நியூ மெத்திலீன் ப்ளூவும் ரெட்டிகுலோசைட் நிறமேற்றமும்: தனித்துவமான சாயமும் உயிருள்ள செல்களுக்கான முறையும்

ஒரு மாணவர் ரெட்டிகுலோசைட் எண்ணிக்கையைக் கணக்கிடத் தயாராகிறார். மெத்திலீன் ப்ளூவை வாங்கி, இரத்தத்துடன் கலக்கிறார்; ஆனால் கிட்டத்தட்ட எதுவுமே தென்படவில்லை. அவருடன் படிக்கும் மற்றொருவர் நியூ மெத்திலீன் ப்ளூ என்று பெயரிடப்பட்ட பாட்டிலைப் பயன்படுத்துகிறார். சில சிவப்பணுக்களுக்குள் தெளிவான நீல நூலிழைகள் தெரிகின்றன. இரண்டாவது பாட்டிலில் உள்ள சாயம் புதிதானதாகவோ அதிகச் செறிவுடையதாகவோ இருக்கும் என்று முதல் மாணவர் கருதுகிறார். இரண்டுமே இல்லை. அதில் இருப்பது வேறொரு மூலக்கூறு.

இந்தத் துறையில் ஏற்படும் பெரும்பாலான குழப்பங்களுக்குக் காரணம் இந்தக் கருத்துப் பிழைதான். நியூ மெத்திலீன் ப்ளூ என்ற பெயர், அது மெத்திலீன் ப்ளூவின் மேம்படுத்தப்பட்ட தொகுதி என்று தோன்றச் செய்கிறது. ஆனால் வேதியியல் அப்படிச் சொல்லவில்லை. நியூ மெத்திலீன் ப்ளூ N என்பது தனக்கென ஒரு Colour Index எண், தனித்துவமான பதிலீட்டு அமைப்பு, இரத்தவியலில் தரப்படுத்தப்பட்ட பங்கு ஆகியவற்றைக் கொண்ட தனி பீனோதையசீன் சாயமாகும். இந்த வேறுபாடு தெளிவானதும், முறையின் மற்ற அம்சங்கள் எளிதாகப் புரியும்: நிறமேற்றும்போது செல்கள் ஏன் உயிருடன் இருக்க வேண்டும், எதை ரெட்டிகுலோசைட் எனக் கணக்கிட வேண்டும், ஹைன்ஸ் உடல்கள் இதில் எவ்வாறு இடம்பெறுகின்றன, பிரில்லியன்ட் கிரெசில் ப்ளூ எப்போது பயன்படுகிறது என்பவை.

சுருக்கமான பதில்

இரத்தவியல் வினைப்பொருளான நியூ மெத்திலீன் ப்ளூ N பொதுவாக நியூ மெத்திலீன் ப்ளூவுக்கான PubChem பதிவில் Basic Blue 24 என அடையாளப்படுத்தப்படுகிறது. இதன் C.I. 52030, CAS 1934-16-3, மூலக்கூறு வாய்பாடு C18H22ClN3S. சாதாரண மெத்திலீன் ப்ளூ என்பது அதன் PubChem பதிவில் மெத்தில்தையோனினியம் குளோரைடு, Basic Blue 9 எனக் குறிப்பிடப்பட்டுள்ளது. இதன் C.I. 52015, CAS 61-73-4, மூலக்கூறு வாய்பாடு C16H18ClN3S. கட்டமைப்பில், மெத்திலீன் ப்ளூவில் டைமெத்தில்அமினோ தொகுதிகள் இருக்கும் இடத்தில் நியூ மெத்திலீன் ப்ளூவில் எத்தில்அமினோ பக்கச் சங்கிலிகள் உள்ளன; மேலும் அதன் வளையத்தில் இரண்டு மெத்தில் தொகுதிகள் உள்ளன. இந்த வேறுபாடு நிறமேற்றும் தன்மையை மாற்றுகிறது. சாதாரண மெத்திலீன் ப்ளூ ஒப்பீட்டளவில் மோசமான ரெட்டிகுலோசைட் நிறமேற்றி என்றும், நியூ மெத்திலீன் ப்ளூ ஆழமான, சீரான நிறமேற்றத்தைத் தருகிறது என்றும் இரத்தவியல் நூல்கள் விவரிக்கின்றன. இந்த ஒப்பீடு நியூ மெத்திலீன் ப்ளூ குறித்த ScienceDirect தலைப்பில் சுருக்கமாகக் கொடுக்கப்பட்டுள்ளது.

