Кабуди метилении нав ва рангкунии ретикулоситҳо: рангкунандаи алоҳида ва усули ҳуҷайраҳои зинда

Донишҷӯ барои ҳисоб кардани ретикулоситҳо омодагӣ мебинад, кабуди метиленӣ фармоиш медиҳад, онро бо хун омехта мекунад ва қариб чизе намебинад. Ҳамсабақаш аз шишае истифода мебарад, ки дар тамғааш «кабуди метилении нав» навишта шудааст, ва дар дохили қисме аз ҳуҷайраҳои сурхи хун риштаҳои кабуди возеҳро мебинад. Донишҷӯи аввал гумон мекунад, ки рангкунандаи шишаи дуюм тозатар ё консентратсияаш баландтар аст. Ҳеҷ кадоми инҳо дуруст нест. Он молекулаи дигар дорад.

Ин иштибоҳи мафҳумӣ сабаби аксари нофаҳмиҳо дар ин соҳа аст. Аз ном чунин бармеояд, ки кабуди метилении нав партияи беҳтаршудаи кабуди метиленӣ бошад. Аммо химия чизи дигарро нишон медиҳад. Кабуди метилении нав N рангкунандаи алоҳидаи фенотиазинӣ буда, рақами хоси Colour Index, тарҳи хоси ҷойгиршавии гурӯҳҳои ивазкунанда ва нақши стандартишудаи худро дар гематология дорад. Пас аз равшан шудани ин фарқ, қисмҳои дигари усул — чаро ҳуҷайраҳо ҳангоми рангкунӣ бояд зинда бошанд, кадом ҳуҷайра ретикулосит ҳисоб мешавад, ҷисмчаҳои Ҳайнтс чӣ ҷойгоҳ доранд ва кабуди крезилии дурахшон кай ба кор меояд — фаҳмо мешаванд.

Ҷавоби кӯтоҳ

Кабуди метилении нав N, реагенти гематологӣ, одатан ҳамчун Basic Blue 24 дар сабти PubChem барои кабуди метилении нав, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, бо формулаи C18H22ClN3S муайян карда мешавад. Кабуди метилении маъмулӣ хлориди метилтиониний, Basic Blue 9, дар сабти PubChem-и он, C.I. 52015, CAS 61-73-4, бо формулаи C16H18ClN3S аст. Аз ҷиҳати сохтор, кабуди метилении нав ду гурӯҳи метилӣ дар ҳалқа ва занҷирҳои паҳлуии этиламино дорад, дар ҳоле ки кабуди метиленӣ гурӯҳҳои диметиламино дорад. Ин фарқ хусусиятҳои рангкуниро тағйир медиҳад. Матнҳои гематологӣ кабуди метилении маъмулиро ҳамчун рангкунандаи нисбатан сусти ретикулоситҳо ва кабуди метилении навро ҳамчун рангкунандаи пуррангтару якхелатар тавсиф мекунанд; ин муқоиса дар мавзуи ScienceDirect оид ба кабуди метилении нав ҷамъбаст шудааст.

Бале, кабуди метилении нав рангкунандаи суправиталӣ аст. Рангкунии суправиталӣ маънои ранг кардани ҳуҷайраҳои зиндаро пас аз аз бадан хориҷ шудан ва пеш аз фиксатсия дорад, чунон ки дар шарҳи NCBI оид ба принсипҳои рангкунии суправиталӣ таъриф шудааст. Ҳам кабуди метилении нав ва ҳам кабуди крезилии дурахшон ба ин гурӯҳ дохил мешаванд ва стандарти CLSI барои ретикулоситҳо кабуди метилении навро ба таври возеҳ ҳамчун рангкунандаи суправиталӣ баррасӣ мекунад. Донишҷӯён баъзан ин усулро бо рангкунии мазокҳои фиксатсияшуда аз рӯйи Романовский ба як гурӯҳ мегузоранд. Ин тасаввур дар ин ҷо дуруст нест. Агар аввал фиксатсия кунед, усул дигар кор намекунад.

