alugin at kunan muli ng larawan. Dapat manatiling walang kulay nang pinakamatagal ang vial na inalisan ng hangin gamit ang nitrogen. Dapat mas mabilis na bumalik sa asul ang vial na pinasukan ng hangin pagkatapos alugin. Kung hindi na kailanman bumabalik sa asul ang isang sampol kahit alugin at pasukan ng hangin, maghinala ng hindi na mababaligtad na pagkasira sa halip na simpleng reduksiyon.
Ginagamit ng mga tagabuo ng pormulasyon ang parehong lohika sa mas malaking antas. Nakadepende ang asal ng methylene blue sa isang halo sa kabuuang konteksto ng redox at pormulasyon. Dapat itala sa pagsusuri ng katatagan ang pH, natunaw na oksiheno, dami ng pagkakalantad sa liwanag, at mga bakas na metal kasabay ng obserbasyon sa kulay.
Magkakaiba ang direksiyon ng mga epekto ng pH, liwanag, at konsentrasyon
Madalas itanong ng mga baguhan kung asido o base ang nagpapabilis sa reaksiyon. Ang tapat na sagot ay kumikilos ang pH sa dalawang magkaibang bahagi ng siklo. Sa maasidong mga kondisyon sa tubig, maaaring mapabilis ng pagkakaroon ng mga proton ang hakbang ng reduksiyon ng MB+ gamit ang ascorbate. Ngunit ang LMB mismo ay mas matibay laban sa oksidasyon ng hangin sa maasidong kondisyon at mas mabilis na muling sumasailalim sa oksidasyon habang tumataas ang pH. Kaya maaaring mabilis na mawalan ng kulay ang isang maasidong sampol at manatiling walang kulay, samantalang ang isang alkalinong sampol ay mabilis na nawawalan ng kulay at bumabalik sa asul. Parehong tama ang mga obserbasyong ito sa kani-kanilang mga kondisyon.
Nagdaragdag ng hiwalay na landas ang liwanag. Ang methylene blue na napukaw ng liwanag ay umaabot sa isang matagal na nananatiling triplet state na sumasailalim sa paglilipat ng elektron kasama ng ascorbate at oksiheno. Maaaring pabilisin ng photochemistry na iyon ang pagkawala ng kulay, ibalik ang kulay, o gumawa ng mga reaktibong anyo ng oksiheno depende sa haba ng alon, antas ng oksiheno, at konsentrasyon. Ituring ang pag-iilaw bilang isang salik sa eksperimento at itala ito.
Itinatakda ng konsentrasyon kung aling direksiyon ang nangingibabaw. Ang mas maraming ascorbate ay nangangahulugan ng mas mabilis na pagkawala ng kulay at mas maraming siklo ng pag-alog at pagkupas. Nangangailangan ang mas maraming pangkulay ng proporsiyonal na mas maraming katumbas na pampababa ng estado ng oksidasyon. Pinapaboran ng mas maraming natunaw na oksiheno ang asul. Sa mataas na konsentrasyon ng pangkulay, lumilitaw ang isa pang komplikasyon dahil nagsasama-sama ang mga molekula ng methylene blue upang bumuo ng mga dimer at kumpol na may nabagong spectra. Kaya ang pagdodoble ng pangkulay ay hindi na nagdodoble sa parehong asal.
Nineutralisa ba ng bitamina C ang methylene blue?
Ito ang tanong sa likod ng karamihan sa mga paghahanap tungkol sa methylene blue at bitamina C, at kailangan nito ng tiyak na sagot. Hindi, ang pagkawala ng kulay ay hindi neutralisasyon. Nagbago ng estado ang chromophore, ngunit nananatili sa solusyon ang ubod na phenothiazine at ang aktibidad nitong redox. Maaaring baligtarin ng hangin ang reaksiyon, at reaktibo rin ang anyong sumailalim sa reduksiyon: walang karga ang LMB at mas lipophilic kaysa sa MB+. Sa mga pag-aaral sa selula, tumatawid ito sa mga lamad bago muling sumailalim sa oksidasyon sa loob.