ஆம், நியூ மெத்திலீன் ப்ளூ ஒரு சுப்ராவைட்டல் நிறமேற்றி. உடலிலிருந்து அகற்றப்பட்ட பின்னரும் நிலைப்படுத்தப்படுவதற்கு முன்பும் உயிருள்ள செல்களுக்கு நிறமேற்றுவதே சுப்ராவைட்டல் நிறமேற்றம் என்று சுப்ராவைட்டல் நிறமேற்றக் கொள்கைகள் குறித்த NCBI மதிப்பாய்வு வரையறுக்கிறது. நியூ மெத்திலீன் ப்ளூ, பிரில்லியன்ட் கிரெசில் ப்ளூ ஆகிய இரண்டும் இந்த வகையைச் சேர்ந்தவை. CLSI ரெட்டிகுலோசைட் தரநிலை, நியூ மெத்திலீன் ப்ளூவைச் சுப்ராவைட்டல் சாயமாக வெளிப்படையாகக் குறிப்பிடுகிறது. மாணவர்கள் சில நேரங்களில் இதை நிலைப்படுத்தப்பட்ட தடவல்களுக்கான ரோமானோவ்ஸ்கி நிறமேற்றத்துடன் சேர்த்துப் புரிந்துகொள்கிறார்கள். அந்தப் புரிதல் இங்கே பொருந்தாது. முதலில் நிலைப்படுத்தினால் இந்த முறை செயல்படாது.

ஒத்த சாயப் பெயர்களை ஆராயும் வாசகர்களுக்கு, மெத்தில் ப்ளூ மற்றும் மெத்திலீன் ப்ளூ இடையிலான வேறுபாடு என்ற கட்டுரை, எதிர்மின் அயனி டிரைஅரில் மெத்தேன் சாயத்திற்கும் நேர்மின் அயனி பீனோதையசீன் குடும்பத்திற்கும் இடையிலான வேறொரு பெரிய குழப்பத்தை விளக்குகிறது. ஆய்வக நிறமேற்றம் குறித்த மேலோட்டம் நிலைப்படுத்தப்பட்ட தடவல் முறைகளுடன் சுப்ராவைட்டல் முறைகளையும் ஒப்பிட்டு விளக்குகிறது. இரத்தச் செல்களின் உருவவியல் வழிகாட்டி, விரிவான வேறுபாட்டு மதிப்பீட்டில் ரெட்டிகுலோசைட் மதிப்பீடு எங்கு இடம்பெறுகிறது என்பதைக் காட்டுகிறது.

பட்டியல்களைப் பயன்படுத்தும்போது ஒரு எச்சரிக்கை: நியூ மெத்திலீன் ப்ளூவின் தனியான துத்தநாக குளோரைடு இரட்டை உப்பு வடிவம் CAS 6586-05-6 என்ற எண்ணில் உள்ளது. எனவே, ஆய்வு முறைகள் பகுதியில் பொதுப் பெயரை மட்டும் குறிப்பிடாமல், உப்பு வடிவத்தையும் வழங்குநரையும் குறிப்பிட வேண்டும்.

