மெத்திலீன் ப்ளூவின் மைட்டோகாண்ட்ரிய விளைவுகளை அளவிடுதல்: ஆக்சிஜன், ATP மற்றும் சவ்வு மின்னழுத்தம்

சுவாசச் செயல்பாடு பாதிக்கப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியாக்களில் ஓர் ஆய்வகம் மெத்திலீன் ப்ளூவைச் சேர்த்து, ஆக்சிஜன் நுகர்வு அதிகரிப்பதைக் கவனிக்கிறது என்று வைத்துக்கொள்வோம். அந்தச் சாயம் மைட்டோகாண்ட்ரியச் செயல்பாட்டை மீட்டெடுத்தது என்று எழுதத் தோன்றுவது இயல்பு. ஆனால் அந்த வாக்கியம் தவறாக இருக்கலாம். ஆக்சிஜன் பாய்வு, ATP உருவாக்கம் மற்றும் சவ்வு மின்னழுத்தம் ஆகியவை மூன்று தனித்துவமான கருத்துகள். காப்புப்பிரதி, ஒத்திசைவு மற்றும் பகிர்வு ஆகியவை ஒரே மேகக் கோப்புறையைப் பயன்படுத்துவதுபோல, இவையும் ஒரே செல் நுண்ணுறுப்பில் நிகழ்கின்றன: தொடர்புடையவை என்றாலும், வெவ்வேறு விதிகளால் இயங்குகின்றன. ஒன்றை மற்றொன்றாகக் குழப்பினால், ஒவ்வொரு அளவீடும் தொழில்நுட்ப ரீதியாகச் சரியாக இருந்தாலும் அதன் விளக்கம் தவறாகிவிடும்.

மெத்திலீன் ப்ளூ அளவிடப்படும் அமைப்பின் செயல்பாட்டிலேயே பங்கேற்பதால் இந்தக் குழப்பம் ஏற்பட வாய்ப்புள்ளது. இது பாதையின் முந்தைய பகுதிகளில் எலக்ட்ரான்களை ஏற்று, பிந்தைய பகுதிகளில் வழங்கும் ஆக்சிஜனேற்ற–ஒடுக்கச் சுழற்சிப் பொருள்; ஆற்றலூட்டப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியாக்களில் திரளும் கொழுப்பில் கரையும் நேர்மின் அயனி; மேலும், பொதுவான உணரிகள் பயன்படுத்தும் அதே அலைநீளப் பட்டைகளில் ஒளியை உறிஞ்சி உமிழும் அடர்நீலச் சேர்மம். ஒரே அளவீட்டு முடிவால் இந்தச் சிக்கல்கள் அனைத்தையும் கையாள முடியாது. புடாபெஸ்ட் மைட்டோகாண்ட்ரிய ஆய்வுகளில் தொடர்ந்து காணப்படும் நம்பகமான அணுகுமுறை, ஒவ்வொரு கட்டத்திலும் சாயத்திற்கே உரிய கட்டுப்பாடுகளுடன் ஆக்சிஜன் பாய்வு, ATP உருவாக்க வீதம், சவ்வு மின்னழுத்தம் மற்றும் ஹைட்ரஜன் பெராக்சைடு வெளியீடு ஆகிய அனைத்தையும் அளவிடுவதாகும்.

சுவாச அளவீடு ஆக்சிஜன் பாய்வை அளவிடுகிறது; ஆற்றல் வெளியீட்டை அல்ல

Oroboros Oxygraph மூலமாகவோ Seahorse செல்லுக்கு வெளியேயான பாய்வு பகுப்பாய்வி மூலமாகவோ செய்யப்படும் உயர் தெளிவுத்திறன் கொண்ட சுவாச அளவீடு ஒரே விஷயத்தையே தெரிவிக்கிறது: ஆக்சிஜன் எவ்வளவு வேகமாக ஒடுக்கப்படுகிறது என்பது. ஒவ்வொரு எலக்ட்ரானுக்கும் எத்தனை புரோட்டான்கள் கடத்தப்பட்டன, மின்வேதியியல் சரிவில் எவ்வளவு ஆற்றல் தக்கவைக்கப்பட்டது, அல்லது ATP சிந்தேஸ் அதைப் பயன்படுத்தியதா என்பதை அது தெரிவிக்காது.

