Wigo wa ufyonzaji wa bluu ya methilini na uwezo wa ufyonzaji wa moli: rejea yenye masharti yaliyoainishwa

Wigo wa bluu ya methilini huonekana rahisi mpaka unapojaribu kutumia tena thamani kutoka humo. Maabara moja inaripoti mgawo wa upunguzaji wa mwanga wa moli wa karibu 82,000. Nyingine inaripoti 67,000. Ya tatu inaripoti zaidi ya 100,000. Thamani zote tatu zinaweza kueleza kwa usahihi vipimo vya maabara hizo, lakini hakuna hata moja ambayo ni thamani thabiti inayotumika kwa rangi hii katika hali zote.

Mkanganyiko unatokana na kuchanganya dhana mbili tofauti. Ufyonzaji wa mwanga ni kipimo kinachofanywa kwenye myeyusho maalumu katika seli maalumu ya kupimia. Uwezo wa ufyonzaji wa moli, ambao mara nyingi huandikwa kama epsilon, ni kigezo katika modeli ya myeyusho huo. Bluu ya methilini inapobadilisha hali ya kuungana kwa molekuli zake, modeli hubadilika, hivyo kigezo nacho hubadilika. Mazoea yenye manufaa ni kuchukulia kila mgawo kama thamani yenye masharti yaliyoainishwa: urefu wa wimbi, kiyeyushi, pH au bafa, halijoto, masafa ya ukolezi na urefu wa njia ya mwanga lazima viambatane na thamani hiyo.

Bendi ya monoma katika myeyusho hafifu wa maji

Katika myeyusho hafifu wa maji, bendi kuu ya katayoni ya bluu ya methilini iko karibu na 664 hadi 665 nm, na kwa kawaida hutajwa kuwa ndani ya 664 hadi 668 nm kulingana na vifaa na njia za urekebishaji wa vipimo. Bendi hiyo ndiyo chaguo linalofaa kwa kubainisha kiasi wakati myeyusho ni hafifu kiasi kwamba sehemu kubwa ya rangi iko katika umbo la monoma.

Thamani tatu kutoka kwenye machapisho ya kisayansi zinaonyesha kwa nini masharti ni muhimu zaidi kuliko thamani inayotajwa kwa muhtasari. Watafiti wa udongo wa mfinyanzi waliohifadhi sampuli za maji chini ya takriban 7 micromolar katika seli za 1 cm waliripoti epsilon ya takriban 82,000 M-1 cm-1 katika 665 nm. Thamani hiyo imeandikwa kwa undani usio wa kawaida kama mteremko wa urekebishaji uliopatikana kwa majaribio kwa sampuli hafifu sana za maji. Urekebishaji wa msingi wa baadaye katika maji yaliyoondolewa ioni, uliotumia 2.34 hadi 37.52 micromolar na njia ya mwanga ya 1 cm, ulitoa takriban 67,100 M-1 cm-1 katika 665 nm kwa jumla ya rangi. Matokeo hayo ya chini yanatarajiwa, si yanayopingana na yale ya awali, kwa sababu nusu ya juu ya masafa hayo ya urekebishaji tayari ina kiasi cha dima kisichoweza kupuuzwa. Thamani ya tatu, takriban 73,460 M-1 cm-1 katika 664 nm, inatokana na utafiti uliofanywa katika pH 6.86 na 293 K uliotenganisha wigo ulioonekana katika sehemu za monoma na dima, kama ilivyofupishwa katika mapitio ya hivi karibuni ya kina kuhusu fotofizikia ya bluu ya methilini. Thamani hiyo ni ya sehemu ya monoma iliyotenganishwa kihisabati, si mteremko wa moja kwa moja wa ufyonzaji wa mwanga dhidi ya jumla ya rangi.

Jambo la kuzingatia katika matumizi: chagua mgawo ambao masharti yake yanalingana na sampuli zako, au fanya urekebishaji wako mwenyewe. Usitumie 82,000 katika uchanganuzi wa bafa ya fosfati wenye 30 micromolar na kudhani kuwa uhusiano wa mstari bado unadumu.

Bega la urefu mfupi wa wimbi ni mchanganyiko

Ukolezi unapoongezeka, bega karibu na 600 hadi 615 nm hukua ikilinganishwa na kilele cha 664 nm. Tafiti za kisasa kwa kawaida huweka mchango wa dima ya aina ya H karibu na 605 hadi 610 nm. Uchanganuzi wa pamoja wa wigo wa bluu ya methilini katika maji hutenganisha kilele cha dima katika 607 nm na kilele cha mkusanyiko mkubwa zaidi wa molekuli katika 600 nm, pamoja na sehemu za rezonansi za monoma katika 664 na 650 nm. Maandishi yake kamili yanapatikana kupitia rekodi yenye ufikiaji wazi ya PMID 33251415.

