மெத்திலீன் நீலம் தன்னை அளவிடப் பயன்படும் பரிசோதனையிலேயே குறுக்கிடும்போது

ஒரு ஆய்வகம் வரிக்குதிரை மீன் கருக்களை வழக்கமான பராமரிப்புச் செறிவில் மெத்திலீன் நீலம் கலந்த நீரில் வளர்த்து, பின்னர் வளர்சிதை மாற்றத்தை இரு வழிகளில் அளவிடுகிறது. முதல் நாளில், ஆக்சிஜன் நுகர்வு அதிகரிப்பதாக Seahorse பகுப்பாய்வி தெரிவிக்கிறது. நான்காம், ஐந்தாம் நாட்களில், ஆற்றல் செலவினம் குறைவதாக Alamar Blue நுண்கிண்ணத் தட்டு தெரிவிக்கிறது. அதே சாயம், அதே மீன் மரபுவழி, ஆனால் எதிரெதிரான முடிவுகள். பின்னர் ஒரு எளிய கட்டுப்பாடு வெளிச்சம் தருகிறது: மெத்திலீன் நீலமும் Alamar Blue வினைப்பொருளும் மட்டும் இருந்து, மீன்கள் எதுவும் இல்லாத நுண்கிண்ணங்களிலும், வினைப்பொருள் மட்டும் உள்ளவற்றைவிடக் குறைந்த ஒளிர்வு பதிவாகிறது. முடிவின் ஒரு பகுதி உயிரியல் மாற்றம். மற்றொரு பகுதி, சாயம் தனது தேர்வுக்குத் தானே மதிப்பெண் வழங்கியது போன்றது. வளரும் வரிக்குதிரை மீன்களில் மெத்திலீன் நீலம் பற்றிய 2025 Communications Biology ஆய்வில் ஆவணப்படுத்தப்பட்ட இந்தப் பிரிவே, மெத்திலீன் நீலத்தின் அளவீட்டுக் குறுக்கீடு பொதுவாகத் தோன்றும் விதம். இதனால்தான் ஆக்சிஜனேற்ற–ஒடுக்கச் செயல்பாடுள்ள சாயங்களுக்கு, சாதாரண சோதனைச் சேர்மங்களுக்குத் தேவைப்படாத கட்டுப்பாடுகள் தேவைப்படுகின்றன.

ரெசாசுரின் அளவீடு உண்மையில் எதைத் தெரிவிக்கிறது

Alamar Blue என்பது ரெசாசுரின் கரைசலின் வணிகப் பெயர். ஆகவே, மெத்திலீன் நீலம்–Alamar Blue குறுக்கீடும், மெத்திலீன் நீலம்–ரெசாசுரின் அளவீட்டுக் குறுக்கீடும் ஒரே மோதலைக் குறிக்கின்றன. ஆக்சிஜனேற்றமடைந்த ரெசாசுரின் நீல நிறத்தில் இருக்கும்; அதன் ஒளிர்வு மிகக் குறைவு. வளர்சிதை மாற்றத்தில் செயல்படும் செல்கள் அதை இளஞ்சிவப்பு நிறமுள்ள ரெசோருஃபினாக ஒடுக்குகின்றன. இது தூண்டுதல் 560 nm மற்றும் உமிழ்வு 590 nm அருகே வலுவாக ஒளிர்கிறது. உற்பத்தியாளரின் நுண்கிண்ணத் தட்டு செயல்முறை வழிமுறையின்படி, பயன்படுத்தத்தக்க வரம்புகள் தூண்டுதலுக்கு 530 முதல் 570 nm வரையும், உமிழ்வுக்கு 580 முதல் 610 nm வரையும் உள்ளன. ஒடுக்கம் மேலும் தொடர்ந்தால், ரெசோருஃபின் குறைந்த ஒளிர்வுடைய டைஹைட்ரோரெசோருஃபினாக மாறுகிறது. எனவே, நுண்கிண்ணத்தில் மிக அதிக செல்களைச் சேர்ப்பதோ, மிக நீண்ட நேரம் விடுவதோ அளவுத்திருத்த வளைவின் மேல்முனையை கீழ்நோக்கி வளைக்கிறது.