Барои хонандагоне, ки номҳои монанди рангкунандаҳоро пайгирӣ мекунанд, мақолаи кабуди метил дар муқоиса бо кабуди метиленӣ нофаҳмии дигару васеътареро байни рангкунандаи анионии триарилметанӣ ва оилаи катионии фенотиазинӣ баррасӣ мекунад. Шарҳи умумии рангкунии лабораторӣ кори суправиталиро дар қатори усулҳои мазокҳои фиксатсияшуда ҷой медиҳад ва дастури морфологияи ҳуҷайраҳои хун нишон медиҳад, ки арзёбии ретикулоситҳо дар таҳлили васеътари таркиби ҳуҷайравии хун чӣ ҷойгоҳ дорад.

Як огоҳӣ ҳангоми кор бо каталогҳо: шакли алоҳидаи намаки дукаратаи кабуди метилении нав бо хлориди руҳ таҳти CAS 6586-05-6 вуҷуд дорад. Аз ин рӯ, дар бахши усулҳо бояд шакли намак ва таъминкунанда нишон дода шаванд, на танҳо номи маъмул.

Рангкунии суправиталӣ воқеан чӣ мекунад

Ретикулосит ҳуҷайраи ҷавони сурхи хун аст, ки ядрояшро аз даст додааст, вале РНК-и боқимондаи рибосомавиро нигоҳ медорад. Дар препарати тари рангнашуда ин РНК дида намешавад. Рангкунандаи суправиталӣ ба ҳуҷайраи зинда ворид шуда, ин РНК-ро таҳшин ё ҷамъ мекунад ва ба доначаву риштаҳои кабуд табдил медиҳад — ҳамон маводи тӯрмонанду риштагие, ки ҳангоми иммерсияи равғанӣ дида мешавад. Пас, ин шабака маҳсули рангкунӣ аст, на сохтори аз пеш ташаккулёфтае, ки танҳо мунтазири ранг бошад. Аз ҳамин сабаб, тағйирёбандаҳои протокол — консентратсияи рангкунанда, буфер, таносуби хун ба рангкунанда, ҳарорат ва вақт — ба андозаи номи рангкунанда аҳамият доранд.

Натиҷаи амалӣ ин аст, ки тартиби амалҳо бояд қатъӣ риоя шавад: аввал хуни бо антикоагулянт коркардшударо бо рангкунанда омехта кунед, инкубатсия кунед, сипас мазокҳо тайёр карда, онҳоро бе фиксатсия ва бе рангкунии муқобил баррасӣ кунед. Фиксатсия пеш аз рангкунӣ ё рангкунии муқобиле, ки риштаҳои камрангро мепӯшонад, маълумотеро аз байн мебарад, ки ҳисоб ба он такя мекунад.

Протоколи амалии ретикулоситҳо бо кабуди метилении нав

Таркиби ягонаи универсалӣ вуҷуд надорад, бинобар ин таркиберо, ки истифода шудааст, нишон диҳед. Се варианти ҳуҷҷатшуда гуногунии онҳоро нишон медиҳанд.

Усули классикии навъи Брехер тақрибан 0.5 фоиз кабуди метилении навро бо оксалати калий истифода мебарад. Он бо ҳаҷми баробари хуни дорои EDTA, ки хуб омехта шудааст, омехта шуда, тақрибан 10 то 15 дақиқа дар ҳарорати хона инкубатсия карда мешавад. Пас аз бозомехтани мулоим, мазокҳои тунуки фонашакл тайёр карда, дар ҳаво хушк мекунанд ва бе фиксатсия зери объективи иммерсионии равғании 100x мебинанд. Дастури NCBI барои ҳисоб кардани ретикулоситҳо ин ҷараёни кор ва чорчӯбаи ҳисобро, ки бо он истифода мешавад, тавсиф мекунад.