கலைச்சொற்கள் முக்கியம். தனிமைப்படுத்தப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியாக்களில், ADP இல்லாத வினைமூலப்பொருள் கசிவு சுவாசத்தைக் காட்டுகிறது; செறிவூட்டும் அளவு ADP உடன் வினைமூலப்பொருள் ஆக்சிஜனேற்ற பாஸ்போரிலேற்றத் திறனைக் காட்டுகிறது; இணைப்பு நீக்கியின் அளவைப் படிப்படியாக மாற்றுவது அதிகபட்ச எலக்ட்ரான் கடத்தல் திறனைக் காட்டுகிறது. முழுமையான செல்களில் இதற்கு இணையான Seahorse அளவீடுகள் அடிப்படைச் சுவாசம், ஒலிகோமைசினுக்கு உணர்திறனுள்ள ATP-இணைந்த சுவாசம், புரோட்டான் கசிவு, FCCP மூலம் வரையறுக்கப்படும் அதிகபட்சச் சுவாசம், மற்றும் ரோட்டினோன், ஆன்டிமைசின் ஆகியவற்றால் தடுக்கப்படாத மைட்டோகாண்ட்ரியா சாராத ஆக்சிஜன் நுகர்வு ஆகியவையாகும். Agilent Mito Stress Test கட்டமைப்பு தெளிவுபடுத்துவதுபோல, Seahorse முடிவுகளை நிலை 3 மற்றும் நிலை 4 என்று அழைப்பது, அந்த மாதிரி அமைப்பு ஆதரிக்காத துல்லியத்தை அவற்றிற்கு அளிப்பதாகும்.

அதிக ஆக்சிஜன் என்றால் அதிக ஆற்றல் என்ற இயல்பான தொடர்பை மெத்திலீன் ப்ளூ முறிக்கிறது. தனிமைப்படுத்தப்பட்ட மூளை மைட்டோகாண்ட்ரியா ஆய்வின்படி, தனிமைப்படுத்தப்பட்ட கினி பன்றி மூளை மைட்டோகாண்ட்ரியாக்களில், 100 nM முதல் 1 uM வரையிலான சாயம், குளூட்டமேட் மற்றும் மாலேட், சக்கினேட், ஆல்ஃபா-கிளிசரோபாஸ்பேட் ஆகிய வினைமூலப்பொருட்களுடன் ஓய்வுநிலை ஆக்சிஜன் நுகர்வை அதிகரித்தது. ஆல்ஃபா-கிளிசரோபாஸ்பேட்டில் இந்த அதிகரிப்பு சுமார் 64 சதவீதமாக இருந்தது. ஆனால் ஆரோக்கியமான மைட்டோகாண்ட்ரியாக்களில் ADP-ஆல் தூண்டப்பட்ட சுவாசம் ஏறக்குறைய மாறவில்லை. கசிவு அதிகரித்தபோதும் ADP-ஆல் தூண்டப்பட்ட பாய்வு மாறாததால், கணக்கிடப்படும் சுவாசக் கட்டுப்பாட்டு விகிதம் குறைகிறது. அந்தக் குறைவு சாயம் மைட்டோகாண்ட்ரியாக்களைச் சேதப்படுத்தியது என்று பொருளல்ல. இயல்பான சுவாசத்துடன் கூடுதலாக ஆக்சிஜனை நுகரும் ஓர் ஆக்சிஜனேற்ற–ஒடுக்கச் சுழற்சியைச் சாயம் சேர்த்தது என்பதே அதன் பொருள். அதிகரிப்பை மட்டும் தெரிவிக்கும் மெத்திலீன் ப்ளூ ஆக்சிஜன் நுகர்வுச் சோதனை, உண்மையான வேதிவினையை அளவிட்டுள்ளது; ஆனால் ஆற்றல் தக்கவைப்பைப் பற்றி எதையும் கூறவில்லை.