Nililinaw ito ng mga pag-aaral sa selula. Sa mga kinulturang endothelial cell, pinasisigla ng methylene blue sa mababang micromolar na konsentrasyon ang aktibidad ng pentose phosphate habang ino-oxidize ang NADPH at NADH. Kapag higit sa humigit-kumulang 5 micromolar, pinapataas nito ang mga panandang oxidant sa loob ng selula kapag walang suporta mula sa glucose. Unti-unting ino-oxidize ng mga selulang nilagyan ng ascorbate ang ascorbate na iyon kapag nalantad sa pangkulay, at bahagya lamang na nasusugpo ng inilagay na ascorbate ang senyal ng oxidant, gaya ng iniulat sa isang pag-aaral sa redox ng pangkulay sa mga endothelial cell. Sa madaling salita, nakikilahok ang ascorbate sa mga prosesong redox. Hindi nito pinapatay ang aktibidad ng pangkulay.
Lalong nililinaw ng liwanag ang usapin. Kapag naiilawan, ang mga halo ng methylene blue, ascorbate, at oksiheno ay kumokonsumo ng oksiheno, nag-iipon ng hydrogen peroxide, at, kung may bakal na gumaganap bilang katalista, gumagawa ng hydroxyl radical sa pamamagitan ng kimikang Fenton, gaya ng ipinakita sa mga eksperimento sa paghuli ng spin at pagsukat ng pagkonsumo ng oksiheno. Maaaring magdulot ang mga hydroxyl radical ng hindi na mababaligtad na pinsala sa mga biomolekula at masira ang mismong pangkulay. Kaya ang isang sampol na permanenteng nawalan ng kulay sa ilalim ng liwanag at kontaminasyon ng bakal ay hindi nagpapakita ng malinis na reduksiyon. Maaaring nagpapakita ito ng pagkasira dulot ng mga kasabay na reaksiyong kemikal.
Ano ang hindi pinatutunayan ng solusyong walang kulay
May tatlong karaniwang konklusyong lumalampas sa ebidensiya at dapat iwasan sa mga tala sa laboratoryo, label, at slide sa pagtuturo.
Una, ang kawalan ng kulay ay hindi nangangahulugang walang panganib. Ang LMB kasama ng oksiheno at mga bakas na metal ay maaaring magpatuloy ng mga landas ng peroxide at radikal, lalo na sa ilalim ng liwanag. Nangangailangan ng toksikolohiya ang pagpapatunay na walang panganib, hindi ng pagsukat ng kulay.
Ikalawa, ang kawalan ng kulay ay hindi nangangahulugang naalis na ang kontaminasyon. Naroon pa rin ang pangkulay at ang mga kasama nito sa redox. Hindi nalulunasan ang mga natapon na kemikal, likidong itinatapon, at mga materyal na namantsahan sa pamamagitan ng pagdaragdag ng ascorbate. Kailangan ang kumpirmasyon sa pamamagitan ng pagsusuring analitikal, isang paksang saklaw ng mga pamamaraan sa pagsusuri ng residuo at pagtanggal ng kontaminasyon.
Ikatlo, hindi itinatakda ng kawalan ng kulay ang isang kapaki-pakinabang na pinagsamang paraan ng paggamit. Walang sinasabi ang reaksiyon sa test tube tungkol sa pagsipsip, pamamahagi sa mga tisyu, dosis, o kaligtasan ng interaksiyon sa mga tao. Ang sinumang natutuksong pagsamahin ang dalawang sangkap para sa layuning pangkalusugan ay dapat munang basahin ang mga pag-aaral tungkol sa interaksiyon at kaligtasan at kumonsulta sa mga kwalipikadong sanggunian sa halip na humango ng mga konklusyon mula sa isang vial.
Mas limitado ngunit mas kapaki-pakinabang ang tamang interpretasyon. Ang methylene blue kasama ng ascorbate ay isang payak na modelo ng siklong redox: nagbibigay ng mga elektron ang bitamina C, nawawalan ng kulay ang pangkulay, kinukuha pabalik ng oksiheno ang mga elektron, bumabalik ang kulay, at itinatakda ng liwanag, pH, konsentrasyon, at bakal ang bilis at mga kasabay na produkto. Kapag malinaw na ang konseptong iyon, hindi na basta palabas ang demonstrasyon kundi isang paraan ng pagtukoy ng problema. Kung iba ang asal ng iyong sampol, suriin ang pagpasok ng oksiheno, dami ng pagkakalantad sa liwanag, pH, at kontaminasyon ng metal bago pagdudahan ang pangkulay.