Метилени кабуд ва аутофагия: AMPK, mTOR ва таҷрибаҳо бо нейронҳо

Тасаввур кунед, ки таҷрибаеро бо ҳуҷайраҳо мегузаронед, метилени кабуд илова мекунед ва мебинед, ки тасмаи сафедае бо номи LC3-II дар блоти шумо тира мешавад. Шояд хоҳед эълон кунед, ки ин пайвастагӣ «аутофагияро тақвият медиҳад» ва ба кори дигар гузаред. Чунин тафсир бармаҳал аст. Тиратар шудани тасмаи LC3-II метавонад маънои онро дошта бошад, ки ҳуҷайра везикулаҳои бештар барои тозакунӣ месозад, ё ин ки везикулаҳо ҷамъ мешаванд, зеро марҳилаи бартарафсозӣ баста шудааст. Ин ду тафсир ба самтҳои муқобил ишора мекунанд ва адабиёти илмӣ оид ба метилени кабуд дар нейронҳо намунаҳои ҳар ду навъи далелро дар бар мегирад. Ин мақола қадам ба қадам, санҷиш ба санҷиш, он чизеро баррасӣ мекунад, ки воқеан чен шудааст.

Макроаутофагия, шакле, ки дар ин ҷо омӯхта шудааст, раванди коркарди дубораи гурӯҳии мавод дар ҳуҷайра аст. Халтачаи мембранавие бо номи фагофор дар атрофи сафедаҳо ва органеллаҳои фарсуда калон мешавад, пӯшида шуда аутофагосомаро ташкил медиҳад, бо лизосома якҷоя мешавад ва маводи даруни он таҷзия шуда, барои истифодаи дубора озод мегардад. Нейронҳо ба ин раванди мунтазам такя мекунанд, зеро тақсим намешаванд ва наметавонанд бо тақсимшавӣ ҳиссаи қисмҳои осебдидаро кам кунанд. Вақте коркарди дубора бозмемонад, партовҳо ҷамъ мешаванд. Вақте он кор мекунад, ҳуҷайра дар шароити стресс ҷузъҳои сохтмониро барқарор мекунад.

Як таҷрибаи гиппокамп чӣ нишон дод

Дар таҳқиқоти асосии ангезиш ҳуҷайраҳои гиппокампи муши HT22 истифода шуданд, ки бо маҳрумсозӣ аз зардоби хун барои 24 соат ба стресс дучор гаштанд. Ин шароит омилҳои рушд ва сигналҳои трофикиро аз байн мебарад ва ҳам апоптозу ҳам аутофагияро ба кор меандозад. Муҳаққиқон гузориш доданд, ки метилени кабуд марги ҳуҷайраҳоро вобаста ба воя кам кард ва ин муҳофизат бо нишонаҳои макроаутофагия ҳамроҳ буд.

Силсилаи нишондиҳандаҳо мушаххас буд. Рангшавии парокандаи LC3B тақрибан аз консентратсияи 20 nM метилени кабуд ба нуқтаҳои атрофи ядро бозтақсим шуд ва вокуниши қавитарини LC3-I ва LC3-II дар наздикии 1 μM мушоҳида гардид. Ҳам LC3B-I ва ҳам LC3B-II вобаста ба воя ва вақт зиёд шуданд. Муҳим он аст, ки гурӯҳ аз блоти статикии LC3 як қадам пеш рафт. Онҳо 10 μM хлорохин илова карданд, ки тозакунии лизосомавиро бозмедорад, ва дар ҳуҷайраҳои бо метилени кабуд коркардшуда сатҳи баландтари LC3-II ва устуворшавии p62-ро мушоҳида карданд. Ин намуна ба гардиши вобаста ба лизосома ишора мекунад, на ба ҷамъшавии одӣ. Онҳо инчунин нишон доданд, ки хлорохин таъсири зиддиапоптозиро қисман барҳам дод; ин дар модели мазкур муҳофизатро бо роҳи аутофагия ва лизосома мепайвандад.

