லோஃப்லரின் கார மெத்திலீன் நீலமும் பலவண்ண மெத்திலீன் நீலமும்: சாயமேற்றிகள் பற்றிய விளக்கம்

சாயமேற்றும் மேசையில் மூன்று புட்டிகள் அருகருகே இருக்கலாம்; ஒவ்வொன்றிலும் மெத்திலீன் நீலத்தின் ஏதோ ஒரு வகை என்று பெயரிடப்பட்டிருக்கும். ஒன்றில் நீர்க்கரைசல் மெத்திலீன் நீலம் 1% என்று இருக்கும். மற்றொன்றில் லோஃப்லரின் கார மெத்திலீன் நீலம் என்று இருக்கும். இன்னொன்றில் பலவண்ண மெத்திலீன் நீலம் என்று இருக்கும். வேலைப்பளுவில் இருப்பவர் அருகில் உள்ளதை எடுத்துப் பயன்படுத்துகிறார். பின்னர் பூச்சுத் தயாரிப்பில் சாயம் மிகவும் மங்கலாகவோ, ஒரே சீரான நீலமாகவோ, எதிர்பாராத ஊதா நிறச்சாயல்களிலோ படிகிறது; அதன் விளைவுக்கு மாதிரியே காரணம் எனக் கருதப்படுகிறது.

இது தயாரிப்புக் கலவை சார்ந்த சிக்கல்; மாதிரி சார்ந்த சிக்கல் அல்ல. இந்த மூன்று கரைசல்களிலும் தொடர்புடைய சாயங்கள் உள்ளன; ஆனால் அவை வெவ்வேறு சாயமேற்றும் கோட்பாடுகளைச் சார்ந்தவை. ஒன்று, நடுநிலைக்கு அருகிலுள்ள pH-இல் இருக்கும் சாதாரண நேர்மின் அயனிச் சாயம். மற்றொன்று, காரத்தால் வலுவாகச் செயல்படும்படி மாற்றப்பட்ட அதே சாயம். இன்னொன்று, இனியும் ஒற்றைச் சாயம் அல்ல; திட்டமிட்டு ஆக்சிஜனேற்றப்பட்ட கலவை. தவறானதைப் பயன்படுத்தினால், நீங்கள் செயல்படும் போதே சாயமேற்றும் கோட்பாடு மாறிவிடுகிறது.

சுருக்கமான பதில்

சாதாரண நீர்க்கரைசல் மெத்திலீன் நீலமே அடிப்படை: நீரில் சுமார் 1% சாயம்; பாக்டீரிய உருவ அமைப்பையும் பொது நுண்ணோக்கி ஆய்வுகளையும் காணப் பயன்படும் எளிய நேர்மின் அயனிச் சாயம். லோஃப்லரின் கார மெத்திலீன் நீலத்தில், நீரில் நீர்த்தப்பட்ட ஆல்கஹால் செறிவுக் கரைசலுடன் அளவிடப்பட்ட சிறிய அளவு நீர்த்த காரம் சேர்க்கப்படுகிறது. இது pH-ஐ உயர்த்தி, அமிலத்தன்மையுள்ள பாக்டீரிய அமைப்புகளில் நேர்மின் அயனிச் சாயம் இன்னும் வலுவாகப் பிணைய உதவுகிறது. பலவண்ண மெத்திலீன் நீலம் என்பது, காரத்தில் ஆக்சிஜனேற்றம் செய்து திட்டமிட்டு முதிர்விக்கப்பட்ட மெத்திலீன் நீலம். எனவே அந்தப் புட்டியில் மீதமுள்ள மெத்திலீன் நீலத்துடன், மெத்தில் குழுக்கள் நீக்கப்பட்ட ஒத்த வரிசைச் சேர்மங்கள் (அசூர் A, azure B, அசூர் C), தையோனின், மெத்திலீன் வயலெட் ஆகியவற்றின் கலவை இருக்கும். அந்தக் கலவை வெவ்வேறு அமைப்புகளுக்கு வெவ்வேறு நிறச்சாயல்களை அளிக்கிறது.