Варианти Дейси ва Люис 1.0 фоиз кабуди метилении навро дар маҳлули намакдори ситратӣ истифода мебарад. Он бо 2 то 4 ҳаҷми хун омехта шуда, пеш аз тайёр кардани мазокҳо 15 то 20 дақиқа дар 37 C нигоҳ дошта мешавад. Дар татбиқи охирини ҳамоҳангсозии усули CLSI H44 маҳлули камконсентратсияи 0.1 фоиза дар маҳлули намакдори фосфатбуферӣ бо pH 7.4 истифода шуд; инкубатсия дар 20 C барои 10 дақиқа ва бе фиксатсия гузаронида шуд, чунон ки дар таҳқиқоти ҳамоҳангсозии NMB дар соли 2026 гузориш шудааст.

Қоидаҳои ҳисоб барои ҳамаи вариантҳо яксонанд. Ҳуҷайраро ретикулосит ҳисоб кунед, агар он ҳадди ақал ду доначаи ҷудогонаи кабудранг ё ду порчаи ришта дошта бошад; ин таҳшини ҷудогонаи рангкунандаро аз ҳисоб хориҷ мекунад. Дар кори муқаррарӣ ҳадди ақал 1,000 ҳуҷайраи сурхи хунро ҳисоб карда, ретикулоситҳоро бо фоиз гузориш диҳед. Ҳангоми паст будани фоиз, талаботи оморӣ шумораи бештари ҳуҷайраҳоро тақозо мекунанд. Дар шарҳи методологияи CLSI H44 қайд мешавад, ки ҳангоми тақрибан 1 фоиз будани ретикулоситҳо барои то 5 фоиз расонидани тағйирпазирии ҳисоб тақрибан 4,400 ҳуҷайра лозим аст; ин дар шарҳи CLSI H44 дар De Gruyter оварда шудааст. Диски окулярии Миллер ҳисобҳои калонро амалан имконпазир мекунад. Рангкунандаро филтр кунед ё маҳлули онро нав тайёр кунед, зеро таҳшин метавонад ба дохилшавиҳои доначамонанд монанд бошад.

Ҷисмчаҳои Ҳайнтс дар ҳамон препарат

Ҳамон мазоки суправиталӣ метавонад ҷисмчаҳои Ҳайнтсро низ нишон диҳад, ки ҷамъшавиҳои гемоглобини оксидшуда ва денатуратсияшуда мебошанд, на РНК-и боқимонда. Дар препаратҳои кабуди метилении нав онҳо ҳамчун ҷисмчаҳои гирд, аксаран ягона ва наздики мембрана намоён мешаванд ва нисбат ба маводи тӯрмонанду риштагӣ кабуди равшантар мегиранд. Онҳо ҳангоми фиксатсия ва рангкунии муқобил хуб нигоҳ намемонанд, бинобар ин мазоки фиксатсиянашударо баррасӣ кунед. Дар протоколи охирин 20 микролитр хуни дорои EDTA бо 20 микролитр кабуди метилении нави 1 фоиза ва 15 дақиқа инкубатсия истифода шуд; ҳуҷайраҳои дорои ҷисмчаҳои Ҳайнтс дар байни 250 эритросит шумурда шуданд, чунон ки дар таҳқиқоти PMC, ки ин усулро гузориш медиҳад омадааст.

Ду фарқ аз тафсири нодуруст пешгирӣ мекунанд. Аввал, бунафши метил ва бунафши кристаллӣ ҷисмчаҳои Ҳайнтсро нисбат ба кабуди метилении нав пуррангтар мекунанд, чунон ки дар мавзуи ScienceDirect оид ба ҷисмчаҳои Ҳайнтс қайд шудааст. Кабуди метилении нав ҳангоми арзёбии якҷояи ретикулоситҳо ва ҷисмчаҳои Ҳайнтс интихоби қулай аст, на пурқувваттарин рангкунандаи махсус барои ҷисмчаҳои Ҳайнтс. Дуюм, дохилшавиҳои HbH дар ҳолати ҳомилии алфа-талассемия пас аз рангкунии суправиталӣ дар тамоми ҳуҷайра нуқтаҳои сершумори майда ҳосил мекунанд, дар ҳоле ки ҷисмчаҳои классикии Ҳайнтс камтар, калонтар ва аксаран бо мембрана алоқаманданд. Таҳшини рангкунанда омили сеюми монандӣ аст: он берун аз ҳамвории фокусии ҳуҷайраҳо ҷойгир буда, аз як майдони дид ба дигараш фарқ мекунад.

