ميٿيلين بلو جو جذبي طيف ۽ مولر جذب پذيري: شرطن سان نشان لڳل حوالو

ميٿيلين بلو جو طيف تيستائين سادو لڳندو آهي، جيستائين توهان ان مان ڪو انگ ٻيهر استعمال ڪرڻ جي ڪوشش نٿا ڪريو. هڪ ليبارٽري مولر نوري زوال ضريب لڳ ڀڳ 82,000 ٻڌائي ٿي. ٻي 67,000 ٻڌائي ٿي. ٽين 100,000 کان وڌيڪ ٻڌائي ٿي. اهي ٽيئي پنهنجي پنهنجي ماپن جون صحيح وضاحتون ٿي سگهن ٿيون، پر انهن مان ڪو به هن رنگ لاءِ آفاقي مستقل نه آهي.

مونجهارو ٻن الڳ تصورن کي گڏ ڪرڻ مان پيدا ٿئي ٿو. جذب مقدار هڪ مخصوص محلول تي، هڪ مخصوص سيل ۾ ڪيل ماپ آهي. مولر جذب پذيري، جنهن کي اڪثر ايپسيلون لکيو ويندو آهي، ان محلول جي ماڊل جو هڪ پيرا ميٽر آهي. جڏهن ميٿيلين بلو جي ماليڪيولي گڏجڻ واري حالت بدلجي ٿي، تڏهن ماڊل به بدلجي ٿو، تنهنڪري پيرا ميٽر به بدلجي ٿو. ڪارائتي عادت اها آهي ته هر ضريب کي شرطن سان نشان لڳل قدر سمجهيو وڃي: موج جي ڊيگهه، محلل، pH يا بفر، گرمي پد، ڪنسنٽريشن جي حد ۽ نوري رستي جي ڊيگهه ان انگ سان گڏ هجن.

گهٽ ڪنسنٽريشن واري پاڻيءَ ۾ مونومر جي پٽي

گهٽ ڪنسنٽريشن واري آبي محلول ۾، ميٿيلين بلو جي ڪيٽائن جي غالب پٽي لڳ ڀڳ 664 کان 665 nm تي هوندي آهي؛ مختلف اوزارن ۽ ڪيلبريشن جي چونڊن ۾ عام طور ان کي 664 کان 668 nm جي وچ ۾ ڄاڻايو ويندو آهي. جڏهن محلول ايترو گهٽ ڪنسنٽريشن وارو هجي جو رنگ جو گهڻو حصو مونومر صورت ۾ هجي، تڏهن مقداري ماپ لاءِ اها پٽي مناسب چونڊ آهي.

تحقيقي ادب جا ٽي قدر ڏيکارين ٿا ته نمايان انگ کان وڌيڪ شرط ڇو اهم آهن. مٽيءَ تي تحقيق ڪندڙن، جن آبي نمونن کي 1 cm سيلن ۾ لڳ ڀڳ 7 micromolar کان هيٺ رکيو، 665 nm تي ايپسيلون لڳ ڀڳ 82,000 M-1 cm-1 ڄاڻايو. اهو قدر تمام گهٽ ڪنسنٽريشن وارن پاڻيءَ جي نمونن لاءِ تجرباتي ڪيلبريشن جي ڍلان طور غيرمعمولي نموني چڱيءَ طرح دستاويز ٿيل آهي. بعد ۾ آئنن کان پاڪ پاڻيءَ ۾ ڪيل هڪ بنيادي ڪيلبريشن، جنهن ۾ 2.34 کان 37.52 micromolar ۽ 1 cm نوري رستو استعمال ٿيو، مجموعي رنگ لاءِ 665 nm تي لڳ ڀڳ 67,100 M-1 cm-1 ڏنو. هي گهٽ نتيجو متوقع آهي، متضاد نه، ڇو ته ان ڪيلبريشن جي حد جي مٿئين اڌ ۾ اڳ ئي ڊائمر جو قابلِ ذڪر مقدار موجود آهي. ٽيون قدر، 664 nm تي لڳ ڀڳ 73,460 M-1 cm-1، pH 6.86 ۽ 293 K تي ٿيل ڪم مان اچي ٿو، جنهن ۾ ڏٺل طيف کي مونومر ۽ ڊائمر جي حصن ۾ الڳ ڪيو ويو؛ ان جو خلاصو ميٿيلين بلو جي نوري طبعيات بابت هڪ تازي تنقيدي جائزي ۾ ڏنل آهي. اهو انگ تجزياتي طور الڳ ڪيل مونومر جزو آهي، مجموعي رنگ جي مقابلي ۾ جذب مقدار جي سڌي ڍلان نه آهي.