ஒரே ஒரு வாக்கியத்தை நினைவில் வைத்துக்கொள்ள வேண்டுமெனில்: காரமாக்குதல் சாயமேற்றத்தின் தீவிரத்தை மாற்றுகிறது; பலவண்ணமாக்குதல் சாயமேற்றத்தின் நிறங்களை மாற்றுகிறது.

சாதாரண நீர்க்கரைசல் மெத்திலீன் நீலம்: ஒப்பீட்டின் அடிப்படை

மிக எளிய தயாரிப்பு, நீரில் கரைக்கப்பட்ட மெத்திலீன் நீலம்; பொதுவாக 1% w/v செறிவில், காரம் சேர்க்காமலும் ஆக்சிஜனேற்றம் செய்யாமலும் தயாரிக்கப்படுகிறது. நிறமுடைய வேதியியல் இனம், குளோரைடு எதிர் அயனுடன் கூடிய மெத்தில்தையோனினியம் நேர்மின் அயன். இது ஒரு சிறிய, தட்டையான பீனோதையசீன் சாயம்; PubChem-இன் மெத்திலீன் நீலப் பதிவில் மெத்தில்தையோனினியம் குளோரைடு என விவரிக்கப்படுகிறது. நேர்மின் அயனாக இருப்பதால், இது நியூக்ளிக் அமிலங்களின் பாஸ்பேட் முதுகெலும்புகளிலும் பாக்டீரிய செல் சுவர்களின் அமிலக் குழுக்களிலும் பிணைந்து, வெளிர் பின்னணியில் செல்களை நீலமாகக் காட்டுகிறது.

இதன் சிறப்பு, விளைவைக் கணிக்க முடிவதுதான். உட்கருக்களும் பாக்டீரியாக்களும் நீலமாகத் தோன்றுகின்றன. காட்சி வேறுபாடு மிதமானது. தெளிவற்ற நுண்ணுயிரிகளில் சாயம் பலவீனமாகப் படியலாம்; இந்த வரம்பைத்தான் லோஃப்லர் சரிசெய்ய முயன்றார். இந்தக் கரைசல் சார்ந்துள்ள எளிய பாக்டீரியச் சாயமேற்றிகளின் பரந்த வகையைப் பற்றி அறிய, பாக்டீரிய எளிய சாயமேற்றத்தின் மேலோட்ட விளக்கத்தைப் பார்க்கவும். இங்கும் பொருளின் அடையாளத்தைத் துல்லியமாக உறுதிப்படுத்துவது முக்கியம்: மெத்தில் நீலம் முற்றிலும் வேறான மூலக்கூறு என்பதை மெத்தில் நீலமும் மெத்திலீன் நீலமும் விளக்குகிறது. எனவே நிறத்தின் பெயரை மட்டும் வைத்து பொருட்பட்டியலில் தேடினால், தவறான சாய வகை கிடைக்கலாம்.

லோஃப்லரின் கார மெத்திலீன் நீலம்: அதே சாயம், வலுவான செயல்பாடு

பாரம்பரிய லோஃப்லர் செய்முறை, ஆல்கஹாலில் தயாரிக்கப்பட்ட மெத்திலீன் நீலச் செறிவுக் கரைசலை நீரிலுள்ள நீர்த்த காரத்துடன் சேர்க்கிறது. பாடநூல் செய்முறைகளில், 30 mL அளவுள்ள 95% எத்தனாலில் 0.3 g சாயத்தைக் கரைத்து, அதனுடன் 100 mL அளவுள்ள 0.01% பொட்டாசியம் ஹைட்ராக்சைடு நீர்க்கரைசலைச் சேர்க்க வேண்டும் என்று குறிப்பிடப்படுகிறது. இதற்கு இணையான மற்றொரு செய்முறையில், 30 mL நிறைவுற்ற ஆல்கஹால் மெத்திலீன் நீலக் கரைசல், 100 mL வடிநீர், 1 mL அளவுள்ள 1% KOH சேர்க்கப்படுகின்றன. இவ்வாறு தெளிவான கார pH-இல், சுமார் 0.3% சாயம் கொண்ட பயன்பாட்டுக் கரைசல் கிடைக்கிறது. வணிகத் தயாரிப்புகளும் இதே கோட்பாட்டைப் பின்பற்றுகின்றன. Thermo Fisher நுண்ணுயிரியல் சாயமேற்றிகள் பொருட்பட்டியல், லோஃப்லரின் கார மெத்திலீன் நீலம், பலவண்ண வகை, நீர்க்கரைசல் வகை ஆகியவற்றை வெவ்வேறு பயன்பாடுகளுக்கான தனித்தனி பொருட்களாகப் பட்டியலிடுகிறது.