சுப்ராவைட்டல் நிறமேற்றம் உண்மையில் என்ன செய்கிறது

ரெட்டிகுலோசைட் என்பது உட்கருவை இழந்துவிட்டாலும் மீதமுள்ள ரைபோசோமல் RNA-வைத் தக்கவைத்திருக்கும் இளம் சிவப்பணு. நிறமேற்றப்படாத ஈரத் தயாரிப்பில் அந்த RNA தெரியாது. சுப்ராவைட்டல் சாயம் உயிருள்ள செல்லுக்குள் நுழைந்து, அந்த RNA-வை நீலத் துகள்களாகவும் நூலிழைகளாகவும் வீழ்படிவாக்குகிறது அல்லது திரட்டுகிறது. எண்ணெய் மூழ்கல் நுண்ணோக்கிப் பார்வையில் தெரியும் வலைபோன்ற நூலிழைப் பொருள் இதுவே. ஆகவே, அந்த வலைப்பின்னல் நிறமேற்றத்தால் உருவாகும் பொருள்; நிறம் பெறுவதற்காகக் காத்திருக்கும், ஏற்கெனவே உருவான எலும்புக்கூடு போன்ற அமைப்பு அல்ல. இதனால்தான் செய்முறை மாறிகள்—சாயச் செறிவு, தாங்கல் கரைசல், இரத்தம் மற்றும் சாயத்தின் விகிதம், வெப்பநிலை, நேரம்—சாயத்தின் பெயருக்கு இணையான முக்கியத்துவம் பெறுகின்றன.

நடைமுறையில் இதன் விளைவு, செயல்பாடுகளின் வரிசையைக் கண்டிப்பாகப் பின்பற்ற வேண்டும் என்பதுதான்: முதலில் உறைதல் தடுப்புப் பொருள் சேர்க்கப்பட்ட இரத்தத்தைச் சாயத்துடன் கலந்து, அடைகாத்து, பின்னர் தடவல்களைத் தயாரிக்க வேண்டும். அவற்றை நிலைப்படுத்தாமலும் எதிர்நிறமேற்றி பயன்படுத்தாமலும் ஆய்வு செய்ய வேண்டும். நிறமேற்றுவதற்கு முன் நிலைப்படுத்துவதோ, மங்கலான நூலிழைகளை மறைக்கும் எதிர்நிறமேற்றியைப் பயன்படுத்துவதோ, எண்ணிக்கை சார்ந்திருக்கும் தகவலை அழித்துவிடும்.

நியூ மெத்திலீன் ப்ளூவுடன் நடைமுறைக்கு ஏற்ற ரெட்டிகுலோசைட் செய்முறை

அனைவருக்கும் பொதுவான ஒரே கலவை இல்லை; எனவே பயன்படுத்திய கலவையைக் குறிப்பிடுங்கள். ஆவணப்படுத்தப்பட்ட மூன்று மாற்று முறைகள் அதன் வேறுபாடுகளை எடுத்துக்காட்டுகின்றன.

பாரம்பரிய பிரெக்கர் வகைச் செய்முறையில், பொட்டாசியம் ஆக்சலேட்டுடன் தோராயமாக 0.5 percent நியூ மெத்திலீன் ப்ளூ பயன்படுத்தப்படுகிறது. இது நன்கு கலக்கப்பட்ட EDTA இரத்தத்துடன் சம அளவுகளில் கலக்கப்பட்டு, அறை வெப்பநிலையில் சுமார் 10 முதல் 15 minutes அடைகாக்கப்படுகிறது. மெதுவாக மீண்டும் கலக்கிய பிறகு, மெல்லிய ஆப்பு வடிவத் தடவல்கள் தயாரிக்கப்பட்டு, காற்றில் உலர்த்தப்பட்டு, நிலைப்படுத்தப்படாமல் 100x எண்ணெய் மூழ்கல் ஆப்ஜெக்டிவ் லென்ஸின் கீழ் ஆய்வு செய்யப்படுகின்றன. ரெட்டிகுலோசைட் எண்ணிக்கைக்கான NCBI செய்முறை இந்தச் செயல்முறையையும் அதனுடன் பயன்படுத்தப்படும் எண்ணிக்கைச் சட்டகத்தையும் விவரிக்கிறது.