செயல்பாட்டை மீட்கும் பரிசோதனைகளும் இதே இடைவெளியைப் பெரிய அளவில் காட்டுகின்றன. காம்ப்ளெக்ஸ் I தடுக்கப்பட்டபோது, ஆக்சிஜன் பாய்வு சுமார் மூன்று மடங்காக மீண்டது; ATP உருவாக்கமோ சுமார் 1.5 மடங்கு மட்டுமே மீண்டது. அதிக ஆக்சிஜன் மின்முனையை அடைந்தது. ஆனால் அதில் குறைந்த பங்கே ATP உருவாக்கத்திற்குப் பயன்பட்டது. ஆக்சிஜனேற்ற பாஸ்போரிலேற்றம் மேம்பட்டது என்ற எந்தக் கூற்றுக்கும் ATP அளவீடும் தேவை. வகுத்தெண்ணில் ஆக்சிஜன் எவ்வாறு கணக்கிடப்படுகிறது என்பதைத் தெளிவுபடுத்தி, ஆக்சிஜன் ஒன்றுக்கு ATP என்ற விகிதமாக அதைத் தெரிவிப்பது சிறந்தது.

ATP சோதனைகள் உருவாக்க வீதத்தை அளவிடுகின்றன; மொத்த அளவு அதற்கு மாற்றாகாது

ATP சோதனை வேறொரு கேள்விக்குப் பதிலளிக்கிறது: ஓர் அலகு நேரத்தில் எவ்வளவு ATP உருவாகிறது என்பது. மின்மினிப் பூச்சி லூசிஃபரேஸ் ஒளியுமிழ்வை நிமிடங்களாகத் தொடர்ந்து பதிவுசெய்வதாக இருந்தாலும், 340 nm இல் அளவிடப்படும் இணைக்கப்பட்ட ஹெக்சோகைனேஸ் மற்றும் குளுக்கோஸ்-6-பாஸ்பேட் டீஹைட்ரோஜினேஸ் சோதனையாக இருந்தாலும், காலப்போக்கைத் தொடரும் அளவீடு ஒரு வீதத்தைத் தருகிறது. ஒரே இறுதிநிலையில் செய்யப்படும் மொத்த ATP அளவீடு, அப்போது உள்ள அளவை மட்டுமே தருகிறது. அது உருவாக்கத்திலிருந்து நுகர்வைக் கழித்த நிலையைப் பிரதிபலிக்கிறது; தனியாக அது ஆக்சிஜனேற்ற பாஸ்போரிலேற்றம் குறித்துச் சொல்வது மிகக் குறைவு.

புடாபெஸ்ட் குழு அடினைலேட் கைனேஸைத் தடுத்து, இணைக்கப்பட்ட நொதி முறையைப் பயன்படுத்தியது. ரோட்டினோன் மற்றும் ஆன்டிமைசின் கொண்டு செயலாக்கப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியாக்களில் 1 முதல் 2 uM வரையிலான மெத்திலீன் ப்ளூ, ATP உற்பத்தியைச் சிறிதளவு, ஆனால் புள்ளியியல் முக்கியத்துவத்துடன் அதிகரித்ததை அவர்கள் கண்டறிந்தனர். இது உண்மையான செயல்பாட்டு மீட்பு; ஆனால் பகுதியளவிலானது. TEGDMA நச்சுத்தன்மை ஆய்வு வேறொரு மாதிரி அமைப்பில் இதேபோன்ற முடிவை எட்டியது: 5 mM பல் சிகிச்சைப் பொருள் மோனோமரான TEGDMA, காம்ப்ளெக்ஸ் I-இணைந்த சுவாசத்தைச் சுமார் 286 பாய்வு அலகுகளிலிருந்து 28 ஆகக் குறைத்தது; 2 uM சாயம் அதைச் சுமார் 86 ஆக மீட்டெடுத்தது.