காரத்தைச் சேர்ப்பதே இங்கு முக்கியமான செயல்முறை. pH-ஐ உயர்த்துவது, மாதிரியில் உள்ள கார்பாக்சில் மற்றும் பாஸ்பேட் குழுக்களிலிருந்து புரோட்டான்களை நீக்கி, எதிர்மின் தளங்களின் அடர்த்தியை அதிகரிக்கிறது. அதே நேரத்தில், ஆல்கஹால் செறிவுக் கரைசல் சாயத்தை முழுமையாகக் கரைந்த நிலையில் வைத்திருப்பதால், அது தனி மூலக்கூறு வடிவில் அந்தத் தளங்களை அடைகிறது. இதன் விளைவாக, நடுநிலை நீர்க்கரைசல் சாயத்தைவிட பாக்டீரியாக்களில் சாயம் விரைவாகவும் தீவிரமாகவும் படிகிறது. வழக்கமான பாக்டீரியப் பூச்சுத் தயாரிப்பில் காணப்படும் அடர் நீலக் கோல் வடிவங்களும் உருண்டை வடிவங்களும் கிடைக்கின்றன. சாயமேற்றும் நேரம் பொதுவாக ஒன்று முதல் மூன்று நிமிடங்கள்; பின்னர் நீரில் கழுவப்படுகிறது.

இதன் பாரம்பரியப் பயன்பாடு, லோஃப்லர் இரத்தநீர் வளர்ப்பூடகத்தில் வளர்க்கப்பட்ட கோரினிபாக்டீரியம் டிஃப்தீரியே ஆகும்: இவை மெலிந்த, பெரும்பாலும் கதாயுதம் போன்ற வடிவமுடைய கோல்களாகக் காணப்படும்; சேமிக்கப்பட்ட பாலிபாஸ்பேட்டைக் கொண்ட நிறமாற்றம் காட்டும் பேப்ஸ்–எர்ன்ஸ்ட் துகள்களில் சாயம் வலுவாகப் படியும். இந்த வளர்ப்பூடகமும் சாயமேற்றியும் இணைந்து பயன்படுத்தப்படுவது வரலாற்றுச் சார்புடையது; இரண்டுமே ஒரே பாக்டீரியவியலாளரின் பங்களிப்பாகக் கருதப்படுகின்றன. துகள்களின் காட்சி வேறுபாடே நோயறிதலில் இதன் பயன். டிஃப்தீரியா சார்ந்த பணிகளுக்கு அப்பால், வளர்ப்புகளிலிருந்து பெறப்படும் பூச்சுத் தயாரிப்புகளுக்கான பொது பாக்டீரியச் சாயமேற்றியாகவும், மருத்துவப் பூச்சுத் தயாரிப்புகளில் நைசீரியாவின் உருவ அமைப்பைக் காணவும், கிராம் சாயமேற்றம் தேவையில்லை என்றாலும் சாதாரண நீர்க்கரைசல் நீலச் சாயம் மிகவும் மங்கலாக இருக்கும் இடங்களிலும் இது பயன்படுகிறது. இது ஒற்றைநிறச் சாயமேற்றி. அமிலத்தன்மையுள்ள அனைத்தும் ஏதோ ஒரு நீல நிறச்சாயலைப் பெறுகின்றன. செய்முறைக்கு வேறுபடுத்திக் காட்டும் நிறங்கள் தேவைப்பட்டால், காரம் மட்டும் அவற்றை வழங்க முடியாது.