டேசி மற்றும் லூயிஸ் மாற்று முறையில், சிட்ரேட் உப்புக் கரைசலில் 1.0 percent நியூ மெத்திலீன் ப்ளூ பயன்படுத்தப்படுகிறது. இது அதன் அளவைப் போல 2 முதல் 4 மடங்கு இரத்தத்துடன் கலக்கப்பட்டு, தடவல் தயாரிப்பதற்கு முன் 37 C வெப்பநிலையில் 15 முதல் 20 minutes வைக்கப்படுகிறது. CLSI H44 செய்முறையை ஒருமைப்படுத்துவதற்கான அண்மைய நடைமுறை அமலாக்கத்தில், pH 7.4 கொண்ட பாஸ்பேட் தாங்கல் உப்புக் கரைசலில் குறைந்த செறிவான 0.1 percent கரைசல் பயன்படுத்தப்பட்டது. நிலைப்படுத்தாமல் 20 C வெப்பநிலையில் 10 minutes அடைகாக்கப்பட்டது. இது 2026 NMB ஒருமைப்படுத்தல் ஆய்வில் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ளது.

எண்ணிக்கை விதிகள் இந்த மாற்று முறைகள் அனைத்திற்கும் பொதுவானவை. ஒரு செல்லில் தனித்தனியாகத் தெரியும் குறைந்தது இரண்டு நீல நிறமேற்றப்பட்ட துகள்கள் அல்லது நூலிழைத் துண்டுகள் இருந்தால், அதை ரெட்டிகுலோசைட் எனக் கணக்கிடுங்கள். இதனால் தனித்த சாயப் படிவு கணக்கில் சேராது. வழக்கமான பணியில் குறைந்தது 1,000 சிவப்பணுக்களை எண்ணி, ரெட்டிகுலோசைட்டுகளைச் சதவீதமாகத் தெரிவிக்க வேண்டும். சதவீதம் குறைவாக இருக்கும்போது, புள்ளியியல் அடிப்படையில் அதிக செல்களை எண்ணுவது அவசியம். ரெட்டிகுலோசைட்டுகள் சுமார் 1 percent அளவில் இருக்கும்போது, எண்ணிக்கை மாறுபாட்டை 5 percent ஆகக் குறைக்க சுமார் 4,400 செல்கள் தேவை என்று CLSI H44 முறையியல் மதிப்பாய்வு குறிப்பிடுகிறது; இதை De Gruyter தளத்தில் உள்ள CLSI H44 மதிப்பாய்வில் காணலாம். மில்லர் கண்பார்வை வட்டு அதிக எண்ணிக்கையில் செல்களை எண்ணுவதை நடைமுறைக்கு ஏற்றதாக்குகிறது. சாயத்தை வடிகட்டுங்கள் அல்லது புதிதாகத் தயாரியுங்கள்; ஏனெனில் வீழ்படிவு, துகள்களாலான உட்சேர்க்கைகளைப் போலத் தோன்றும்.

அதே தயாரிப்பில் ஹைன்ஸ் உடல்கள்

அதே சுப்ராவைட்டல் தடவலில் ஹைன்ஸ் உடல்களையும் காணலாம். இவை மீதமுள்ள RNA அல்ல; ஆக்சிஜனேற்றம் அடைந்து இயல்பிழந்த ஹீமோகுளோபினின் திரள்கள். நியூ மெத்திலீன் ப்ளூ தயாரிப்புகளில் இவை வட்டமான உடல்களாகத் தோன்றுகின்றன. பெரும்பாலும் தனியாகவும் செல் சவ்வுக்கு அருகிலும் காணப்படுகின்றன; வலைபோன்ற நூலிழைப் பொருளைவிட வெளிர் நீல நிறமேற்றம் பெறுகின்றன. நிலைப்படுத்தல் மற்றும் எதிர்நிறமேற்றத்திற்குப் பிறகு இவை நன்றாகத் தக்கவைக்கப்படுவதில்லை; எனவே நிலைப்படுத்தப்படாத தடவலை ஆய்வு செய்யுங்கள். அண்மைய செய்முறை ஒன்றில் 20 microliters EDTA இரத்தத்துடன் 20 microliters 1 percent நியூ மெத்திலீன் ப்ளூ கலந்து, 15 minutes அடைகாத்து, 250 சிவப்பணுக்களில் ஹைன்ஸ் உடல்கள் கொண்ட செல்களின் எண்ணிக்கை கணக்கிடப்பட்டது. அந்தச் செய்முறையைத் தெரிவிக்கும் PMC ஆய்வில் இது விவரிக்கப்பட்டுள்ளது.