நிறமுள்ள ஆக்சிஜனேற்ற–ஒடுக்கச் சேர்மத்துடன் இரண்டு கட்டுப்பாட்டுச் சோதனைகள் கட்டாயம். முதலாவதாக, அளவிடப்படும் ATP உருவாக்கத்தில் எவ்வளவு ATP சிந்தேஸைச் சார்ந்துள்ளது என்பதை நிறுவ ஒலிகோமைசின் பயன்படுத்த வேண்டும். இரண்டாவதாக, தெரிந்த அளவு ATP, முழுமையான வினைப்பொருள் கலவை மற்றும் பயன்படுத்தப்படும் அதே சாயச் செறிவுகளுடன் செல் இல்லாத சூழலில் சேர்க்கப்பட்ட ATP-ஐ மீண்டும் அளவிட்டுச் சரிபார்க்கும் சோதனையைச் செய்ய வேண்டும். குறைந்தபட்சமாக 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM மற்றும் 2 uM ஆகிய செறிவுகளைச் சோதிக்க வேண்டும். சாயம் உமிழப்படும் ஒளியை உறிஞ்சலாம், அளவீட்டு நொதியைத் தடுக்கலாம், அல்லது வினைப்பொருட்களின் ஆக்சிஜனேற்ற–ஒடுக்க வேதியியலை மாற்றலாம். இத்தகைய குறுக்கீடுகளுக்காகவே உயிர்வேதியியல் எதிர்சோதனைகளைப் பொதுவான லூசிஃபரேஸ் சோதனை வழிகாட்டுதல் பரிந்துரைக்கிறது. ஒளியுமிழ்வு தணிப்பு பொதுவாக அதிகச் செறிவுகளில் மோசமாக இருப்பதால், 1 uM இல் அளவீட்டுப் பிறழ்வு இல்லை என்று கருத வேண்டாம்.

சவ்வு மின்னழுத்த உணரிகள் சாயத்தின் பரவலை அளவிடுகின்றன; பாய்வை அல்ல

சஃப்ரனின் O, TMRM மற்றும் TMRE, ரோடமைன் 123, JC-1 ஆகிய அனைத்தும் சவ்வைக் கடக்கக்கூடிய நேர்மின் அயனிகள். மின்வேதியியல் சமநிலைக்கு ஏற்ப அவை எதிர்மின்னூட்டம் கொண்ட மேட்ரிக்ஸில் திரளுகின்றன. ஆகவே, உணரி எங்கு இருக்கிறது என்பதன் வழியாக ஒட்டுமொத்த ஒளிர்வு மின்னழுத்தத்தை மறைமுகமாகத் தெரிவிக்கிறது. இவற்றில் எதுவும் ATP அல்லது எலக்ட்ரான் பாய்வை அளவிடுவதில்லை.

ஒவ்வொரு உணரிக்கும் ஏற்ற மாதிரி அமைப்பு உள்ளது. சஃப்ரனின் O தனிமைப்படுத்தப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியாக்களுக்கும், சவ்வூடுருவல் திறன் அதிகரிக்கப்பட்ட செல்களுக்கும் பொருந்துகிறது. பொதுவாகச் சுமார் 2 uM செறிவில், சுமார் 495 nm தூண்டுதல் அலைநீளத்திலும் 585 nm உமிழ்வு அலைநீளத்திலும் இது பயன்படுத்தப்படுகிறது. சாயம் உள்ளே எடுத்துக்கொள்ளப்படும்போது ஒட்டுமொத்த ஒளிர்வு மாறும் தணிப்பு நிலையில் இது செயல்படுகிறது. TMRM மற்றும் TMRE முழுமையான செல்களில் குறைந்த நானோமோலார் ஏற்றத்தில், தணிப்பு இல்லாத முறையில் பொருந்துகின்றன. இதில் மின்னழுத்தம் இழக்கப்படும்போது சாயம் வெளியேறி மைட்டோகாண்ட்ரிய ஒளிர்வு குறைகிறது; அதிக ஏற்றத்தில் சுயத் தணிப்பால் சமிக்ஞையின் திசை தலைகீழாகலாம். JC-1 வசதியான பச்சை–சிவப்பு விகிதத்தைத் தருகிறது. ஆனால் அது சாய ஏற்றத்தையும் மைட்டோகாண்ட்ரிய நிறையையும் சார்ந்திருப்பதால், கவனமாகக் கட்டுப்படுத்தப்பட்ட TMRM-ஐவிட அளவுசார் பணிகளுக்கு வலுவற்றது. பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படும் மைட்டோகாண்ட்ரியச் சவ்வு மின்னழுத்த உணரிகள் பற்றிய மதிப்பாய்வில் இந்தச் சாதக–பாதகங்கள் தொகுக்கப்பட்டுள்ளன.