عملي نڪتو هي آهي: اهو ضريب چونڊيو جنهن جا شرط توهان جي نمونن سان ملن، يا پنهنجي ڪيلبريشن ڪريو. 30 micromolar فاسفيٽ بفر واري جاچ ۾ 82,000 استعمال ڪري اهو فرض نه ڪريو ته لاڳاپو اڃا به خطي رهندو.

ننڍي موج جي ڊيگهه وارو ڪلهو هڪ ملاوٽ آهي

ڪنسنٽريشن وڌڻ سان، 600 کان 615 nm جي ويجهو هڪ ڪلهو 664 nm واري چوٽيءَ جي ڀيٽ ۾ وڌي ٿو. جديد تحقيق عام طور H قسم جي ڊائمر جي حصي کي 605 کان 610 nm جي ويجهو رکي ٿي. پاڻيءَ ۾ ميٿيلين بلو جو مجموعي طيفي تجزيو ڊائمر جي وڌ ۾ وڌ چوٽي 607 nm تي ۽ وڌيڪ ماليڪيولن واري مجموعي جي چوٽي 600 nm تي الڳ ڪري ڏيکاري ٿو، جڏهن ته مونومر جا گونج وارا جزا 664 ۽ 650 nm تي آهن. ان جو مڪمل متن PMID 33251415 جي کليل رسائي واري رڪارڊ ذريعي موجود آهي.

ان ڪلهي کي خالص ڊائمر جو جذب مقدار نه چوڻ گهرجي. مونومر جي ارتعاشي-اليڪٽرانڪ بناوت به ساڳئي علائقي ۾ حصو وجهي ٿي، تنهنڪري ماپيل اوچائي ڪيترن حصن جو گڏيل نتيجو آهي. هڪ مجموعي فِٽ ۾ معلوم ٿيو ته مونومر ۽ ڊائمر وارو ماڊل 1.1 micromolar کان 3.4 millimolar تائين پوري حد تي ناڪام ٿيو، جڏهن ته ٽيٽرامر شامل ڪرڻ سان سڀ کان بهتر فِٽ مليو؛ ٽيٽرامر جو سگنل 34 micromolar کان هيٺ به معلوم ٿي سگهيو ٿي. فِٽ ڪيل جزن جا ضريب وڏا هئا: مکيه مونومر جزو لاءِ 664 nm تي لڳ ڀڳ 107,800 M-1 cm-1، ڊائمر لاءِ 607 nm تي لڳ ڀڳ 101,400، ۽ ٽيٽرامر لاءِ 600 nm تي لڳ ڀڳ 138,500؛ اهي ماپون بفر کان سواءِ آئنن کان پاڪ پاڻيءَ ۾، سوڊيم ڪلورائيڊ 0 کان 0.15 M ۽ گرمي پد 282 کان 333 K تي ڪيون ويون. اهي ماڊل ذريعي الڳ ڪيل حصا آهن، تنهنڪري انهن کي تجرباتي بيئر–ليمبرٽ ڍلان جي جاءِ تي استعمال نه ڪرڻ گهرجي.

ڊائمر ٺهڻ جي شدت سڌيءَ طرح مقداري طور ماپي وئي آهي. pH 6.86 ۽ 293 K تي، هڪ مطالعي ڊائمر ٺهڻ جو مستقل لڳ ڀڳ 3,900 M-1 حاصل ڪيو. اهو مقدار سمجهائي ٿو ته 5 micromolar ڪم ڪندڙ محلول ڇو لڳ ڀڳ خطي رويو ڏيکاري ٿو، جڏهن ته 50 micromolar اسٽاڪ محلول ائين نٿو ڪري. طريقي جي تياري دوران هڪ ڪارائتي جاچ 610 nm جي ويجهو جذب مقدار جو 665 nm جي ويجهو جذب مقدار سان تناسب آهي. جڏهن اهو تناسب ڪنسنٽريشن سان وڌي ٿو، تڏهن 664 nm تي ايپسيلون هاڻي هڪ اڻبدلجندڙ ماليڪيولي صورت جي وضاحت نٿو ڪري.

ڪنسنٽريشن جي اهڙي حد ۾، جتي هڪ ٻئي ۾ بدلجندڙ ٻن صورتن جو جوڙو غالب هجي، طيفن ۾ هڪ گڏيل آئسوسبيسٽڪ نقطو ٿي سگهي ٿو، جيڪو آبي سلسلن ۾ تجرباتي طور لڳ ڀڳ 625 nm تي ڏٺو ويو آهي. هڪ صاف، اڻچرندڙ نقطو ٻن غالب ماليڪيولي صورتن سان مطابقت رکي ٿو. جڏهن ڪنسنٽريشن وڌڻ سان اهو نقطو سرڪي يا غائب ٿي وڃي، ته ان کي اوزار جي غلطي نه، پر ان خبرداري طور وٺو ته وڌيڪ ماليڪيولن وارا مجموعا يا بدلجندڙ توازن شامل ٿي ويا آهن.