Bega hilo halipaswi kuitwa ufyonzaji wa dima pekee. Muundo wa mtetemo-elektroni wa monoma pia huchangia katika eneo hilo, hivyo kimo kinachopimwa ni jumla ya michango inayopishana. Ulinganishaji mmoja wa pamoja wa modeli na data ulibaini kuwa modeli ya monoma pamoja na dima haikutoshea masafa yote ya 1.1 micromolar hadi 3.4 millimolar, ilhali kuongeza tetrama kulitoa ulinganifu bora zaidi, huku ishara ya tetrama ikiwa tayari inagundulika chini ya 34 micromolar. Nguvu za ufyonzaji za sehemu zilizokadiriwa kwa ulinganishaji huo zilikuwa kubwa: takriban 107,800 M-1 cm-1 katika 664 nm kwa sehemu kuu ya monoma, takriban 101,400 kwa dima katika 607 nm, na takriban 138,500 kwa tetrama katika 600 nm, katika maji yaliyoondolewa ioni yasiyo na bafa, yenye kloridi ya sodiamu kutoka 0 hadi 0.15 M na halijoto kutoka 282 hadi 333 K. Hizi ni sehemu zilizotenganishwa kwa modeli, hivyo hazipaswi kutumiwa badala ya mteremko wa Beer Lambert uliopatikana kwa majaribio.

Kiwango cha kutengenezwa kwa dima kimepimwa moja kwa moja. Katika pH 6.86 na 293 K, utafiti mmoja ulipata konstanti ya kutengenezwa kwa dima ya karibu 3,900 M-1. Ukubwa huo unaeleza kwa nini myeyusho wa matumizi wa 5 micromolar unaonyesha uhusiano unaokaribia mstari ilhali myeyusho wa akiba wa 50 micromolar hauonyeshi hivyo. Ukaguzi wenye manufaa wakati wa kuandaa mbinu ni uwiano wa ufyonzaji karibu na 610 nm dhidi ya ufyonzaji karibu na 665 nm. Uwiano huo unapoongezeka kadiri ukolezi unavyoongezeka, epsilon katika 664 nm haielezi tena spishi moja isiyobadilika.

Katika kipindi cha ukolezi kinachotawaliwa na jozi moja ya spishi zinazobadilishana, wigo unaweza kushiriki nukta moja ya isosbestiki, ambayo katika majaribio ya mifululizo ya myeyusho wa maji iko karibu na 625 nm. Nukta dhahiri isiyohama inaendana na kuwepo kwa spishi mbili zinazotawala. Nukta hiyo inapohama au kutoweka kadiri ukolezi unavyoongezeka, ichukulie kama onyo kwamba mikusanyiko mikubwa zaidi ya molekuli au mabadiliko ya msawazo yamejitokeza, si kama hitilafu ya kifaa.

Kiyeyushi, pH na halijoto hubadilisha wigo

Maji huchochea kuungana kwa molekuli. Kuongeza dimethyl sulfoxide hupunguza kutengenezwa kwa dima, huhamisha vilele vya ufyonzaji na fluoresensi kuelekea urefu mkubwa zaidi wa wimbi, na huongeza mavuno ya kwantamu ya fluoresensi takriban mara nne, kulingana na utafiti wa viyeyushi vya bluu ya methilini katika michanganyiko ya maji na DMSO, ulioorodheshwa kama PMID 30933781. Utafiti huo huchukulia wigo wa myeyusho wa maji kama msawazo wa monoma na dima, wenye ufyonzaji wa monoma karibu na 650 hadi 670 nm na ufyonzaji wa dima karibu na 580 hadi 615 nm, na hukokotoa konstanti za kutengenezwa kwa dima kutokana na wigo katika 293.15 K.

Alkoholi hubadilisha nafasi na nguvu inayoonekana ya ufyonzaji, lakini haziondoi kukusanyika kwa molekuli. Katika ulinganisho mmoja wa msingi uliofanywa kwa 31.3 micromolar na halijoto ya chumba, ulioripotiwa katika utafiti wa viyeyushi vya bluu ya methilini, kilele cha urefu mkubwa wa wimbi kilikuwa 665 nm katika maji lakini 655 nm katika methanoli, huku thamani zinazoonekana za myeyusho mzima zikiwa karibu 37,100 katika maji na 60,800 katika methanoli. Uthibitishaji tofauti katika ethanoli isiyo na maji katika 298 K ulitoa kilele katika 655 nm chenye epsilon ya karibu 68,000.