பயன்படுத்தப்படும் செறிவுகளிலேயே மெத்திலீன் ப்ளூ ஒளியியல் குறுக்கீட்டை ஏற்படுத்துகிறது. 600 முதல் 665 nm அருகிலுள்ள அதன் உறிஞ்சல் பட்டைகள், சிவப்பு உணரிகளின் உமிழ்வுடன் ஒன்றோடொன்று படிவதால், உள்-வடிகட்டி விளைவுகள், ஒளிர்வுத் தணிப்பு மற்றும் தூண்டுதல் ஒளியின் உறிஞ்சல் ஆகிய அனைத்தும் சாத்தியமானவை. மேலும், சாயமும் கொழுப்பில் கரையும் மற்றொரு நேர்மின் அயனி; அதன் பரவலும் அளவிடப்படும் மின்னழுத்தத்திற்கு ஏற்ப மாறுகிறது. இதை எதிர்கொள்ள ஒன்றுக்கு மேற்பட்ட அளவீடுகளும் வெற்றுச் சோதனைகளும் தேவை: உணரி மட்டும், சாயம் மட்டும், ஒவ்வொரு சாயச் செறிவுடனும் உணரி, பூஜ்ஜிய ஒப்பீட்டு நிலையாக FCCP மூலம் முழுமையான மின்னழுத்த நீக்கம், முடிந்தால் ஒளியியல் பண்புகளில் வேறுபடும் இரண்டாவது உணரி. காம்ப்ளெக்ஸ் III-ஐ மாற்றுப்பாதையில் கடக்கும் ஆய்வு, ஆன்டிமைசின் மற்றும் மைக்சோதையசால் தடுப்புக்குப் பின் சஃப்ரனின் O மற்றும் TMRM இரண்டையும் பயன்படுத்திச் சவ்வு மின்னழுத்த மீட்பை மீண்டும் அளவிட்டு, ஒரே வகையான மீட்பைப் பெற்றதன் மூலம் இந்த முன்னுதாரணத்தை அமைத்தது. ஓர் ஒளியியல் அளவீட்டுக் குறிகாட்டி ஒரு குறிப்பைத் தருகிறது. இரண்டு சுயாதீனக் குறிகாட்டிகள் சான்றாகின்றன.

மூன்று மாதிரி அமைப்புகள், மூன்று வெவ்வேறு கேள்விகள்

தனிமைப்படுத்தப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியாக்கள், சவ்வூடுருவல் திறன் அதிகரிக்கப்பட்ட செல்கள் மற்றும் முழுமையான செல்கள் ஆகியவை ஒரே சோதனையில் ஒன்றுக்கொன்று மாற்றாகப் பயன்படுத்தக்கூடிய உணர்திறன் அமைப்புகள் அல்ல. அவை வெவ்வேறு செயல்பாட்டுக் கோட்பாடுகளைக் கொண்ட வெவ்வேறு கருத்துகள்.