எலக்ட்ரான்கள் பெரும்பாலும் NADH மற்றும் NADPH ஆகியவற்றிலிருந்து, சைட்டோசால், மைக்ரோசோம்கள், மைட்டோகாண்ட்ரியா ஆகியவற்றிலுள்ள செல்லுலார் ரிடக்டேஸ்கள் மற்றும் டையாஃபோரேஸ்கள் வழியாக வருகின்றன. இதனால் இந்த அளவீடு ஒட்டுமொத்த ஒடுக்கும் திறனைக் காட்டுகிறது; உயிருடன் உள்ள செல்களின் எண்ணிக்கையையோ, மைட்டோகாண்ட்ரியாவை மட்டும் சார்ந்த அளவையோ காட்டுவதில்லை. அதிக சமிக்ஞை என்பது அதிக செல்கள், ஒவ்வொரு செல்லிலும் அதிக ஒடுக்கும் வினைப்பாய்வு, அல்லது இரண்டும் சேர்ந்ததைக் குறிக்கலாம். NADH-இன் பாதையை மாற்றும் ஒரு சேர்மம், ஒரு செல்லைக்கூடக் கொல்லாமல் சமிக்ஞையை மாற்றலாம். இந்தக் கருத்தை நினைவில் வைத்திருங்கள்; NADH-இன் பாதையை மாற்றுவது மெத்திலீன் நீலத்தின் இயல்பான செயல்.

இரு குறுக்கீட்டுப் பாதைகள், ஒரே குறைந்த சமிக்ஞை

மெத்திலீன் நீலம் இரு தனித்தனி பாதைகள் வழியாக ரெசாசுரின் அளவீட்டை மாற்றுகிறது. அவற்றில் ஏதேனும் ஒன்று மட்டும் செயல்பட்டாலும், பதிவாகும் ஒளிர்வு குறையும்.

பாதை 1 ஒளியியல் சார்ந்தது. மெத்திலீன் நீலம் சிவப்பு ஒளியை வலுவாக உறிஞ்சுகிறது. அதன் ஒற்றை மூலக்கூறு உறிஞ்சல் பட்டை 660 முதல் 665 nm அருகிலும், இரட்டை மூலக்கூறு இணைப்பின் துணைத் தோள் 607 முதல் 610 nm அருகிலும் உள்ளது. அந்தத் தோளின் வால் பகுதி, சுமார் 590 nm-இல் உள்ள ரெசோருஃபின் உமிழ்வை நோக்கிப் பின்னோக்கி நீள்கிறது. ஒளிப்பாதையில் உள்ள சாயம் தூண்டுதல் ஒளியின் ஒரு பகுதியை உறிஞ்சுவதோடு, உமிழப்படும் ஒளிர்வின் ஒரு பகுதியையும் மீண்டும் உறிஞ்சுகிறது. இந்த உள்-வடிகட்டி விளைவு, ரெசோருஃபின் உற்பத்தி மாறாதபோதும் நுண்கிண்ணத்தின் ஒளிர்வைக் குறைக்கிறது. சாயத்தின் நிலைக்கு ஏற்ப நிறமாலையும் மாறுகிறது: நீர் மற்றும் சைக்ளோடெக்ஸ்ட்ரின் கரைசல்களில் மெத்திலீன் நீல நிறமாலைகளின் காரணிப் பகுப்பாய்வு, ஒற்றை மூலக்கூறு, இரட்டை மூலக்கூறு இணைப்பு, புரவலன்–விருந்தினர் கூட்டமைப்பு ஆகியவற்றை 500 முதல் 700 nm வரையில் வெவ்வேறு ஒளித் தணிப்புக் குணகங்களைக் கொண்ட மூன்று வடிவங்களாகப் பிரித்தறிகிறது. எனவே, ஒளியியல் பிழையின் அளவு செறிவு, திரள்தல், பிணைப்பு ஆகியவற்றுடன் மாறுகிறது. சாதாரண ஒளியியல் தணிப்பையும் மூலக்கூறு ஒளிர்வுத் தணிப்பையும் பரிசோதனையில் வேறுபடுத்த, கீழே விவரிக்கப்படும் சேர்க்கை மீட்புச் சோதனையைப் பயன்படுத்துங்கள்; இவற்றுக்கான திருத்த முறைகள் வேறுபடுகின்றன.

