Чаро кабуди метилен ҳамчун рангкунандаи иловагӣ дар рангкунии кислотабардор истифода мешавад

Корманди лаборатория пас аз анҷоми тамоми пайдарпаии рангкунӣ молиши балғамро месанҷад. Чӯбчамикробҳои сурх дар заминаи кабуд равшан фарқ мекунанд ва дар гузориш навишта мешавад, ки бациллаҳои кислотабардор мушоҳида шуданд. Рӯзи дигар дар шишаи дигари предметӣ заминаи якранги кабуд бе чӯбчамикробҳои сурх дида мешавад ва натиҷа ҳамчун манфӣ барои сил гузориш дода мешавад. Яке аз ин гузоришҳо аз он чизе, ки шишаи предметӣ асоснок мекунад, бештар хулоса мебарорад — ва он гузориши аввал нест.

Сарчашмаи нофаҳмӣ дар дарки мафҳум аст. Корманди лаборатория рангкунандаи кабудро қисми кимиёи ошкорсозӣ ҳисобидааст, гӯё кабуди метилен барои ёфтани микобактерияҳо кумак кунад. Аммо чунин нест. То лаҳзае, ки кабуди метилен ба шишаи предметӣ мерасад, санҷиш аллакай анҷом ёфтааст. Рангкунанда танҳо заминаро ранг мекунад, то натиҷа хонданӣ шавад. Ин мақола вазифаи кабуди метиленро дар рангкунии кислотабардор, сабаби интихоби ранги кабуд ба ҷойи ранги дигар ва хулосаҳоеро шарҳ медиҳад, ки аз сурх дар заминаи кабуд баровардан мумкин аст.

Ҷавоби кӯтоҳ

Рангкунии кислотабардор санҷиши тафриқавиест, ки бар се ғоя асос ёфтааст. Карболфуксин, рангкунандаи асосӣ, ба ҳар ҳуҷайра, аз ҷумла ба микобактерияҳои дорои пардаи муммонанд, маҷбуран ворид карда мешавад. Кислота-спирт, моддаи берангкунанда, рангкунандаи сурхро аз ҳуҷайраҳои муқаррарӣ хориҷ мекунад, вале онро аз ҳуҷайраҳои кислотабардор гирифта наметавонад. Сипас кабуди метилен, рангкунандаи иловагӣ, ҳама чизеро, ки берангкунанда аз ранг холӣ кардааст, ранг мекунад. Аз ин рӯ, ҳуҷайраҳои ғайрикислотабардор, ҳуҷайраҳои мизбон ва боқимондаҳо кабуд менамоянд, дар ҳоле ки бациллаҳои кислотабардор сурх мемонанд. Рангкунандаи иловагӣ тазодро таъмин мекунад. Он дар кимиёе, ки ҳуҷайраро кислотабардор мегардонад, ҳеҷ нақш надорад.

Ҳар марҳила чӣ кор мекунад

Нақшаи зер тақсимоти вазифаҳоро нишон медиҳад. Онро аз чап ба рост ҳамчун тартиби амал бихонед; рахи поёниро бошад, ҳамчун ёдрасӣ бинед, ки ҳар гурӯҳи усулҳои рангкунӣ ба саволи дигар ҷавоб медиҳад.

Марҳилаи аввал воридшавӣ аст. Микобактерияҳо ба рангкунандаҳои обии муқаррарӣ муқовимат мекунанд, зеро пардаи онҳо ба таври ғайриодӣ гидрофобӣ аст; бинобар ин, протокол воридшавиро маҷбурӣ таъмин мекунад. Дар усули Зил–Нелсен гармкунӣ бо буғ карболфуксини дорои фенолро аз девораи муммонанд мегузаронад. Дар усули сарди Кинюн гармкунӣ бо таркиби хеле қавитари рангкунандаи асосӣ иваз мешавад ва баъзе вариантҳои тағйирёфтаи бе гармкунӣ моддаҳои сатҳфаъолро илова мекунанд. Протоколҳои рангкунии кислотабардори Ҷамъияти амрикоии микробиология ҳар ду таркибро паҳлу ба паҳлу тавсиф мекунанд ва фарқи консентратсия назаррас аст: тақрибан 0.3 g фуксини асосӣ ба ҳар 100 mL барои усули гармшаванда дар муқобили тақрибан 4 g барои усули сард.