Натиҷаи сигналдиҳӣ ҳамон қисмест, ки бештар нодуруст нақл мешавад. Сигналдиҳии AMPK, ки бо AMPK-и фосфоронидашуда ва ҳадафи поёноби он — ACC-и фосфоронидашуда — арзёбӣ шуд, дар 12 ва 24 соат вобаста ба воя афзоиш ёфт. Боздорандаи AMPK бо номи Compound C, ки дар 4 соати охир бо консентратсияи 20 μM истифода шуд, ҳам фосфоронидашавии ACC ва ҳам фаъолшавии LC3-ро кам кард. Баръакс, дар mTOR-и фосфоронидашуда ҳеҷ фурӯнишонии ошкоршаванда дида нашуд. Пас, дар ҳуҷайраҳои гиппокамп, ки ба стресс дучор буданд, натиҷа ангезиши марбут ба AMPK тавассути роҳе буд, ки зоҳиран аз mTOR мустақил аст. Ҳамин намуна дар мушҳои зинда низ мушоҳида шуд: коркард бо метилени кабуд нишондиҳандаҳои макроаутофагияро дар қишри мағзи сар ва гиппокамп ангехт.

Ангезиш ҷараёни пурра анҷомёфта нест

Дар ин ҷо фарқи мафҳумҳо аҳамияти махсус дорад. Ангезиш маънои онро дорад, ки дастгоҳи болооби раванд аутофагосомаҳои бештар месозад. Ҷараён маънои онро дорад, ки маводи интиқолшаванда тамоми роҳро тай мекунад: ҷудо кардан, пухтарасӣ, якҷояшавӣ бо лизосома, таҷзия ва коркарди дубора. Ҳар афзоиши LC3-II танҳо далели ангезиш аст, то вақте ки санҷиши ҷараён қисми боқимондаи роҳро тасдиқ кунад.

Санҷиши стандартии ҷараён LC3-II-ро бо бастани кӯтоҳмуддати фаъолияти лизосома, масалан бо бафиломицин A1 ё хлорохин, ва бе он чен мекунад. Агар коркард воқеан истеҳсолро тезонад, бастани нобудсозӣ бояд LC3-II-ро боз ҳам бештар зиёд кунад. Репортери тандемии mCherry-GFP-LC3 назари дуюмро илова мекунад: сохторҳо пеш аз якҷояшавӣ бо лизосома зард медурахшанд ва баъд аз он ки муҳити турш сигнали GFP-ро хомӯш мекунад, танҳо сурх мешаванд. Аз ин рӯ, зиёд шудани нуқтаҳои танҳо сурх гузариш ба аутолизосомаҳои туршро дастгирӣ мекунад. Камшавии сафедаи p62 метавонад гардиши маводи интиқолшавандаро тасдиқ кунад, аммо бояд ба назар гирифт, ки худи транскрипсияи p62 низ ба стресс вокуниш мекунад ва онро дар сатҳи mRNA санҷидан лозим аст.

Рӯйхати санҷиши зер ҳар санҷиши дар ин адабиёти илмӣ истифодашударо бо он чизе, ки чен мекунад ва он чизе, ки мустақилона исбот карда наметавонад, муқоиса мекунад. Хонандагон метавонанд онро барои ҳар иддаои оянда оид ба макроаутофагия, аз ҷумла далелҳои марбут ба рӯзадорӣ ва дарозумрӣ, ки ба ин нишондиҳандаҳо такя мекунанд, истифода баранд.

Ба як доми баён диққат диҳед, ки ҷадвал аз он пешгирӣ мекунад. ACC-и фосфоронидашуда шаклест, ки фаъолияти ферментии он боздошта шудааст. Афзоиши он натиҷаи фаъолияти AMPK-ро нишон медиҳад, на фаъолшавии ACC-ро.