பாதை 2 ஆக்சிஜனேற்ற–ஒடுக்கப் போட்டி சார்ந்தது. ஆக்சிஜனேற்றமடைந்த மெத்திலீன் நீலம் NAD(P)H-இலிருந்து எலக்ட்ரான்களை ஏற்று, நிறமற்ற லியூகோ மெத்திலீன் நீலமாக மாறுகிறது. மூலக்கூறு ஆக்சிஜன் அதை மீண்டும் ஆக்சிஜனேற்றம் செய்து நீல வடிவத்திற்குத் திருப்புகிறது; அதே நேரத்தில் ஹைட்ரஜன் பெராக்சைடு உள்ளிட்ட ஒடுக்கப்பட்ட ஆக்சிஜன் வினைவிளைபொருட்களையும் உருவாக்குகிறது. இந்தச் சுழற்சியின் ஒவ்வொரு சுற்றும், இல்லையெனில் ரெசாசுரினை ஒடுக்கப் பயன்பட்டிருக்கும் ஒடுக்கும் சமமதிப்புகளை நுகர்கிறது. மேலும், ஆக்சிஜனை நுகர்ந்தபடியே துணை விளைவாகப் பெராக்சைடையும் உருவாக்குகிறது. எனவே, குறைந்த Alamar Blue சமிக்ஞை என்பது எலக்ட்ரான்கள் ரெசோருஃபினுக்குள் செல்லாமல் மெத்திலீன் நீலச் சுழற்சி வழியாகச் சென்றதைக் குறிக்கலாம். செல்கள் என்ன செய்திருந்தாலும், தட்டில் அது குறைந்த வளர்சிதை மாற்றமாகப் பதிவாகிறது. இதே வேதியியல், ஆக்சிஜன் அளவீட்டுக் கருவிகளில் எதிர்திசையான ஒரு சிக்கலையும் விளக்குகிறது: ஒடுக்கப்பட்ட சாயத்தை ஆக்சிஜன் மீண்டும் ஆக்சிஜனேற்றம் செய்யும்போது, உயிரியல் செயல்பாடு எதுவும் இல்லாமலேயே வேதியியல் ஆக்சிஜன் நுகர்வு ஏற்படுகிறது. ஆகவே, சுவாச அளவீட்டிலும் சாயம் மட்டும் உள்ள வெற்றுக் கட்டுப்பாடுகள் தேவை. மைட்டோகாண்ட்ரியா தொடர்பான சூழலில் இதை ஆக்சிஜன், ATP மற்றும் சவ்வு மின்னழுத்த அளவீடுகளின் ஒப்பீடு விளக்குகிறது.

மாறிய சமிக்ஞையும் மாறிய உயிரியல் செயல்பாடும் ஒரே நேரத்தில் உண்மையாக இருக்கலாம்

வரிக்குதிரை மீன் ஆய்வின் மதிப்பு, இது ஒன்று அல்லது மற்றொன்று மட்டுமே என்ற எளிய முடிவை ஏற்காததில்தான் உள்ளது. உயிரியல் மாற்றம் உண்மையானது: இரு பராமரிப்புச் செறிவுகளிலும் 1-நாள் வயதுள்ள கருக்களின் அடிப்படை ஆக்சிஜன் நுகர்வு அதிகரித்தது; குறைந்த செறிவில் ATP-உடன் இணைந்த சுவாசம் அதிகரித்தது; JC-10 ஆய்வுக் குறியீட்டால் அளவிடப்பட்ட சவ்வு மின்னழுத்தம் இரண்டாம் நாளில் அதிகரித்தது; மைட்டோகாண்ட்ரியா கூட்டமைப்புகளின் மரபணுப் படியெடுப்புகள் முதல் மற்றும் நான்காம் நாட்களில் குறைந்தன. அளவீட்டுப் பிழையும் உண்மையானது: Alamar Blue படிக்கு முன் மூன்று முறை கழுவப்பட்ட மீன்களின் தலை, வாய், மணமுணரும் பகுதிகளில் இன்னும் கண்ணுக்குத் தெரியும் நீலக் கறை இருந்தது. சாயமும் வினைப்பொருளும் உள்ள, செல்கள் இல்லாத நுண்கிண்ணங்களிலும் ஒளிர்வு சிறிய அளவில், ஆனால் குறிப்பிடத்தக்க வகையில், தானாகவே குறைந்தது. நான்காம் மற்றும் ஐந்தாம் நாட்களில் உயிரினங்களில் காணப்பட்ட Alamar Blue குறைவுகள், செல்கள் இல்லாத சூழலின் விளைவைவிடப் பெரியதாக இருந்தன. எனவே, சிறிது திரிந்த கண்ணாடி வழியே காணப்பட்ட உண்மையான வளர்சிதை மாற்றம் என ஆசிரியர்கள் முடிவை விளக்கினர். இதுவே சரியான புரிதல். நீல ஒளி உறிஞ்சியாகவும் செயல்படும் ஓர் ஆக்சிஜனேற்ற–ஒடுக்கச் சுழற்சிச் சேர்மம், பொதுவாக ஆய்வு செய்யப்படும் பாதையையும் அளவீட்டுக் குறியீட்டின் வேதியியலையும் ஒரே நேரத்தில் மாற்றும். ஒவ்வொன்றின் பங்களிப்பையும் அளவிடுவதுதான் கட்டுப்பாடுகளின் வேலை; அவற்றில் ஒன்றை இல்லாததாக அறிவிப்பது அல்ல. சைக்ளோடெக்ஸ்ட்ரின் பிணைப்பு ஆய்விலிருந்தும் தொடர்புடைய பாடம் கிடைக்கிறது: ஒரு புரவலன் மூலக்கூறு சாயத்தைப் பிணைத்துத் தனிமைப்படுத்தியபோது, நிறமேற்றமும் குளுக்கோஸ் உட்கொள்ளல் தூண்டுதலும் ஒன்றாகக் குறைந்தன. இதனால், வளர்சிதை மாற்ற விளைவுக்கு நேரடி சாயத் தொடர்பு தேவைப்பட்டது; பரவலான ஆக்சிஜனேற்ற–ஒடுக்க இடையூறு மட்டும் போதவில்லை என்பது சுட்டப்பட்டது. சாயத்தின் இயற்பியல் அளவீட்டை ஒரு செயல்பாட்டு அளவீட்டுடன் தொடர்புபடுத்துவதுதான், செயல்முறையை அளவீட்டுப் பிழையிலிருந்து பிரிக்கும் வழி. சாயம் சார்ந்த வளர்சிதை மாற்றக் கூற்றுகளைப் புரிந்துகொள்வதற்கான வழிகாட்டி, இந்தப் பழக்கத்தை மேலும் விரிவாக்குகிறது.

