மெத்திலீன் நீல எளிய சாயமேற்றலும் கிராம் சாயமேற்றலும்: ஒவ்வொரு முறையும் எதை நிரூபிக்க முடியும்

E. coli என்று குறிக்கப்பட்ட வளர்ப்பிலிருந்து ஒரு மாணவர் ஒரு தடவலைத் தயாரித்து, அதை மெத்திலீன் நீலத்தால் ஒரு நிமிடம் முழுமையாக மூடி, கழுவி, எண்ணெய் மூழ்கல் லென்ஸ் வழியாகப் பார்க்கிறார். பார்வைப் புலம் முழுவதும் நீல நிறக் கோல்கள் காணப்படுகின்றன. ஆய்வக அறிக்கை இவ்வாறு கூறுகிறது: "கிராம்-எதிர்மறைக் கோல்கள் E. coli என அடையாளம் காணப்பட்டன." கண்டறிந்த தோற்றம் சரியானது. ஆனால் அந்த நுண்ணோக்கித் தகடு இந்த முடிவை ஆதரிக்கவில்லை.

பிழை கருத்தியல் சார்ந்தது; தொழில்நுட்பம் சார்ந்ததல்ல. மாணவர் எளிய சாயமேற்றலை ஒரு வேறுபடுத்தும் சோதனையாகக் கருதியுள்ளார். எளிய சாயமேற்றலும் கிராம் சாயமேற்றலும் வெவ்வேறு சாயமேற்றல் கருத்துகளை அடிப்படையாகக் கொண்டிருப்பதால், அவை வெவ்வேறு கேள்விகளுக்குப் பதிலளிக்கின்றன. ஒன்று கேட்பது: எந்த வடிவம் உள்ளது. மற்றொன்று கேட்பது: சோதனைக்கு உட்படுத்தும்போது செல் சுவர் எவ்வாறு நடந்துகொள்கிறது. இரண்டையும் குழப்பினால், சரியாகச் சாயமேற்றப்பட்ட தகடிலிருந்தும் ஆதாரமற்ற அறிக்கை உருவாகும்.

இந்த ஒப்பீடு இரு முறைகளையும் தனித்தனியாக விளக்குகிறது; ஒவ்வொரு முடிவின் அடிப்படையிலும் எதைக் கூறலாம் என்பதைக் காட்டுகிறது. மேலும், மாணவர்கள் அதிகம் கேட்கும் இரண்டு கேள்விகளுக்கும் பதிலளிக்கிறது: கிராம் சாயமேற்றலில் மெத்திலீன் நீலத்தைப் பயன்படுத்தலாமா, E. coli-க்கு மெத்திலீன் நீலச் சாயமேற்றல் உண்மையில் எதைக் காட்டுகிறது.

சுருக்கமான பதில்

மெத்திலீன் நீல எளிய சாயமேற்றல், சாயத்தை ஏற்கும் ஒவ்வொரு செல்லையும் ஒரே நீல நிறமாக மாற்றுகிறது. எனவே, அது உருவவியலையும் (கோல்கள், கோளங்கள், சுருள்கள்) அமைவையும் (தனித்தனி, இணைகள், சங்கிலிகள்) வெளிப்படுத்துகிறது; கிராம் வகையைப் பற்றி எதையும் தெரிவிப்பதில்லை. கிராம் சாயமேற்றல் அயோடின், சாயநீக்கும் படிநிலை, எதிர்ச் சாயம் ஆகியவற்றைச் சேர்க்கிறது. இதனால், பாக்டீரியாக்களின் செல் உறைகள் சாயத்தை எவ்வாறு தக்கவைக்கின்றன என்பதன் அடிப்படையில் அவற்றைக் கிராம்-நேர்மறை (ஊதா) மற்றும் கிராம்-எதிர்மறை (இளஞ்சிவப்பு அல்லது சிவப்பு) எனப் பிரிக்கிறது. மெத்திலீன் நீலச் சாயமேற்றலுக்குப் பின் நீலக் கோல்கள் காணப்படுவது, "கோல் வடிவச் செல்கள் உள்ளன" என்பதைக் குறிக்கிறது. முழுமையான கிராம் சாயமேற்றல் வரிசைக்குப் பின் இளஞ்சிவப்புக் கோல்கள் காணப்படுவது, "கிராம்-எதிர்மறைக் கோல்கள் உள்ளன" என்பதைக் குறிக்கிறது. செயல்முறை ஒரு கூடுதல் சோதனையைச் செய்திருப்பதால், இரண்டாவது கூற்றுக்கு அதிக ஆதாரம் உள்ளது.