Ибораи «боздоштани макроаутофагия муҳофизати нейронҳоро барҳам дод» низ ҳамин дақиқиро талаб мекунад. Дар модели HT22 ин маънои онро дорад, ки халал расондан ба роҳи аутофагия ва лизосома бартарии зиндамонии аз метилени кабуд ҳосилшударо ҳангоми маҳрумсозӣ аз зардоби хун аз байн бурд. Ин дар ҳамон зарфи озмоишӣ зарур будан ё саҳм гузоштани аутофагияро дастгирӣ мекунад. Он исбот намекунад, ки аутофагия ягона механизми муҳофизатии ин пайвастагӣ аст, исбот намекунад, ки хлорохин танҳо тавассути аутофагия амал мекунад, ва барои мустаҳкам кардани иддаои сабабият тағйирдиҳии генетикии ATG5, ATG7 ё ULK1 лозим мебуд.

Ду роҳ ба як дастгоҳ

Харитаи содакардашуда кӯмак мекунад. Стресси энергетикӣ фаъолияти AMPK-ро зиёд мекунад, AMPK маҷмааи ULK1-ро фаъол месозад ва аутофагия оғоз меёбад. Омилҳои рушд ва моддаҳои ғизоӣ фаъолияти mTORC1-ро зиёд мекунанд, mTORC1 фаъолияти ULK1-ро бозмедорад ва аутофагия ғайрифаъол мемонад. Дар поёноби ULK1 маҷмааи Beclin-1 ва VPS34 ташаккули фагофорро оғоз мекунад, LC3-I бо липиддоршавӣ ба LC3-II табдил меёбад, аутофагосома пӯшида шуда, бо лизосома якҷоя мешавад ва маводи интиқолшаванда ҳамроҳ бо гардиши p62 таҷзия мегардад.

Нақша ҳар натиҷаи метилени кабудро дар ин харита ҷойгир мекунад: натиҷаи гиппокамп дар паҳлуи шохаи AMPK ва натиҷаи ҳуҷайраҳои пешгузашта дар паҳлуи шохаи mTOR.

Ин тарзи баррасӣ номувофиқати зоҳириро бо таҳқиқоти дуюми Xie бартараф мекунад. Дар ҳуҷайраҳои пешгузаштаи асабии калламуш, ки дар ҳоли афзоиш буданд, таҷрибаи ҷудогона нишон дод, ки 5 μM метилени кабуд афзоиши ҳуҷайраҳоро боздошт ва ҳолати оромиро тақвият дод: ҳуҷайраҳои Ki67-мусбат дар рӯзҳои 1 ва 3 кам шуданд, дар ҳоле ки тафриқашавӣ ба нейронҳо пас аз муайян шудани сарнавишти ҳуҷайра бетағйир монд. Дар он ҷо механизм тавассути фурӯнишонии сигналдиҳии mTOR амал мекард: миқдори умумии mTOR ва mTOR-и фосфоронидашуда ҳамроҳ бо пастшавии ифодаи p70S6K ва 4EBP1, инчунин коҳиши ифодаи сиклинҳои E1, B1, D1 ва D2 кам шуд. Фенотипи бартаридошта ҳолати оромии ҳуҷайраҳои пешгузашта буд, ки муаллифон онро бо ба таъхир афтодани пиршавии ҳуҷайравӣ пайваст карданд, на бо наҷоти ҳуҷайраҳои гиппокампи ба стресс дучоршуда.