தனிமைப்படுத்தப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியாக்கள் எலக்ட்ரான் கடத்தல் சங்கிலி, உட்சவ்வு மற்றும் மேட்ரிக்ஸ் செயலமைப்பைத் தக்கவைத்துக்கொண்டு, பிளாஸ்மா சவ்வு, சைட்டோசால் மற்றும் வலையமைப்புக் கட்டமைப்பை அகற்றுகின்றன. இவற்றை அகற்றுவதே நோக்கம்: வினைமூலப்பொருட்கள், ADP, தடுப்பிகள் மற்றும் சாயச் செறிவுகள் துல்லியமாக வரையறுக்கப்படுவதால், எந்தப் பாதை செயல்படுகிறது என்பதை அடையாளம் காண முடியும். இதற்கான விலை, இயல்பான வினைமூலப்பொருள் வழங்கல், சமிக்ஞைச் செயல்பாடு மற்றும் ஆற்றல் தேவை ஆகியவற்றை இழப்பதாகும்.

சவ்வூடுருவல் திறன் அதிகரிக்கப்பட்ட செல்கள், மைட்டோகாண்ட்ரியாக்களைச் செல்லின் கட்டமைப்பின் பெரும்பகுதிக்குள் வைத்திருக்கின்றன; அதே நேரத்தில் திறக்கப்பட்ட பிளாஸ்மா சவ்வு வழியாக வெளியில் சேர்க்கப்படும் வினைமூலப்பொருட்களையும் ADP-யையும் உள்ளே அனுமதிக்கின்றன. செல்லின் சூழலுக்குள் ஒரு வினைமூலப்பொருள்–பாதைக் குறைபாட்டை அடையாளம் காண இவை சரியான கருவி. சவ்வூடுருவல் திறனை அளவுக்கு மீறி அதிகரிப்பது வெளிச்சவ்வைச் சேதப்படுத்துகிறது; சைட்டோசால் சார்ந்த ஒழுங்குமுறை கழுவி அகற்றப்படுகிறது.

முழுமையான செல்கள் அனைத்தையும் தக்கவைக்கின்றன: பிளாஸ்மா சவ்வுத் தடை, சைட்டோசால் ஒடுக்கிகள், உள்ளார்ந்த வினைமூலப்பொருள் கடத்தல், மைட்டோகாண்ட்ரிய வலையமைப்பு மற்றும் ATP தேவை. இவை உடலியலுக்கு மிக நெருக்கமானவை; செயல்முறையைத் தனியே விளக்குவதிலிருந்து மிகத் தொலைவானவை. ஏனெனில் சாயம் உள்ளே எடுத்துக்கொள்ளப்படுதல், ஒடுக்கப்படுதல் மற்றும் தனிப்பகுதிகளில் தேக்கப்படுதல் ஆகிய அனைத்தும் மைட்டோகாண்ட்ரியாக்கள் உண்மையில் எதிர்கொள்ளும் சாய அளவை வடிவமைக்கின்றன.

TEGDMA ஆய்வு இந்த மூன்று நிலைகளையும் நோக்கத்துடன் பயன்படுத்தியது: சாயம் ஆக்சிஜனேற்றத்தையும் மின்னழுத்தத்தையும் மீட்டெடுப்பதை ஆராயத் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட மூளை மைட்டோகாண்ட்ரியாக்கள்; பாதிப்பு காம்ப்ளெக்ஸ் I-இணைந்த வினைமூலப்பொருள் ஆக்சிஜனேற்றத்தில் உள்ளது என்பதை முக்கியமாக அடையாளம் காணச் சவ்வூடுருவல் திறன் அதிகரிக்கப்பட்ட பல் கூழ் ஸ்டெம் செல்கள்; குறைக்கப்பட்ட ஆக்சிஜன் நுகர்வில் 2 uM சாயத்தின் உடலியல் நிகர விளைவை ஆராய முழுமையான ஸ்டெம் செல்கள். வெவ்வேறு மாதிரி அமைப்புகளின் மைட்டோகாண்ட்ரிய அளவீடுகளை ஒப்பிடும் வாசகர்களுக்கு, மெத்திலீன் ப்ளூ சுவாசச் சங்கிலி வழியாக எலக்ட்ரான்களை எவ்வாறு நகர்த்துகிறது என்பதை விளக்கும் துணைக் கட்டுரை பாதை குறித்த பின்னணியை வழங்குகிறது. மெத்திலீன் ப்ளூ சுவாச ஆய்வுகளைப் படிப்பதற்கான வழிகாட்டி, பயன்படுத்தப்பட்ட அளவு மற்றும் தடுப்பிகளின் தர்க்கத்தை விளக்குகிறது.