நடைமுறையில் ஒரு எச்சரிக்கை: காரச் சாயக் கரைசல்கள் சேமிப்பின்போதும் கார்பன் டைஆக்சைடை உட்கொள்வதாலும் சிதைந்து, வீழ்படிவுகளை உருவாக்குகின்றன. எனவே ஆய்வகங்கள் குறைந்த அளவுகளையே தயாரிக்கின்றன; அல்லது பட்டியலிடப்பட்ட கரைசலை வாங்கி அதன் சேமிப்புக் காலவரம்பைப் பின்பற்றுகின்றன. ஒவ்வொரு நுண்ணோக்கித் தகட்டிலும் படிவுகளை விட்டுச்செல்லும் பழைய புட்டியைத் தொடர்ந்து பயன்படுத்துவதில்லை.

பலவண்ண மெத்திலீன் நீலம்: ஒரு பெயர், பல சாயங்கள்

பலவண்ண மெத்திலீன் நீலமும் அதே சாயத்திலிருந்துதான் தொடங்குகிறது; ஆனால் காரத்தில் கட்டுப்படுத்தப்பட்ட ஆக்சிஜனேற்றத்திற்கு உட்படுத்தப்படுகிறது. இது வரலாற்றில் முதிர்வித்தல் அல்லது பலவண்ணமாக்குதல் என்று அழைக்கப்பட்டது. கார நிலையில் முதிர்வித்தல், கார்பனேட்டுடன் சூடாக்குதல், அல்லது டைகுரோமேட் போன்ற காரணிகளால் ஆக்சிஜனேற்றுதல் ஆகியவை டைமெத்தில்அமினோ பதிலீட்டுக் குழுக்களிலிருந்து மெத்தில் குழுக்களைப் படிப்படியாக நீக்குகின்றன. இதன் விளைபொருள் ஒரு கலவை: மீதமுள்ள மெத்திலீன் நீலம், azure B (ஒரு மெத்தில் நீக்கப்பட்டது), அசூர் A மற்றும் அசூர் C (மேலும் மெத்தில் குழுக்கள் நீக்கப்பட்டவை), தையோனின் (மெத்தில் குழுக்கள் முழுமையாக நீக்கப்பட்டது), மெத்திலீன் வயலெட் வகையைச் சேர்ந்த ஆக்சிஜனேற்றத் துணை விளைபொருட்கள் ஆகியவை அதில் உள்ளன. ஒவ்வொரு கூறுக்கும் தனித்துவமான நிறச்சாயலும் திசுக்களுடன் பிணையும் நாட்டமும் உண்டு. ஆகவே கலவை நிறமாற்றச் சாயமேற்றத்தை அளிக்கிறது: உட்கருக்கள், துகள்கள், மியூசின்கள், குருத்தெலும்பு ஆகியவை ஒவ்வொன்றும் நீலத்திலிருந்து சிவப்பு–ஊதா வரை தனித்தனி நிறச்சாயல்களைப் பெறுகின்றன.