இந்தக் கட்டுரை சார்ந்துள்ள ஒற்றைச் சாய பாக்டீரியா முறைகளின் விரிவான தொகுப்புக்கு, நுண்ணோக்கிச் சாயமேற்றல் படத்தொகுப்பைப் பார்க்கவும்.

எளிய சாயமேற்றல்: ஒரு சாயம், ஒரு கேள்வி

மெத்திலீன் நீலம் ஒரு காரத்தன்மை கொண்ட (நேர்மின் அயனி) சாயம். அதன் நிறமுடைய அயனி நேர்மின்னூட்டத்தைக் கொண்டுள்ளது. அது நியூக்ளிக் அமிலங்கள் மற்றும் அமிலத்தன்மை கொண்ட மேற்பரப்புக் குழுக்கள் உள்ளிட்ட, செல்லில் உள்ள எதிர்மின்னூட்டம் கொண்ட கட்டமைப்புகளுடன் பிணைகிறது. இதனால் வெளிர் பின்னணியில் செல்கள் நீலமாகத் தோன்றுகின்றன. OpenStax தனது சாயமேற்றல் அத்தியாயத்தில் இந்த நேரடிச் சாயமேற்றல் கொள்கையை விளக்குகிறது. சாயத்தின் நேர்மின் அயனியே, மெத்திலீன் நீல வேதியியல் குறிப்பில் விவரிக்கப்பட்டுள்ள சிறிய, தட்டையான ஃபீனோதையசின் அயனியாகும்; குளோரைடு எதிர் அயனி நிறத்தை அளிப்பதில்லை.

வழக்கமான கற்பித்தல் செயல்முறை திட்டமிட்டே எளிமையாக அமைக்கப்பட்டுள்ளது: மெல்லிய தடவலை உருவாக்கி, காற்றில் உலர்த்தி, வெப்பத்தால் நிலைநிறுத்தி, சுமார் 1% நீர்க்கரைசல் மெத்திலீன் நீலத்தால் ஏறத்தாழ ஒரு நிமிடம் முழுமையாக மூடி, தண்ணீரால் மெதுவாகக் கழுவி, ஒற்றியெடுத்து உலர்த்தி, எண்ணெய் மூழ்கல் முறையில் ஆய்வு செய்ய வேண்டும். LibreTexts கற்பித்தல் செயல்முறை இதே 1%, ஒரு நிமிட முறையை வழங்குகிறது; சில ஆய்வகங்கள் நேரத்தை நீட்டிப்பதாகவும் குறிப்பிடுகிறது. சாயநிலைநிறுத்தி இல்லை, சாயநீக்கி இல்லை, இரண்டாவது சாயம் இல்லை. இந்த இல்லாமையே முக்கியமானது. ஒரே சாயம் மட்டுமே பயன்படுத்தப்பட்டு, தேர்ந்தெடுத்துச் சாயத்தை நீக்கும் படிநிலை இல்லாததால், சாயத்துடன் பிணையும் ஒவ்வொரு செல்லும் இறுதியில் ஒரே நிறத்தைப் பெறுகிறது.