Марҳилаи дуюм тафриқа аст. Кислота-спирт, ки одатан аз 3 mL кислотаи хлориди консентратсияшуда дар 97 mL этаноли 95-фоиза иборат аст, рангкунандаи сурхро аз ҳар ҳуҷайрае мешӯяд, ки деворааш муқовимати махсус надорад. Ҳуҷайраҳои дорои пардаи липидии солими микобактериявӣ рангкунандаро нигоҳ медоранд. Тамоми усул ба ҳамин марҳила такя мекунад ва маҳз ин марҳила ба тарзи иҷро бештар ҳассос аст, чунон ки дар поён баррасӣ мешавад.

Марҳилаи охирин эҷоди тазод аст. Акнун дар шишаи предметӣ ҳуҷайраҳои кислотабардори сурх дар заминаи қариб беранги ҳуҷайраҳои аз ранг холишуда қарор доранд. Кабуди метилен бо консентратсияи 0.3 фоиз w/v намоёнии ин заминаро бо ранге барқарор мекунад, ки аз сурх то ҳадди имкон фарқ дорад. Рангкунии иловагӣ кӯтоҳ аст: одатан дар усули гармшаванда 20 то 30 сония ва дар баъзе вариантҳои усули сард то чанд дақиқа давом мекунад. Давомнокӣ ба протокол вобаста аст, на ба хусусияти худи рангкунанда.

Чаро ҳамин рангкунанда ва чаро ранги кабуд

Кабуди метилен рангкунандаи асосии катионӣ аст, яъне иони рангдори он заряди мусбат дорад ва ба сатҳҳои манфизарядноки бактерияҳои берангшуда, ҳуҷайраҳои мизбон ва боқимондаҳо мепайвандад. Микробиологияи OpenStax ин мантиқи зарядро ҳамчун принсипи умумии рангкунандаҳои асосӣ тавсиф мекунад. Аммо кабуди метилен дар ин ҷо аз ҷиҳати кимиёвӣ беназир нест. Бунафши кристаллӣ ва сафранин низ рангкунандаҳои асосӣ мебошанд. Интихоб оптикӣ аст, на кимиёвӣ.

Чӯбчамикробҳои сурх ба заминаи дорои ранги муқобил ниёз доранд ва кабуд барои микроскопияи майдони равшан ба таври мувофиқтарин аз сурх фарқ мекунад. Сафранин рангкунандаи иловагии номуносиб мебуд, зеро ранги ниҳоии гулобӣ-сурхи он ба карболфуксини нигоҳдошташуда хеле наздик аст ва ҳамин тафовутеро, ки тартиби рангкунӣ ба вуҷуд овардааст, аз байн мебарад. Бунафши кристаллӣ заминаи бунафши тира медод, ки бо бациллаҳои борики сурх барои ҷалби диққат рақобат мекунад. Далели қавитарини он ки вазифа эҷоди тазод аст, на кимиё, имкони ивазкунӣ мебошад: рангкунандаҳои иловагии сабз, ба монанди сабзи малахитӣ ва сабзи дурахшон, дар баъзе протоколҳои байторӣ ва тағйирёфта истифода мешаванд ва санҷиш ҳамоно кор мекунад, зеро ҳар ранги ба таври равшан фарқкунанда ҳамин вазифаро иҷро мекунад.

Аз ин ду натиҷаи амалӣ бармеояд. Аввал, дар дорухати стандартӣ танзими pH пешбинӣ нашудааст; ин маҳлули одии обии 0.3-фоизаро бо таркибҳои ишқорӣ, ба монанди кабуди метилени Лёффлер, омехта накунед: онҳо ба мафҳуми дигари рангкунӣ тааллуқ доранд. Дуюм, аз ҳад зиёд ранг кардан зарар дорад. Адабиёти гистологӣ махсусан ҳушдор медиҳад, ки заминаи аз ҳад тираи кабуд метавонад бациллаҳои камшуморро пинҳон кунад. Аз ин рӯ, аз муҳлати иҷозатдодаи протокол зиёдтар бо рангкунанда пӯшондани шиша хондании натиҷаро бе ягон фоида коҳиш медиҳад.