இரண்டு வேறுபாடுகளை அறிந்திருப்பது தவறான விளக்கங்களைத் தடுக்கிறது. முதலாவதாக, நியூ மெத்திலீன் ப்ளூவைவிட மெத்தில் வயலெட்டும் கிரிஸ்டல் வயலெட்டும் ஹைன்ஸ் உடல்களுக்கு அதிகத் தீவிரமாக நிறமேற்றுகின்றன என்று ஹைன்ஸ் உடல்கள் குறித்த ScienceDirect தலைப்பு குறிப்பிடுகிறது. ரெட்டிகுலோசைட்டுகளையும் ஹைன்ஸ் உடல்களையும் ஒன்றாக மதிப்பிடும்போது நியூ மெத்திலீன் ப்ளூ வசதியான தேர்வு; ஹைன்ஸ் உடல்களுக்கு மட்டும் பயன்படும் மிக வலுவான சாயம் அது அல்ல. இரண்டாவதாக, ஆல்பா தலசீமியா பண்பில் காணப்படும் HbH உட்சேர்க்கைகள், சுப்ராவைட்டல் நிறமேற்றத்திற்குப் பிறகு செல் முழுவதும் ஏராளமான நுண்ணிய புள்ளிகளை உருவாக்குகின்றன. வழக்கமான ஹைன்ஸ் உடல்களோ எண்ணிக்கையில் குறைவாகவும் அளவில் பெரியதாகவும், பெரும்பாலும் செல் சவ்வுடன் தொடர்புடையவையாகவும் இருக்கும். மூன்றாவதாக, சாயப் படிவும் இவற்றைப் போலத் தோன்றலாம்: அது செல்களின் குவியத் தளத்திற்கு வெளியே இருக்கும்; பார்வைப் புலங்களுக்கு இடையே மாறுபடும்.

பிரில்லியன்ட் கிரெசில் ப்ளூ மற்றும் நியூ மெத்திலீன் ப்ளூ ஒப்பீடு

இரண்டு சாயங்களுமே ரெட்டிகுலோசைட்டுகளுக்கான சுப்ராவைட்டல் நிறமேற்றிகள். ஆனால் தரப்படுத்தலில் அவற்றில் ஒன்றுக்கு முன்னுரிமை அளிக்கப்படுகிறது. இரத்தவியலைத் தரப்படுத்துவதற்கான சர்வதேச கவுன்சிலுடன் இணைந்து உருவாக்கப்பட்டு, CLSI H44 தரநிலைப் பக்கத்தில் பட்டியலிடப்பட்டுள்ள CLSI H44-A2 ரெட்டிகுலோசைட் முறை, EDTA இரத்தத்திற்கு நியூ மெத்திலீன் ப்ளூ நிறமேற்றுவதை கைய்முறை ஒப்பீட்டு முறையாகக் குறிப்பிடுகிறது. தோற்றம் குறித்த பாரம்பரிய இரத்தவியல் கற்பித்தலும் இதையே கூறுகிறது: நியூ மெத்திலீன் ப்ளூ நூலிழைகளுக்கு ஆழமான, சீரான நிறமேற்றத்தைத் தருகிறது; பிரில்லியன்ட் கிரெசில் ப்ளூவில் தொகுதிகள் மற்றும் மாதிரிகளுக்கு இடையிலான மாறுபாடு அதிகம்.