அவற்றைப் பிரித்தறியும் கட்டுப்பாடுகள்

ரெசாசுரின் தட்டிலிருந்து கிடைக்கும் எந்த மெத்திலீன் நீல முடிவையும் விளக்குவதற்கு முன் இவற்றைச் செய்யுங்கள். செறிவுகள், ஊடகம், அடைகாக்கும் நேரம், ஒளியூட்டம் ஆகியவை செல்கள் உள்ள பரிசோதனையுடன் துல்லியமாகப் பொருந்த வேண்டும்; ஏனெனில் மேலே கூறிய ஒவ்வொரு பாதையும் இவற்றைச் சார்ந்துள்ளது.

பெரும்பாலான ஆய்வுக் கட்டுரைகள் தவிர்க்கும், ஆனால் பெரும்பாலான மெத்திலீன் நீல ஆய்வுக் கட்டுரைகளுக்குத் தேவைப்படும் இணை கட்டுப்பாடுகள் 3 மற்றும் 4 ஆகும். கட்டுப்பாடு 3 வேதியியலைக் கண்டறிகிறது; கட்டுப்பாடு 4 ஒளியியலைக் கண்டறிகிறது. இரண்டும் சேர்ந்து, எந்த உயிரியல் கூற்றும் முன்வைக்கப்படுவதற்கு முன் அளவீட்டுப் பிழையின் வரம்பை நிர்ணயிக்கின்றன.

வேறு கொள்கை சார்ந்த அளவீடுகள்: ஒவ்வொன்றுக்கும் தனித்த வரம்புகள்

ஒரே ஒரு இரண்டாவது அளவீடு, முதலாவது அளவீட்டை உறுதிப்படுத்திவிடாது. வேறு கொள்கை சார்ந்த ஒவ்வொரு அளவீடும் ஒரு குறுக்கீட்டுப் பாதையிலிருந்து தப்பினாலும், மற்றொன்றுக்கு உட்பட்டே இருக்கும். எனவே, ஒன்றின் கண்மறைப் பகுதிகள் மற்றொன்றுடன் ஒத்துப்போகாத இணையைத் தேர்ந்தெடுங்கள். ஆக்சிஜனேற்ற–ஒடுக்கச் செயல்பாடுள்ள சேர்மங்களுக்கான அளவீட்டுத் தேர்வு அணி இந்த இணைத்தேர்வு முறையை விளக்குகிறது. சவ்வு மின்னழுத்த ஆய்வுக் குறியீட்டு வழிகாட்டி, ஒளிர்வு தொடர்பான எச்சரிக்கைகளை விரிவாக எடுத்துரைக்கிறது.