Кабуди крезилии дурахшон дар муқоиса бо кабуди метилении нав

Ҳар ду рангкунанда барои ретикулоситҳо рангкунандаҳои суправиталӣ мебошанд, вале стандартизатсия ба яке аз онҳо бартарӣ медиҳад. Усули ретикулоситҳои CLSI H44-A2, ки якҷоя бо Шӯрои байналмилалии стандартизатсия дар гематология таҳия шудааст ва дар саҳифаи стандарти CLSI H44 оварда шудааст, рангкунии хуни дорои EDTA бо кабуди метилении навро ҳамчун усули дастии муқоисавӣ муайян мекунад. Таълими классикии гематология дар бораи намуди зоҳирӣ низ ҳаминро тасдиқ мекунад: кабуди метилении нав риштаҳоро пуррангтар ва якхелатар ранг мекунад, дар ҳоле ки натиҷаҳои кабуди крезилии дурахшон байни партияҳо ва намунаҳо бештар фарқ мекунанд.

Ин мақом ба тавзеҳ ниёз дорад. Дастури ICSH барои арзёбии анализаторҳо микроскопияи дастӣ бо кабуди метилении навро ҳамчун равиши муқоисавии истинодӣ қабул мекунад, вале онро субъективӣ ва нисбатан камдақиқ меномад; дар ҷойҳое, ки дастрасанд, усулҳои истинодии ситометрияи ҷараёнӣ афзал дониста мешаванд. Муқоисаи 100 намуна дар соли 2022 нишон дод, ки каҷравӣ нисбат ба анализатори он таҳқиқот ҳангоми истифодаи кабуди крезилии дурахшон аз кабуди метилении нав камтар буд; ин дар муқоисаи усулҳои рангкунӣ дар PMC гузориш шудааст. Хулосаи асоснок барои донишҷӯён чунин аст: кабуди метилении навро ҳамчун меъёри стандартишудаи муқоисаи дастӣ истифода баред, ҳар усули маҳаллии кабуди крезилии дурахшонро бо он ё бо усули автоматикӣ санҷед ва дар ҳар ду ҳолат аз микроскопияи дастӣ парокандагии бештари натиҷаҳоро интизор шавед. Дар адабиёти пешинаи стандартизатсия инчунин Azure B-и тозашуда ҳамчун алтернативаи аз ҷиҳати химиявӣ тозатар пешниҳод мешуд, зеро партияҳои рангкунандаҳои тиҷоратӣ фарқ мекарданд; ин дар таҳқиқоти Маршалл оид ба Azure B омадааст ва мефаҳмонад, ки чаро дараҷаи тозагии реагент ҳанӯз дар баҳсҳои усулҳо зикр мешавад.

Пешгирии хатогиҳои маъмул

Чор иштибоҳ сабаби аксари препаратҳои номуваффақ мешаванд. Фармоиш додани кабуди метилении маъмулӣ ба ҷойи кабуди метилении нав N аз сабаби хусусиятҳои химиявӣ рангкунии суст медиҳад, на аз сабаби техникаи иҷро. Фиксатсия ё рангкунии муқобил пеш аз баррасӣ сигнали суправиталиро аз байн мебарад. Ҳамчун донача ҳисоб кардани таҳшини рангкунанда натиҷаро барзиёд мекунад; қоидаи ду донача ва рангкунандаи филтршуда аз ин пешгирӣ мекунанд. Ҳангоми паст будани фоизи ретикулоситҳо ҳисоб кардани шумораи хеле ками ҳуҷайраҳо рақамеро медиҳад, ки зоҳиран дақиқ аст, вале ҳудудҳои эътимоди васеъ дорад. Ҳар иштибоҳ як аломати муштарак дорад: микроскопист микроскопро барои натиҷае айбдор мекунад, ки дар марҳилаи кор бо реагент муайян шуда буд.