புகழ்பெற்ற இரத்தச் சாயமேற்றிகளின் பின்னணியிலும் இதே வேதியியல்தான் உள்ளது. காரமாக்கப்பட்ட மெத்திலீன் நீலம் மலேரியா ஒட்டுண்ணிகளின் உட்கருக்களுக்கு ஊதா நிறச்சாயல்களை அளிப்பதை ஆரம்பகால ஆய்வாளர்கள் கண்டறிந்தனர். ஆனால் அவர்கள் பயன்படுத்திய முதிர்விக்கப்பட்ட நீர்க்கரைசல்கள் நிலையற்றவையாக இருந்து, சில நாட்களிலேயே வீழ்படிவுகளை உருவாக்கின. ஊதா இரத்தச் சாயமேற்றி எவ்வாறு கண்டுபிடிக்கப்பட்டது என்ற ஆய்வுச் சுருக்கம், 1891-இல் மலாகோவ்ஸ்கியும் ரோமானோவ்ஸ்கியும் தனித்தனியாக இந்த விளைவை எவ்வாறு பயன்படுத்தினர் என்பதையும், சாய வீழ்படிவை நிலைப்படுத்தவும் வெப்பமின்றிப் பூச்சுப் படலங்களை நிலைநிறுத்தவும் மெத்தனால் எவ்வாறு அறிமுகப்படுத்தப்பட்டது என்பதையும் விவரிக்கிறது. பின்னர் கீம்சா, அளவிடப்பட்ட azure B மற்றும் ஈயோசினை அடிப்படையாகக் கொண்டு, கிளிசரால் நிலைப்படுத்தலுடன் கலவையை எவ்வாறு தரப்படுத்தினார் என்பதையும் அது விளக்குகிறது. நவீன கீம்சா வகைச் சாயமேற்றிகள், பலவண்ண மெத்திலீன் நீலத்துடன் ஈயோசின் சேர்ந்த கலவையிலிருந்து நேரடியாக உருவானவை; இந்த இணைப்பே ரோமானோவ்ஸ்கி விளைவை உருவாக்குகிறது. ஈயோசின் இணைப்பையும் azure B கூறையும் விரிவாக அறிய, ரோமானோவ்ஸ்கி வகைச் சாயமேற்றிகளும் azure B–ஈயோசின் இடைவினையும் பார்க்கவும்.

பலவண்ண மெத்திலீன் நீலம் ஒரு கலவை என்பதால், இயல்பாகவே இந்த மூன்றில் மிகக் குறைவாகத் தரப்படுத்தப்பட்டதாக உள்ளது. அதன் துல்லியமான நிறச்சாயல் சமநிலை, ஆக்சிஜனேற்ற முறை மற்றும் அதன் அளவைச் சார்ந்துள்ளது. அதனால்தான் திசுவியல் பொருள் வழங்குநர்கள் அதை முதிர்ந்த லோஃப்லர் கரைசலாக அல்லாமல், தனிப்பட்ட செயல்திறன் சோதனைகளைக் கொண்ட தனித் தயாரிப்பாக விற்கின்றனர். மாஸ்ட் செல் துகள்கள், மியூசின்கள், குருத்தெலும்பு ஆகியவற்றில் நிறமாற்றத்தை வெளிப்படுத்துதல், பிளாஸ்மா செல்களின் நுண்விவரங்களைக் காட்டுதல், குட்பாஸ்ச்சர் வகை பலவண்ண முறைகளால் திசுத் துண்டுகளில் ஹெலிகோபாக்டர் பைலோரியைக் காட்டுதல் ஆகியவை வழக்கமான பயன்பாடுகள். நிறத்தின் அடிப்படையில் வேறுபடுத்துவதே நோக்கமாக இருக்கும்போது இது சரியான தேர்வு; தெளிவான ஒற்றைநிற பாக்டீரிய உருவம் எதிர்பார்க்கப்படும் செய்முறையில் இது தவறான தேர்வு.