Seahorse ஆக்சிஜன் நுகர்வு அளவீடு, எலக்ட்ரான்கள் ரெசோருஃபினுக்குள் செல்வதற்குப் பதிலாக ஆக்சிஜனை அடைவதைப் பின்தொடர்கிறது. இதனால் அளவீட்டுக் குறியீட்டின் வேதியியலை முழுமையாகத் தவிர்க்கிறது. ஆனால் சாயமும் வேதியியல் வழியாக ஆக்சிஜனை நுகர்வதால், முழுமையான ஊடகத்தில் மைட்டோகாண்ட்ரியா இல்லாத சாய வெற்றுக் கட்டுப்பாடுகள் கட்டாயம். ATP லூசிஃபெரேஸ் அளவீடுகள் ரெசோருஃபின் ஒளிர்வுக்குப் பதிலாக உயிரொளிர்வைப் பயன்படுத்துகின்றன. இதனால் ஒளியியல் ஒன்றுடன் ஒன்று படிதலையும் ரிடக்டேஸ் போட்டியையும் தவிர்க்கின்றன; ஆனால் உற்பத்தி வினைப்பாய்வுக்குப் பதிலாக ATP இருப்பின் சமநிலையைத்தான் தெரிவிக்கின்றன. TMRM அல்லது JC-10 போன்ற சவ்வு மின்னழுத்த ஆய்வுக் குறியீடுகள் மின்னூட்டச் சரிவு நிலைத்திருக்கிறதா என்பதைத் தெரிவிக்கின்றன. எனினும், சாயம் உறிஞ்சும் அதே காட்சியொளி வரம்பில்தான் அவையும் ஒளிர்கின்றன. எனவே, மீதமுள்ள நீலக் கறை அவற்றையும் சிக்கலாக்குகிறது; ஒவ்வொரு சாய அளவிலும் சாயம் மட்டும் உள்ள வெற்றுக் கட்டுப்பாடுகள் தேவை. சுவாசக் கூட்டமைப்புகளின் துணையலகுகளுக்கான மரபணுப் படியெடுப்பு அளவீடுகள் ஒளியியலை முற்றிலும் தவிர்த்து, பல மணி நேர மாற்றங்களை ஒருங்கிணைக்கின்றன. இதனால் நிமிட அளவிலான தட்டு அளவீடுகளுக்கு அவை துணையாகின்றன.

எனவே, மெத்திலீன் நீலத்தின் வளர்சிதை மாற்ற விளைவு பற்றிய நம்பத்தகுந்த கூற்றுக்குத் தேவையான குறைந்தபட்சத் தொகுப்பு இதுதான்: கட்டுப்பாடுகள் 1 முதல் 4 வரை கொண்ட ஒரு ரெசாசுரின் முடிவு; வேறொரு இயற்பியல் கொள்கையைச் சார்ந்த, ரெசாசுரின் அல்லாத ஓர் இறுதி அளவீடு; மேலும், மாற்றம் செல்களின் எண்ணிக்கையையா, ஒவ்வொரு செல்லின் ஒடுக்கும் வினைப்பாய்வையா, அல்லது இரண்டையுமா பிரதிபலிக்கிறது என்ற தெளிவான விளக்கம். இதைவிடக் குறைவான தகவல் இருந்தால், குறைந்த வளர்சிதை மாற்றத்தையும் குறைந்த ஒளிர்வுள்ள நுண்கிண்ணத்தையும் வாசகரால் வேறுபடுத்த முடியாது.

குறுக்கீட்டுக் கட்டுப்பாட்டுப் பணித்தாள்

சாயத்தை ஓர் ஆக்சிஜனேற்ற–ஒடுக்க அளவீட்டுக் குறியீட்டுடன் இணைக்கும் ஒவ்வொரு பரிசோதனைக்கும் இந்தப் பணித்தாளை ஆய்வகக் குறிப்பேட்டில் நகலெடுக்கவும். இது இந்தக் கட்டுரைக்காக உருவாக்கப்பட்ட அசல் வளம்: ஒவ்வொரு சாயச் செறிவிற்கும் ஒரு வரிசையை நிரப்பவும்.