E. coli இருந்தால், எதிர்பார்க்கப்படும் பார்வைப் புலத்தில் நீலக் கோல்கள் (பாசில்லிகள்) தனித்தனியாகவோ, இணைகளாகவோ, சிறிய குழுக்களாகவோ காணப்படும். நீல நிறம் சாயத்திலிருந்து வருகிறது. கோல் வடிவம் நுண்ணுயிரின் இயல்பிலிருந்து வருகிறது. ஆனால் இந்தச் சேர்க்கை நுண்ணுயிரை அடையாளம் காண்பதில்லை; ஏனெனில் பல இனங்கள் கோல் வடிவத்தில் உள்ளன, மேலும் பல கோல் வடிவச் செல்கள் எளிய சாயமேற்றலில் நீலமாகின்றன. ATCC தனது நுண்ணுயிரியல் வளர்ப்பு வழிகாட்டியில் உருவவியலுக்கு மட்டுமே உட்பட்ட இந்த வரம்பைத் தெளிவாகக் குறிப்பிடுகிறது. சரியான அறிக்கை இவ்வாறு இருக்கும்: "நீல பாசில்லிகள் காணப்பட்டன." வடிவம் மற்றும் அமைவுக்கு அப்பாற்பட்ட எந்தக் கூற்றுக்கும் கூடுதல் ஆதாரம் தேவை.

கிராம் சாயமேற்றல்: நான்கு வினைப்பொருட்கள், ஒரு நடத்தைச் சோதனை

கிராம் சாயமேற்றல் ஒரு வேறுபடுத்தும் சாயமேற்றல் முறை. இது அனைத்து செல்களையும் ஒரே படிநிலை வரிசைக்கு உட்படுத்தி, எந்தச் செல்கள் முதல் சாயத்தைத் தக்கவைக்கின்றன, எந்தச் செல்கள் அதை இழக்கின்றன என்பதைக் கவனிக்கிறது. American Society for Microbiology-யின் கிராம் சாயமேற்றல் செயல்முறைகள் வழக்கமான நான்கு படிநிலை வரிசையை வரையறுக்கின்றன: கிரிஸ்டல் வயலெட் (முதன்மைச் சாயம்), கிராம் அயோடின் (சாயநிலைநிறுத்தி), ஆல்கஹால் அல்லது அசிட்டோன்-ஆல்கஹால் (சாயநீக்கி), பின்னர் சாஃப்ரனின் (எதிர்ச் சாயம்).

வழக்கமான கற்பித்தல் விளக்கம், செல் உறையின் கட்டமைப்பு மூலம் இந்த வேறுபாட்டை விளக்குகிறது. கிராம்-நேர்மறைச் செல்களில் தடிமனான பெப்டிடோகிளைக்கான் சுவர் உள்ளது. ஆல்கஹாலால் கழுவும்போது அது நீரை இழந்து, கிரிஸ்டல் வயலெட்–அயோடின் கூட்டுச்சேர்மத்தைத் தக்கவைக்கிறது. கிராம்-எதிர்மறைச் செல்களில் மெல்லிய பெப்டிடோகிளைக்கான் அடுக்கும், கொழுப்புகள் நிறைந்த வெளிச்சவ்வும் உள்ளன. சாயநீக்கி அந்த வெளிச்சவ்வைச் சீர்குலைப்பதால், கூட்டுச்சேர்மம் கழுவி நீக்கப்படுகிறது; பின்னர் செல்கள் சாஃப்ரனினை ஏற்கின்றன. NCBI Bookshelf-இன் கிராம் சாயமேற்றல் மதிப்பாய்வு இந்தச் செல் சுவர் விளக்கத்தை வழங்குகிறது. முழுமையான இயற்பியல் வேதியியல், சுவரின் தடிமனை மட்டும் சார்ந்ததைவிடச் சிக்கலானது என்று நிபுணர்கள் மேலும் குறிப்பிடுகின்றனர். இருந்தாலும், ஆய்வக முடிவை விளக்குவதற்கு நடத்தை அடிப்படையிலான விதி பொருந்துகிறது: ஊதா என்பது சாயம் தக்கவைக்கப்பட்டதைக் குறிக்கும்; இளஞ்சிவப்பு என்பது சாயம் இழக்கப்பட்டு, பின்னர் எதிர்ச் சாயம் ஏற்றப்பட்டதைக் குறிக்கும்.