Mabadiliko ya kawaida ya pH hubadilisha wigo kwa kiasi kidogo kuliko inavyodhaniwa katika taratibu nyingi. Mapitio ya kina yaliyotajwa hapo juu yanaripoti kuwa kutoka takriban pH 2 hadi pH 12, kilele kilibaki karibu na 665 nm, huku nguvu ya ufyonzaji ikibadilika kidogo tu hadi pH 11. Aina ya bafa na nguvu ya ioni zinaweza kubadilisha matokeo kwa kiasi sawa na pH iliyotajwa, hivyo andika bafa na chumvi zilizotumika, si usomaji wa kifaa cha kupima pH pekee. Asidi kali au alkali kali ni hali tofauti kwa sababu rangi inaweza kupata mabadiliko ya kikemia badala ya kuungana kwa molekuli kunakoweza kurudi nyuma. Halijoto na chumvi pia hubadilisha msawazo, ndiyo sababu utafiti wa maji wa 2020 ulibadilisha vyote viwili kwa makusudi.

Kupima ili thamani iendelee kuwa halali

Kazi ya kubainisha kiasi hutegemea uhusiano wa Beer Lambert, ambapo ufyonzaji wa mwanga ni sawa na epsilon ikizidishwa kwa ukolezi na urefu wa njia ya mwanga, pamoja na uthibitisho kwamba uhusiano wa mstari unadumu kweli katika masafa hayo chini ya masharti yako.

Tumia seli ya 1 cm kwa kazi yenye ukolezi mdogo wa micromolar. Kwa epsilon ya karibu 82,000, 5 micromolar hutoa ufyonzaji wa karibu 0.41 na 10 micromolar hutoa takriban 0.82. Kwa kipimo kinacholenga monoma katika maji yasiyo na viambato vingine, kubaki karibu na au chini ya takriban 5 hadi 7 micromolar ni salama zaidi kuliko kurekebisha vipimo hadi kwenye makumi ya micromolar. Kwa myeyusho wa akiba wenye ukolezi mkubwa, fupisha njia ya mwanga badala ya kukubali ufyonzaji ulio juu sana ya 1.

Tumia myeyusho wa rejea usio na rangi wenye mazingira sawa kabisa: daraja lilelile la maji, sehemu ileile ya kiyeyushi cha ziada, na bafa na chumvi zilezile, bila rangi. Andaa viwango vya urekebishaji katika mazingira hayo hayo na katika halijoto ileile. Wakati wa kuandaa mbinu, changanua masafa yote ya mwanga unaoonekana, ikiwezekana takriban 550 hadi 750 nm, badala ya kupima urefu mmoja tu wa wimbi. Fuatilia umbo, si kimo pekee. Ikiwa upunguzaji wa ukolezi kwa mfululizo unabadilisha umbo lililosawazishwa, mfumo unategemea ukolezi kikemia. Kilele kisichobadilika na uwiano usiobadilika wa 610 hadi 665 nm ni ushahidi imara zaidi wa masafa yanayokubalika kuliko thamani kubwa ya R mraba pekee.

Andika umbo la kitendanishi. Bidhaa ya kibiashara inaweza kuwa kloridi ya methylthioninium isiyo na maji au hidrati kama vile trihidrati, hivyo molekuli-masi ya moli inayotumiwa katika hesabu za myeyusho wa akiba lazima ilingane na kilichomo kwenye chupa. Hatua hii pekee inaeleza sehemu ya tofauti za ukolezi wa moli uliotajwa kati ya maabara. Umakini kama huo unahitajika matokeo yanapotumiwa katika hesabu za uchanganuzi wa kiasi, wigo unapotumiwa kusaidia ukaguzi wa uthabiti wa uundaji, na profaili za uchafu zinapohitaji mapitio ya usafi na vipimo bainifu.

Muhtasari wenye masharti yaliyoainishwa

Tumia jedwali hili kama kiolezo cha kuanzia cha rekodi ya maabara, si kama chanzo cha konstanti zinazoweza kutumiwa kwa kubadilishana.

Kwa hiyo, urefu wa wimbi la ufyonzaji wa bluu ya methilini una jibu fupi lenye maelezo marefu ya ziada. Ripoti kilele ulichopima, katika myeyusho ulioupima, na katika ukolezi ulioupima. Mazoea hayo huzuia thamani moja ya myeyusho hafifu wa maji karibu na 664 nm kugeuzwa kuwa konstanti ya uongo inayodaiwa kutumika katika hali zote.