A. சமிக்ஞைப் பாதைகள். ஒவ்வொரு செறிவிற்கும் இவற்றைப் பதிவு செய்யவும்: எதிர்பார்க்கப்படும் ஒற்றை மூலக்கூறு அல்லது இரட்டை மூலக்கூறு இணைப்பு நிலை (குறைந்த மைக்ரோமோலார் அளவு அல்லது பத்துக்கணக்கான மைக்ரோமோலார் மற்றும் அதற்கு மேல்), செல்கள் இல்லாத நுண்கிண்ணத்தில் இறுதிக் கலவையின் 590 nm உறிஞ்சல், மற்றும் சேர்க்கப்பட்ட ரெசோருஃபின் மீட்பு சதவீதம். மீட்பு சுமார் 90 சதவீதத்திற்குக் கீழே குறைந்தால், அந்தச் சாய அளவிலுள்ள அனைத்து ஒளிர்வு மதிப்புகளையும் ஒளியியல் காரணத்தால் குறைந்த மதிப்புகளாகக் கருதுங்கள்; உயிரியல் ரீதியாகத் துல்லியமான மதிப்புகளாகக் கருத வேண்டாம்.

B. வேதியியல் சரிபார்ப்பு. ஒவ்வொரு அளவீட்டு நேரத்திலும், செல்கள் இல்லாத சாயம்–வினைப்பொருள் கலவையின் ஒளிர்வை, வினைப்பொருள் மட்டும் உள்ள அடிப்படை அளவின் சதவீதமாகப் பதிவு செய்யவும். நேரம் செல்லச் செல்ல விலகல் அதிகரித்தால், அளவீட்டின்போது சாயம் அளவீட்டுக் குறியீட்டு அமைப்புடன் வினைபுரிகிறது. அப்போது இறுதிநேர அளவீடுகள் மட்டும் தவறாக வழிநடத்தும். காலப்போக்கு அளவீடுகள் அல்லது வேறொரு அளவீட்டுக் குறியீட்டைப் பரிசீலிக்கவும்.

C. உயிரியல் குறுக்குச் சரிபார்ப்பு. இந்தப் பரிசோதனைக்குத் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட வேறு கொள்கை சார்ந்த அளவீடு, அதற்குரிய சாய வெற்றுக் கட்டுப்பாடு, ரெசாசுரின் முடிவு உண்மையானதாக இருந்தால் எதிர்பார்க்கப்படும் விளைவு ஆகியவற்றைக் குறிப்பிடவும். உண்மையான வளர்சிதை மாற்றக் குறைவு, ஒரு சுயாதீன இறுதி அளவீட்டையும் அதற்கு ஒத்த திசையில் மாற்ற வேண்டும். வேறு கொள்கை சார்ந்த இறுதி அளவீடு முரண்பட்டால், இப்போதைக்கு எந்த முடிவையும் நம்ப வேண்டாம். இரண்டின் சராசரியை எடுப்பதற்குப் பதிலாகப் பரிசோதனையை மறுவடிவமைக்கவும்.

D. முடிவு வாக்கியம். இந்த வடிவில் ஒரு வாக்கியத்தை எழுதவும்: குறிப்பிடப்பட்ட சாய அளவிலும் நிலையிலும், ரெசாசுரின் சமிக்ஞை குறிப்பிடப்பட்ட அளவுக்கு மாறியது; அதில் குறிப்பிடப்பட்ட அளவு செல்கள் இல்லாத சூழலின் அளவீட்டுப் பிழை; வேறு கொள்கை சார்ந்த இறுதி அளவீடு (ஒத்துப்போகிறது அல்லது முரண்படுகிறது). ஏதேனும் ஒரு பதிவு காலியாக இருந்தால், பரிசோதனை இன்னும் முடிவடையவில்லை.

மெத்திலீன் நீலம் தொடர்ந்து ஒரு பயனுள்ள வளர்சிதை மாற்ற ஆய்வுக் கருவியாக உள்ளது. பல ஆய்வகங்கள் தினமும் வடிகாலில் ஊற்றும் அளவுகளில் உண்மையான மைட்டோகாண்ட்ரியா விளைவுகள் இருப்பதை வரிக்குதிரை மீன் ஆய்வு காட்டுகிறது. இந்தச் சாயம், தன்னால் பாதிக்க முடியாத கருவிகளால் அளவிடப்பட வேண்டும் என்பதைத்தான் வலியுறுத்துகிறது. சாயம் மட்டும் உள்ள நுண்கிண்ணங்கள், ஒரு சேர்க்கை மீட்புச் சோதனை, வேறொரு இயற்பியல் கொள்கையைச் சார்ந்த ஓர் அளவீடு ஆகியவற்றை வழங்குங்கள். அப்போது குறுக்கீடு ஒரு மறைமுகச் சிக்கலாக இருப்பதை நிறுத்தி, எண்ணால் குறிப்பிடக்கூடிய அளவாக மாறுகிறது.