தயாரிப்புக் கலவையும் பயன்பாடும்: ஒப்பீடு

இந்த அட்டவணையைத் தேர்வு செய்வதற்கான வழிமுறையாகப் படியுங்கள். மாதிரியில் சாயம் மிகவும் மங்கலாகப் படிந்தால், pH சார்ந்த அணுகுமுறையை மாற்றி லோஃப்லரின் சாயமேற்றியைத் தேர்ந்தெடுங்கள். அனைத்திலும் சாயம் படிந்தும் எதுவும் தனித்துத் தெரியாவிட்டால், சாயம் சார்ந்த அணுகுமுறையை மாற்றி பலவண்ணச் சாயமேற்றியைத் தேர்ந்தெடுங்கள். லோஃப்லர் பூச்சுத் தயாரிப்பில் துகள்கள் அழகாகத் தெரிந்தாலும், உட்கருக்களும் சைட்டோபிளாசமும் ஏன் ஒரே நீல நிறத்தில் உள்ளன என்று மேற்பார்வையாளர் கேட்டால், எந்தக் கார ஒற்றைநிறச் சாயமேற்றியும் அந்த வேறுபடுத்தும் பணியைச் செய்ய முடியாது என்பதே பதில். அந்தத் தேவை பலவண்ண வகைக்கும் அதன் இரத்தச் சாயமேற்றி வழித்தோன்றல்களுக்கும் உரியது.

வழக்கமான குழப்பங்களைத் தவிர்த்தல்

பெரும்பாலான குழப்பங்களுக்கு இரண்டு தவறுகளே காரணம். முதலாவது, புட்டியில் இரண்டுமே நீலமாகத் தோன்றுவதால் லோஃப்லரின் சாயமேற்றியையும் சாதாரண மெத்திலீன் நீலத்தையும் ஒன்றுக்குப் பதிலாக மற்றொன்றைப் பயன்படுத்தலாம் என்று கருதுவது. அவற்றின் pH மற்றும் சாயமேற்றும் தீவிரம் வேறுபடுகின்றன. லோஃப்லரின் சாயமேற்றி குறிப்பிடப்பட்டுள்ள இடத்தில் நடுநிலைச் சாயத்தைப் பயன்படுத்தினால், அந்தச் செய்முறையின் முக்கிய நோக்கமான துகள்களின் காட்சி வேறுபாடு இழக்கப்படுகிறது. இரண்டாவது, பழைய அல்லது தற்செயலாக முதிர்ந்த எந்தக் கார நீலக் கரைசலையும் பலவண்ணச் சாயமேற்றியாகக் கருதுவது. கட்டுப்பாடற்ற முதிர்வு, அறியப்படாத செறிவில் அறியப்படாத கலவையை உருவாக்குகிறது. உண்மையான பலவண்ணக் கரைசல்களோ வரையறுக்கப்பட்ட ஆக்சிஜனேற்ற முறைகளால் தயாரிக்கப்படுகின்றன; இரத்தச் சாயமேற்றி மரபில், அளவிடப்பட்ட ஈயோசினுடன் சேர்க்கப்படுகின்றன. இங்கு வரலாறு ஒரு பாடத்தை அளிக்கிறது: 1890-களின் நிலையற்ற, முதிர்விக்கப்பட்ட நீர்க்கரைசல்களுக்குப் பதிலாக மெத்தனாலில் நிலைப்படுத்தப்பட்ட தயாரிப்புகள் வந்ததற்குக் காரணம், கட்டுப்பாடற்ற கலவைகளை அதேபோல் மீண்டும் உருவாக்க முடியாததுதான். எவ்வளவு பழையது என்று தெரியாத புட்டியிலிருந்து நோயறிதலுக்கான நுண்ணோக்கித் தகட்டில் சாயமேற்றுவதற்கு முன், இந்தப் பாடத்தை நினைவுகூர்வது பயனுள்ளது.

பெயரைத் துல்லியமாக உறுதிப்படுத்துவது இந்தக் குழப்பத்தைத் தீர்க்கிறது. நிறத்தை வைத்து ஊகிக்காமல், பொருட்பட்டியலில் உள்ள வகை (நீர்க்கரைசல், லோஃப்லர் அல்லது பலவண்ணம்), சாயத்தின் அளவு, நோக்கமிடப்பட்ட பயன்பாடு ஆகியவற்றைப் பெயர்ச்சீட்டில் உறுதிப்படுத்துங்கள். இந்த மூன்று தயாரிப்புகளுக்கும் நிறமளிக்கும் மூலக்குழுவின் முன்னோடி ஒன்றுதான். ஆனால் அவற்றின் பயன்பாடு ஒன்றல்ல.