ஆக்சிஜனேற்ற–ஒடுக்க வினைகளில் செயல்படும் சாயத்திற்குத் தேவையான கட்டுப்பாடுகள்

ஆக்சிஜனேற்ற–ஒடுக்கச் சுழற்சியில் ஈடுபடும் பொருளுக்கு, வழக்கமான தடுப்பியைவிட நீண்ட கட்டுப்பாட்டுச் சோதனைப் பட்டியல் தேவை. ஏனெனில் சாயம் மட்டுமே நிகழ்த்தும் வேதிவினைகள் உயிரியல் செயல்பாட்டைப் போலத் தோன்றலாம்.

சுவாச அளவீட்டில், கருவி அளவீட்டின் படிப்படியான விலகலைச் சரிபார்க்கத் தாங்கல் கரைசல் மட்டும் உள்ள அறை, உயிரியல் பொருள் இல்லாமல் தாங்கல் கரைசலும் சாயமும் உள்ள அறை, சோதனையில் இருக்கும் செல்லுக்கு வெளியேயான எந்த ஒடுக்கியுடனும் சாயம் ஆகியவற்றைச் சோதிக்க வேண்டும். முழுமையான செல்களில் மைட்டோகாண்ட்ரியா சாராத ஆக்சிஜன் நுகர்வை வரையறுக்க, இறுதியில் ரோட்டினோனையும் ஆன்டிமைசினையும் சேர்க்க வேண்டும். ஒடுக்கப்பட்ட சாயம் ஆக்சிஜனுக்கு எலக்ட்ரான்களை மாற்றி ஹைட்ரஜன் பெராக்சைடை உருவாக்குவதன் மூலம் மீண்டும் ஆக்சிஜனேற்றமடைகிறது என்பதை நினைவில் கொள்ளுங்கள். எனவே, எலக்ட்ரான் வழங்கி இல்லாத சாயம்-மட்டும் வெற்றுச் சோதனை, NADH அல்லது NADPH கிடைக்கும்போது உருவாகும் செல் இல்லாத ஆக்சிஜன் நுகர்வை குறைவாக மதிப்பிடுகிறது.

ஹைட்ரஜன் பெராக்சைடிற்கு, தேர்வுத்திறனற்ற DCFDA சாயங்களுக்குப் பதிலாக அளவுத்திருத்தம் செய்யப்பட்ட Amplex UltraRed மற்றும் ஹார்ஸ்ராடிஷ் பெராக்சிடேஸை விரும்பிப் பயன்படுத்துங்கள்; கேட்டலேஸுடன் சரிபாருங்கள்; சாயம் ஒளியுணர்வூட்டியாக இருப்பதால் ஒளியூட்டலைச் சார்ந்த விளைவையும் சோதியுங்கள். வெறும் 100 nM சாயத்திலேயே பெராக்சைடு சுமை நான்கு மடங்கிற்கும் அதிகமாக உயர்ந்ததையும், அதன் அகற்றம் மெதுவானதையும் மூளை மைட்டோகாண்ட்ரியா ஆய்வு கண்டறிந்தது. சூப்பராக்சைடு இடைநிலை இல்லாமல் ஒடுக்கப்பட்ட சாயத்திலிருந்து நேரடியாகப் பெராக்சைடு உருவானது. உணரித் தேர்வு மற்றும் ஒளிக் கட்டுப்பாடுகள் பற்றிய விவரங்கள், சாயப் பரிசோதனைகளில் வினைத்திறன் மிக்க ஆக்சிஜன் வகைகளை அளவிடுதல் குறித்த துணைக் கட்டுரையில் உள்ளன. பெராக்சைடு எப்போது சமிக்ஞையாகவும் எப்போது சுமையாகவும் செயல்படுகிறது என்ற விரிவான கேள்வி, செல்லின் ஆக்சிஜனேற்ற–ஒடுக்கச் சமநிலை மற்றும் ஆன்டிஆக்சிடன்ட் கூற்றுகள் குறித்த விவாதத்துடன் விளக்கப்பட்டுள்ளது.