Кимиёи девора, ки санҷишро имконпазир мекунад

Сабаби қобилияти тафриқавии кислота-спирт дар пардаи микобактерия аст. Асоси сохтории он маҷмааи миколил-арабиногалактан-пептидогликан мебошад: пептидогликан ба арабиногалактан пайваст аст ва нӯгҳои берунии арабиногалактан кислотаҳои миколии занҷирашон хеле дарозро нигоҳ медоранд. Онҳо микомембранаи берунии аз липидҳо ғаниро бо гузаронандагии ғайриодии паст ташкил медиҳанд. Баррасии мембранаи берунии микобактерияҳо ин сохторро муфассал шарҳ медиҳад. Ин монеа дар ҳар ду самт амал мекунад. Он ба воридшавии рангкунанда муқовимат мекунад, аз ҳамин сабаб барои воридшавӣ гармӣ ё рангкунандаи асосии қавитар лозим аст; инчунин ба хориҷшавии рангкунанда муқовимат мекунад, аз ҳамин сабаб кислота-спирт карболфуксинро пас аз ворид шуданаш гирифта наметавонад. Бактерияҳои муқаррарӣ чунин парда надоранд ва рангкунандаро аз даст медиҳанд. Пас, кислотабардориро беҳтар аст ҳамчун падидаи монеаи липидӣ фаҳмид, на ҳамчун пайвастшавии кимиёвии фуксин ба кислотаи миколӣ.

Ин кимиё инчунин як муаммои маъмулро шарҳ медиҳад: микобактерияҳо бо усули Грам суст ва пешгӯинашаванда ранг мешаванд ва баъзан ҳамчун шаклҳои хираи донадор ё сояҳои беранг менамоянд. Девораи гидрофобии онҳо воридшавии бунафши кристаллиро маҳдуд мекунад. Рангкунии кислотабардор варианти тағйирёфтаи рангкунии Грам нест. Он принсипи дигари тафриқавӣ аст, ки ба хусусияти дигари девора асос ёфтааст, чунон ки муқоисаи рангкунии сода ва рангкунии Грам барои ду усули дигар нишон медиҳад.

Се усул, се савол

Барои шиносоӣ бо гурӯҳи васеътари усулҳои рангкунии бактерияҳо бо як рангкунанда, ба атласи рангкунӣ барои микроскопия нигаред.

Сурх дар заминаи кабуд чиро исбот карда наметавонад

Чӯбчамикробҳои сурх маънои онро доранд, ки микроорганизмҳо карболфуксинро ҳангоми таъсири кислота-спирт нигоҳ доштаанд. Ин бозёфт ба Mycobacterium tuberculosis мувофиқ аст, аммо дастури CDC оид ба ташхиси сил ошкоро қайд мекунад, ки микобактерияҳои дигар низ кислотабардоранд. Аз ин рӯ, муайянкунии намуд кишт ва санҷиши кислотаҳои нуклеинро талаб мекунад, на рангро.

Хатоҳои иҷро бештар ба ду марҳилаи шустан вобастаанд. Берангкунии нокифоя маводи заминаро сурх мемонад ва ба тафсири бардурӯғи мусбат роҳ медиҳад. Берангкунии аз ҳад зиёд рангкунандаи асосии суст нигоҳдошташударо хориҷ мекунад ва ба натиҷаҳои бардурӯғи манфӣ мусоидат мекунад. Истифодаи аз ҳад зиёди рангкунандаи иловагӣ бациллаҳои камшуморро дар кабудӣ пинҳон мекунад. Молишҳои ғафс, реактивҳои таҳшиншуда ва оби олудаи шустушӯй низ артефактҳои худро илова мекунанд.

Новобаста аз он ки тартиб то чӣ андоза дуруст иҷро шудааст, ҳассосият бо миқдори микроорганизмҳо маҳдуд аст. Микроскопияи муқаррарии молиш тақрибан 5,000 то 10,000 бацилла дар ҳар миллилитри балғамро талаб мекунад. Баррасиҳои пешинаи далелҳои CDC ҳассосияти молишро дар ҳолатҳои сили шуш, ки бо кишт тасдиқ шудаанд, тақрибан 45 то 80 фоиз арзёбӣ мекарданд. Аз ин рӯ, молиши манфӣ ҳеҷ гоҳ силро истисно намекунад. Дастури ҷории CDC киштро дар баробари ҳар молиш нигоҳ медорад ва тавсия медиҳад, ки ҳангоми гумонбарӣ ба сили шуш ва дар сурате ки натиҷа тарзи идоракунии ҳолатро тағйир медиҳад, ҳадди ақал як намунаи роҳҳои нафас бо усули амплификатсияи кислотаҳои нуклеин санҷида шавад.