அந்த நிலையை ஒரு வரம்புடன் புரிந்துகொள்ள வேண்டும். பகுப்பாய்வுக் கருவி மதிப்பீட்டுக்கான ICSH வழிகாட்டி, கைய்முறையான நியூ மெத்திலீன் ப்ளூ நுண்ணோக்கி ஆய்வை ஆதார ஒப்பீட்டு அணுகுமுறையாக ஏற்றுக்கொள்கிறது. ஆனால் அது மதிப்பிடுபவரின் தீர்ப்பைச் சார்ந்ததும் ஒப்பீட்டளவில் துல்லியக்குறைவானதும் என்று குறிப்பிடுகிறது; கிடைக்கும்போது ஓட்ட சைட்டோமெட்ரி ஆதார முறைகளுக்கு முன்னுரிமை அளிக்கப்படுகிறது. 2022-இல் 100 மாதிரிகளை ஒப்பிட்ட ஓர் ஆய்வு, பயன்படுத்திய பகுப்பாய்வுக் கருவியுடன் ஒப்பிடும்போது, நியூ மெத்திலீன் ப்ளூவைவிட பிரில்லியன்ட் கிரெசில் ப்ளூவில் குறைந்த முறையான விலகலைக் கண்டது. இது நிறமேற்ற முறைகளை ஒப்பிடும் PMC ஆய்வில் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ளது. மாணவர்களுக்கு ஆதாரத்துடன் கூறக்கூடிய சுருக்கம் இதுதான்: நியூ மெத்திலீன் ப்ளூவைத் தரப்படுத்தப்பட்ட கைய்முறை ஒப்பீட்டு நிறமேற்றியாகப் பயன்படுத்துங்கள்; உள்ளூரில் பயன்படுத்தப்படும் எந்தப் பிரில்லியன்ட் கிரெசில் ப்ளூ முறையையும் அதனுடன் அல்லது தானியக்க முறையுடன் ஒப்பிட்டுச் சரிபாருங்கள்; இரண்டில் எதைப் பயன்படுத்தினாலும் கைய்முறை நுண்ணோக்கி ஆய்வில் முடிவுகளின் பரவல் அதிகமாக இருக்கும் என்பதை எதிர்பாருங்கள். வணிகச் சாயத் தொகுதிகள் மாறுபட்டதால், வேதியியல் அடிப்படையில் தூய்மையான மாற்றாகச் சுத்திகரிக்கப்பட்ட Azure B-ஐப் பழைய தரப்படுத்தல் இலக்கியங்களும் பரிந்துரைத்தன. இதை Azure B குறித்த மார்ஷல் ஆய்வில் காணலாம். ஆய்வு முறைகள் குறித்த விவாதங்களில் வினைப்பொருளின் தரம் ஏன் இன்னும் இடம்பெறுகிறது என்பதை இது விளக்குகிறது.

வழக்கமான பிழைகளைத் தவிர்த்தல்

பெரும்பாலான தயாரிப்புகள் தோல்வியடைவதற்கு நான்கு தவறுகளே காரணமாகின்றன. நியூ மெத்திலீன் ப்ளூ N-க்குப் பதிலாகச் சாதாரண மெத்திலீன் ப்ளூவை வாங்கினால், நிறமேற்றம் பலவீனமாக இருக்கும்; அதற்குக் காரணம் நுட்பம் அல்ல, வேதியியல். ஆய்வு செய்வதற்கு முன் நிலைப்படுத்துவதோ எதிர்நிறமேற்றம் செய்வதோ சுப்ராவைட்டல் அடையாளத்தை நீக்கிவிடும். சாய வீழ்படிவைத் துகள்களாக எண்ணுவது முடிவை அதிகரித்துக் காட்டும்; இரண்டு துகள் விதியும் வடிகட்டப்பட்ட சாயமும் இதைத் தடுக்கின்றன. ரெட்டிகுலோசைட் சதவீதம் குறைவாக இருக்கும்போது மிகக் குறைந்த செல்களை எண்ணுவது, துல்லியமானதாகத் தோன்றினாலும் பரந்த நம்பக வரம்புகளைக் கொண்ட எண்ணைத் தருகிறது. ஒவ்வொரு பிழையிலும் ஒரே நிலையே காணப்படுகிறது: வினைப்பொருள் படிநிலையில் தீர்மானிக்கப்பட்ட விளைவுக்கு நுண்ணோக்கி ஆய்வாளர் நுண்ணோக்கியைக் குறை கூறுகிறார்.