விளக்கப் படங்கள். முறைகளை ஒப்பிடுவதற்கான பாணிப்படுத்தப்பட்ட வரைபடங்கள்; கேமராவால் எடுக்கப்பட்ட நுண்ணோக்கிப் புகைப்படங்கள் அல்ல. செயல்முறையின் தர்க்கத்தைக் கற்பிக்க நிறங்கள் எளிமைப்படுத்தப்பட்டுள்ளன: எளிய சாயமேற்றலில் ஒரு நிறம்; கிராம் சாயநீக்கத்திற்குப் பின் இரண்டு நிறங்கள்.

கிராம் சாயமேற்றலில் மெத்திலீன் நீலத்தைப் பயன்படுத்தலாமா

இந்தக் கேள்வியை இரண்டு விதமாகப் புரிந்துகொள்ளலாம்; அவற்றுக்கு வெவ்வேறு பதில்கள் தேவை.

முதல் பொருள்: மெத்திலீன் நீலத்தை ஒருமுறை முழுமையாகப் பூசுவது, முழு கிராம் சாயமேற்றல் வரிசைக்கு மாற்றாக அமையுமா. இல்லை. அயோடின், சாயநீக்கி, எதிர்ச் சாயம் ஆகியவை இல்லாமல் வேறுபடுத்தும் படிநிலை இல்லை; எனவே கிராம் வகை சோதிக்கப்படுவதில்லை. மெத்திலீன் நீலம் மட்டுமே பயன்படுத்திய பின் கிடைக்கும் நீலப் புலம், அதன் பாட்டில் கிராம் வினைப்பொருட்களுக்கு அருகில் இருந்தாலும், எளிய சாயமேற்றலின் முடிவுதான். அதை கிராம் முடிவாகப் பதிவு செய்ய வேண்டாம்.

இரண்டாவது பொருள்: படிநிலை 4-இல் எதிர்ச் சாயமாகப் பயன்படுத்தப்படும் சாஃப்ரனினுக்கு மாற்றாக மெத்திலீன் நீலத்தைப் பயன்படுத்தலாமா. செயல்பாட்டு அடிப்படையில், அது சாயம் நீக்கப்பட்ட செல்களுக்கு நிறமூட்ட முடியும். இவ்வாறு மாற்றினால், கிராம்-நேர்மறைச் செல்கள் ஊதாவாகவும், கிராம்-எதிர்மறைச் செல்கள் நீலமாகவும் இருக்கும் என்று பாடநூல் பயிற்சி கணிக்கிறது. சரியாகச் சாயம் நீக்கப்பட்ட கிராம்-எதிர்மறைச் செல்கள் ஏறத்தாழ நிறமற்றவையாக இருப்பதால், மற்றொரு நேர்மின் அயனிச் சாயத்தை ஏற்கும் என்பதே இந்தச் சரியான தர்க்கம். ஆனால் இது வழக்கமான செயல்முறை அல்ல. ASM செயல்முறைகள் சாஃப்ரனினைக் குறிப்பிடுகின்றன; சில மாற்று முறைகளில் காரத்தன்மை கொண்ட ஃபுக்சின் போன்ற ஏற்றுக்கொள்ளப்பட்ட மாற்றுகள் குறிப்பிடப்படுகின்றன, மெத்திலீன் நீலம் அல்ல. இதற்கு ஒரு நடைமுறைச் சிக்கலும் உள்ளது: ஊதாவிலிருந்து இளஞ்சிவப்பை வேறுபடுத்துவதைவிட, ஊதாவிலிருந்து நீலத்தை வேறுபடுத்துவது கடினம். குறிப்பாகத் தொடக்கநிலை மாணவர்களுக்கும், ஒளித்திறன் குறைந்த நுண்ணோக்கி விளக்குகளின் கீழும் இது சிரமமாகும். பாடப்பயிற்சிக்கும், முக்கியத்துவம் வாய்ந்த எந்த முடிவுக்கும், உங்கள் செயல்முறை குறிப்பிடும் எதிர்ச் சாயத்தைப் பயன்படுத்துங்கள்; அது பொதுவாக சாஃப்ரனினாக இருக்கும். மெத்திலீன் நீல எதிர்ச் சாயத்தை இணையான வழக்கமான முறையாக அல்லாமல், செயல்விளக்கத்திற்கான மாற்று முறையாகக் கருதுங்கள்.