பாதைகள் பற்றிய கூற்றுகளுக்கு, காம்ப்ளெக்ஸ் III-இன் இரண்டு தடுப்பித் தளங்களையும் சோதிக்க வேண்டும்: Qi தளத்தில் ஆன்டிமைசின் A, Qo தளத்தில் மைக்சோதையசால்; அத்துடன் சயனைடைப் பயன்படுத்திக் காம்ப்ளெக்ஸ் IV இறுதிநிலையையும் சோதிக்க வேண்டும். முந்தைய எலி மூளை ஆய்வு, ரோட்டினோனால் தடுக்கப்பட்ட சுவாசத்தைச் சாயம் மீட்டெடுத்ததாகவும், ஆன்டிமைசினால் தடுக்கப்பட்ட சுவாசத்தை மீட்டெடுக்கவில்லை என்றும் தெரிவித்தது. ஆனால் பின்னர் மூன்று உயிரின வகைகளில் செய்யப்பட்ட ஆய்வு, இரு தடுப்பிகளுடனும் பகுதியளவு மீட்பையும், சைட்டோக்ரோம் c நேரடியாக ஒடுக்கப்படுவதற்கான சான்றையும் கண்டறிந்தது. சாயச் செறிவு, தடுப்பித் தளம், வினைமூலப்பொருள் நிலை மற்றும் சாயத்தின் பரவல் ஆகிய அனைத்தும் காணப்படும் பாதையை மாற்றுவதால், இந்த மாற்றுப்பாதையை உறுதியாக நிறுவப்பட்ட ஒன்றாக அல்லாமல் புதிய தரவுகளுடன் பொருந்தக்கூடிய ஒன்றாகக் கருதுங்கள்.

சோதனைத் தேர்வு அட்டவணை

கேள்விக்கேற்ப அளவீட்டைத் தேர்ந்தெடுக்க இந்த அட்டவணையைப் பயன்படுத்துங்கள்; அளவீட்டிற்கேற்ப கேள்வியைத் தேர்ந்தெடுக்க வேண்டாம்.

குறைந்தபட்சம் நம்பத்தகுந்த ஒரு கூற்றை முன்வைக்க, அதே சாயச் செறிவுகளான 100 nM, 300 nM, 1 uM மற்றும் 2 uM ஆகியவற்றில் பின்வருவன அனைத்தையும் சோதிக்க வேண்டும்: கசிவு, ADP, ஒலிகோமைசின் மற்றும் இணைப்பு நீக்கி நிலைகளில் ஆக்சிஜன் பாய்வு; ATP உருவாக்க வீதம்; இயன்றவரை இரண்டு உணரிகளுடன் சவ்வு மின்னழுத்தம்; கேட்டலேஸ் மற்றும் செல் இல்லாத கட்டுப்பாடுகளுடன் அளவுத்திருத்தம் செய்யப்பட்ட பெராக்சைடு வெளியீடு. தொடர்புடைய முடிவுகளைச் சேர்த்துத் தெரிவியுங்கள்: ஆக்சிஜன் பாய்வு, ATP வீதம், ஆக்சிஜன் ஒன்றுக்கு ATP, மின்னழுத்தம் மற்றும் பெராக்சைடு. இவற்றில் எந்த ஓர் எண்ணும் தனியாக இருந்தால், அது பொருளைத் தேடும் ஓர் அளவீடு மட்டுமே.