Байни ин ду мақола зиддият вуҷуд надорад. AMPK ва mTOR ҳамгиросозҳои вобаста ба шароитанд, на калидҳои собит. Ҳуҷайраи ба нейрон монанд, ки ба стресс дучор аст, метавонад AMPK-ро бе боздории ченшавандаи mTOR ба кор андозад, дар ҳоле ки ҳуҷайраи пешгузаштаи таҳти таъсири митоген метавонад ба ҳамон пайвастагӣ бо маҳдуд кардани дастгоҳи рушди вобаста ба mTOR вокуниш кунад. Навъи ҳуҷайра, шароити стресс, консентратсия ва нуқтаи вақт муайян мекунанд, ки кадом шоха бартарӣ дорад. Ҳамчунин аз ҳамин сабаб таъсирҳои метилени кабуд ба энергияи митохондрияҳо ва равандҳои оксиду барқароршавӣ ба ҳамин манзара дохил мешаванд: тавре ки шарҳи механизмҳои муҳофизати нейронҳо тавсиф мекунад, ин пайвастагӣ ҳамчун интиқолдиҳандаи алтернативии электрон амал мекунад, сигналдиҳии антиоксидантӣ ва зиддиапоптозиро ба кор меандозад, MAO ва NOS-ро бозмедорад ва тавассути биогенез ва аутофагия бо навшавии митохондрияҳо пайваст мешавад. Аутофагия як шохаи маҷмуи таъсирҳои гуногун аст, на тамоми ҳикоя.

Таҷрибаҳо чиро нишон намедиҳанд

Маҳрумсозӣ аз зардоби хун стресси трофикӣ ва мубодилавиро дар зарфи озмоишӣ модел мекунад. Он рӯзадории тамоми организмро модел намекунад: глюкоза, аминокислотаҳо ва намакҳо дар муҳити асосӣ боқӣ мемонанд ва ҳеҷ рафтори ғизогирӣ вуҷуд надорад. Консентратсияҳои 20 nM то 5 μM дар фарҳанги ҳуҷайравиро бо ҳисоби арифметикӣ ба вояҳои инсонӣ табдил додан мумкин нест, зеро ҷаббиш, пайвастшавӣ ба сафедаҳо, ҳолати оксиду барқароршавӣ, мубодилаи моддаҳо, ҷамъшавӣ дар бофтаҳо ва давомнокии таъсир ҳама фарқ мекунанд.

Ҳеҷ озмоиши инсонӣ барои нишон додани ҷараёни аутофагии аз метилени кабуд ангехташуда дар беморон тарҳрезӣ нашудааст. Далелҳои механизмӣ ҳанӯз ба корҳои ҳуҷайравӣ, ex vivo ва ҳайвонот маҳдуданд ва шарҳҳо далелҳои гузариш ба истифодаи клиникиро ҳамоно пешакӣ тавсиф мекунанд. Аз ин рӯ, ин таҳқиқот нишон намедиҳанд, ки метилени кабуд рӯзадориро тақлид мекунад, тавассути аутофагия умри инсонро дароз мекунад ё ҷараёни аутофагиро дар мағзи сари инсон пурра анҷом медиҳад. Иддаоҳои тақлиди рӯзадорӣ ва дарозумрӣ ба далелҳои клиникии худ ниёз доранд ва озмоишҳои метилени кабуд дар инсон барои нишондодҳои дигар танҳо ба сабаби робитаи мавзӯӣ ба озмоишҳои аутофагия табдил намеёбанд. Таҳқиқот оид ба моделҳои стресси норасоии моддаҳои ғизоӣ ва дарозумрӣ бояд бо дарназардошти ҳамин ҳудуд хонда шаванд.

Барои мақолаи навбатие, ки мехонед, рӯйхати санҷишро пайдарпай истифода баред. Аввал пурсед, ки кадом шоха тағйир ёфт: AMPK, mTOR ё ҳеҷ кадоме. Баъд пурсед, ки оё натиҷаи LC3 бо санҷиши ҷараён ҳамроҳ буд ё танҳо пешниҳод шудааст. Сипас санҷед, ки оё бастани роҳ фоидаро аз байн бурд ва ин бо кадом усул анҷом дода шуд. Таҳқиқоте, ки ба ҳар се савол ҷавоб медиҳад, барои иддаои қавии механизмӣ асос дорад. Таҳқиқоте, ки танҳо ба саволи аввал ҷавоб медиҳад, сигнали иҷозатдиҳандаро нишон додааст ва қисми боқимондаи роҳ ҳанӯз харитабардорӣ нашудааст.