மற்ற ஒற்றைச் சாயத் தேர்வுகளுடன் மெத்திலீன் நீலம் எவ்வாறு ஒப்பிடப்படுகிறது என்ற தொடர்புடைய கேள்வி, எளிய பாக்டீரியா சாயமேற்றல்களின் ஒப்பீட்டில் விவாதிக்கப்படுகிறது.

E. coli-க்கு மெத்திலீன் நீலச் சாயமேற்றல் எதை நிரூபிக்கிறது, எதை நிரூபிப்பதில்லை

E. coli ஒரு கிராம்-எதிர்மறைக் கோல் வடிவ பாக்டீரியா. ஆனால் இந்த வாக்கியம் பல முறைகளிலிருந்து கிடைத்த உண்மைகளை இணைக்கிறது: நுண்ணோக்கி ஆய்விலிருந்து உருவவியல், கிராம் சாயமேற்றலிலிருந்து கிராம் வினை, வளர்ப்புடன் உயிர்வேதியியல் அல்லது மூலக்கூறு சோதனைகளிலிருந்து அடையாளம். மெத்திலீன் நீலத் தடவல் முதல் பகுதியை மட்டுமே வழங்குகிறது. சாயமேற்றப்பட்ட மாதிரியில் கோல் வடிவச் செல்கள் உள்ளன என்பதையும், அவை எவ்வாறு அமைந்துள்ளன என்பதையும் அது உறுதிப்படுத்துகிறது. சாயநீக்கச் சோதனை நடத்தப்படாததால், அது கிராம் வினையை உறுதிப்படுத்துவதில்லை. இந்தப் பிரிதிறனில் பல இனங்களின் கோல் வடிவச் செல்கள் ஒரே மாதிரியாகத் தோன்றுவதால், அது இனத்தையும் அடையாளம் காண்பதில்லை.

இங்குதான் அறிக்கைகள் எதிர்பார்க்கக்கூடிய விதத்தில் தவறுகின்றன. அறிக்கை எழுதுபவர் பின்னணி அறிவை ("இந்த வளர்ப்பு E. coli ஆக இருக்க வேண்டும்; E. coli கிராம்-எதிர்மறையானது") கண்டறிந்தவற்றைப் பதிவு செய்யும் வரியில் சேர்த்துவிடுகிறார். இதனால் உண்மையில் ஊகிக்கப்பட்ட ஒன்றைத் தகடு உறுதிப்படுத்தியது போலத் தோன்றுகிறது. தெளிவான அறிக்கை இந்த அடுக்குகளைப் பிரிக்கிறது: "மெத்திலீன் நீல எளிய சாயமேற்றல்: நீல பாசில்லிகள் காணப்பட்டன; உருவவியல் மட்டுமே, கிராம் வகை சோதிக்கப்படவில்லை." பின்னர், கட்டுப்பாட்டு மாதிரிகளுடன் கிராம் சாயமேற்றல் சரியாகச் செய்யப்பட்டிருந்தால்: "கிராம் சாயமேற்றல்: இளஞ்சிவப்புக் கோல்கள், கிராம்-எதிர்மறைக்கு ஒத்துள்ளன." இன அடையாளம் பின்னர் அடையாளம் காணும் செயல்முறையிலிருந்து கிடைக்கிறது; நிறத்திலிருந்து மட்டும் அல்ல.