Кори амалӣ бояд ба протоколҳои тасдиқшуда такя кунад

Тавсифҳои таълимӣ, аз ҷумла ин мақола, барои кори клиникӣ иҷозат намедиҳанд. Барои кори амалӣ дар лаборатория тартиби стандартии амалиётии лабораторияро риоя кунед, ки санҷидаву тасдиқ шудааст ва ба ҳуҷҷатҳои ҷории CDC, APHL ё CLSI мувофиқат мекунад; дастури истинодии CDC оид ба рангкунии кислотабардор дар бойгонии Stacks нишон медиҳад, ки чунин тартибҳо реактивҳо ва нишондиҳандаҳои натиҷаро чӣ гуна муайян мекунанд. Кор бо намунаҳои марбут ба сил маҳдудсозии паҳншавиро талаб мекунад: молишҳо дар ҷевони бехатарии биологӣ омода мешаванд, зеро омодасозӣ аэрозолҳо ва пошишҳоро ба вуҷуд меорад. Дастури бехатарии лаборатории CDC мегӯяд, ки ҳатто молишҳои бо гармӣ фиксатсияшуда метавонанд бациллаҳои зиндаи силро дар бар гиранд ва бо онҳо ҳамоно бояд ҳамчун маводи олуда муносибат кард. Сабти Китобхонаи тасвирҳои тандурустии ҷамъиятии CDC дар бораи молиши бо карболфуксин ва кабуди метилен рангшуда, ки барои M. leprae санҷида шудааст, ёдрасии муфиди доираи истифодаи усул берун аз сил аст: ҳамон тазоди сурх дар заминаи кабуд дар ҳар ҷое хизмат мекунад, ки микроорганизмҳои кислотабардор ҷустуҷӯ мешаванд. Натиҷаи манфии бодиққат тафсиршуда низ худ натиҷаест, ки сабт карданаш арзанда аст.

Хондани шишаи предметии тайёр

Рангкунандаи иловагӣ аҳамияти худро ҳангоми азназаргузаронии аввалия нишон медиҳад. Микроскопист ҳангоми мушоҳида бо калонкунии паст аввал заминаи кабудро барои арзёбии сифати молиш истифода мебарад: тақсимоти яксони ҳуҷайраҳо, ҳуҷайраҳои солими мизбон барои танзими фокус ва набудани таҳшини зиёд. Сипас объектҳои сурхи эҳтимолӣ маҳз барои он диққатро ҷалб мекунанд, ки дар шиша чизи дигари сурх нест. Тасдиқ бо иммерсияи равғанӣ сурат мегирад: дар ин ҳолат бациллаҳои ҳақиқӣ ҳамчун чӯбчамикробҳои борики интизоршаванда, баъзан каме каҷ ё донадор, намоён мешаванд, на ҳамчун зарраҳои якшакли рангкунанда.

Рангкунии замина инчунин тарзи баёни гузоришро муайян мекунад. Барои шишае, ки бациллаҳои сурх дорад, гузориш дода мешавад, ки бациллаҳои кислотабардор мушоҳида шуданд; аксар вақт дараҷаи ниммиқдорӣ мувофиқи ҷадвали лаборатория низ нишон дода мешавад. Барои шишае, ки микроорганизмҳои сурх надорад, гузориш дода мешавад, ки бациллаҳои кислотабардор мушоҳида нашуданд, вале ҳеҷ гоҳ «манфӣ барои сил» гуфта намешавад. Ин фарқ муҳим аст, зеро майдони кабуд нишон медиҳад, ки рангкунӣ кор кардааст, ҳуҷайраҳо рангкунандаи иловагиро гирифтаанд ва шароити оптикӣ мувофиқ будааст, аммо дар бораи микроорганизмҳои аз ҳадди ошкорсозӣ камтар ҳеҷ чиз намегӯяд. Майдони танҳо кабуд натиҷаи дуруст дар бораи шиша аст, на ҳукм дар бораи бемор.

Тақсимоти вазифаҳоро дар хотир нигоҳ доред ва навиштани гузориш осон мешавад. Карболфуксин объектҳои эҳтимолиро ошкор мекунад. Кислота-спирт санҷишро анҷом медиҳад. Кабуди метилен танҳо ҷавобро хонданӣ мекунад: сурх рангкунандаро дар муқобили кислота нигоҳ дошт, кабуд онро аз даст дод. Ҳамаи чизҳои дигар — намуд, миқдор ва аҳамияти клиникӣ — аз корҳои берун аз шишаи предметӣ ба даст меоянд.