முடிவை விளக்குவதற்கான நடைமுறை வழிகாட்டி

ஆய்வகப் பணியிடத்தில் இந்த முடிவெடுக்கும் விதியைப் பயன்படுத்துங்கள். அனைத்துச் செல்களும் ஒரே நிறத்தில் இருந்து, செயல்முறையில் சாயநீக்கி இல்லாமல் ஒரே சாயம் பயன்படுத்தப்பட்டிருந்தால், நீங்கள் செய்தது எளிய சாயமேற்றல். வடிவம், அளவின் மதிப்பீடு, அமைவு ஆகியவற்றைப் பதிவு செய்யுங்கள். அதோடு நிறுத்துங்கள். அறியப்பட்ட நேர்மறை மற்றும் எதிர்மறைக் கட்டுப்பாட்டு மாதிரிகளுடன் கிரிஸ்டல் வயலெட், அயோடின், சாயநீக்கி, எதிர்ச் சாயம் ஆகியவற்றைச் செயல்முறை பயன்படுத்தியிருந்தால், நீங்கள் செய்தது கிராம் சாயமேற்றல். நிறத்துடன் உருவவியலையும் பதிவு செய்யுங்கள்: சங்கிலிகளாக அமைந்த ஊதா கோளச் செல்கள், இளஞ்சிவப்புக் கோல்கள் போன்றவை.

பெரும்பாலான குழப்பங்களுக்கு மூன்று பிழைகளே காரணமாகின்றன. முதலாவது, நீலக் கோல்களை E. coli உறுதிப்படுத்தலாக மிகைப்படுத்தி விளக்குவது. இரண்டாவது, மெத்திலீன் நீலத் தகட்டை குறிப்பேட்டில் "கிராம் சாயமேற்றல்" என்ற தலைப்பின் கீழ் பதிவு செய்வது; பின்னர் படிப்பவர்கள் அதைத் தவறாகப் புரிந்துகொள்வார்கள். மூன்றாவது, எதிர்ச் சாயங்களைத் தன்னிச்சையாக மாற்றிவிட்டு, நிறத் தொகுப்புகள் ஒரே மாதிரியாக இருப்பதுபோல் ஆய்வகங்களுக்கு இடையே நிறங்களை ஒப்பிடுவது. ஒவ்வொரு பிழைக்கும் ஒரே தீர்வுதான்: உண்மையில் செய்யப்பட்ட முறையின் பெயரைக் குறிப்பிடுங்கள்; அந்த முறை சோதிப்பதை மட்டுமே கூறுங்கள்.

எளிய சாயமேற்றல் குறைந்த அளவிலேயே முடிவுகளை வழங்குவதால்தான் அதற்குரிய இடத்தைப் பெறுகிறது. அது வேகமானது, சிறிய நடைமுறை வேறுபாடுகளையும் தாங்கக்கூடியது; கேள்வி உருவவியலைப் பற்றியதாக இருக்கும்போது போதுமானது: ஏதேனும் உள்ளதா, அதன் வடிவம் என்ன. கேள்வி வகைப்படுத்தலைப் பற்றியதாக இருந்தால், வேறுபடுத்தும் சோதனையைச் செய்யுங்கள். நீலத் தகடு செல்கள் எப்படித் தோன்றுகின்றன என்பதைக் காட்டுகிறது. ஊதா அல்லது இளஞ்சிவப்புத் தகடு அவற்றின் சுவர்கள் எவ்வாறு நடந்துகொள்கின்றன என்பதைக் காட்டுகிறது. எந்தத் தகடும் தனியாக இனத்தைத் தெரிவிப்பதில்லை.