محلل، pH ۽ گرمي پد طيف کي بدلائين ٿا

پاڻي ماليڪيولن جي گڏجڻ کي هٿي ڏئي ٿو. پاڻي ۽ DMSO جي ملاوٽن ۾ ميٿيلين بلو بابت محلل جي مطالعي موجب، ڊاءِميٿيل سلفوڪسائيڊ شامل ڪرڻ سان ڊائمر ٺهڻ گهٽجي ٿو، جذب ۽ فلوريسنس جون وڌ ۾ وڌ چوٽيون وڌيڪ ڊگهي موج ڏانهن سرڪن ٿيون، ۽ فلوريسنس جي ڪوانٽم حاصل لڳ ڀڳ چار ڀيرا وڌي ٿي؛ هن ڪم جو اندراج PMID 30933781 طور ٿيل آهي. اهو ڪم آبي طيفن کي مونومر ۽ ڊائمر جي توازن طور ڏسي ٿو، جنهن ۾ مونومر جو جذب لڳ ڀڳ 650 کان 670 nm ۽ ڊائمر جو جذب لڳ ڀڳ 580 کان 615 nm تي هوندو آهي، ۽ 293.15 K تي طيفن مان ڊائمر ٺهڻ جا مستقل ڪڍي ٿو.

الڪوحل جاءِ ۽ ظاهري شدت ٻنهي کي بدلائين ٿا، پر ماليڪيولن جو گڏ ٿيڻ ختم نٿا ڪن. 31.3 micromolar ۽ ڪمري جي گرمي پد تي ڪيل هڪ بنيادي ڀيٽ ۾، جيڪا ميٿيلين بلو جي محللن بابت هڪ مطالعي ۾ ڄاڻايل آهي، ڊگهي موج واري وڌ ۾ وڌ چوٽي پاڻيءَ ۾ 665 nm، پر ميٿانول ۾ 655 nm هئي؛ سڄي محلول جا ظاهري قدر پاڻيءَ ۾ لڳ ڀڳ 37,100 ۽ ميٿانول ۾ 60,800 هئا. 298 K تي خالص، پاڻيءَ کان پاڪ ايٿانول ۾ هڪ الڳ تصديق 655 nm تي وڌ ۾ وڌ چوٽي ۽ لڳ ڀڳ 68,000 ايپسيلون ڏنو.

عام pH جون تبديليون طيف کي ڪيترن طريقه ڪار ۾ فرض ڪيل مقدار کان گهٽ بدلائين ٿيون. مٿي ڏنل تنقيدي جائزي موجب، لڳ ڀڳ pH 2 کان pH 12 تائين وڌ ۾ وڌ چوٽي 665 nm جي ويجهو رهي، ۽ pH 11 تائين شدت ۾ رڳو ننڍيون تبديليون آيون. بفر جو قسم ۽ آئنڪ طاقت نتيجن کي ڄاڻايل pH جيترو ئي بدلائي سگهن ٿا، تنهنڪري رڳو pH ميٽر جي پڙهت نه، پر اصل بفر ۽ لوڻ به درج ڪريو. تيز تيزاب يا تيز الڪلي الڳ صورت آهي، ڇاڪاڻ ته رنگ ۾ موٽڻ لائق ماليڪيولي گڏجڻ بدران ڪيميائي تبديلي اچي سگهي ٿي. گرمي پد ۽ لوڻ به توازن بدلائين ٿا، ان ڪري 2020 واري پاڻيءَ جي مطالعي ۾ ٻنهي کي ڄاڻي واڻي بدلايو ويو.

اهڙي ماپ ڪرڻ، جو انگ معتبر رهي

مقداري ڪم بيئر–ليمبرٽ لاڳاپي تي ٻڌل آهي: جذب مقدار برابر آهي ايپسيلون ضرب ڪنسنٽريشن ضرب نوري رستي جي ڊيگهه؛ ان سان گڏ اهو ثبوت به ضروري آهي ته توهان جي شرطن هيٺ خطي حد واقعي برقرار آهي.

گهٽ micromolar سطح تي ڪم لاءِ 1 cm سيل استعمال ڪريو. ايپسيلون لڳ ڀڳ 82,000 هجي ته 5 micromolar تي جذب مقدار لڳ ڀڳ 0.41 ۽ 10 micromolar تي لڳ ڀڳ 0.82 ٿيندو. سادي پاڻيءَ ۾ مونومر تي ڌيان ڏيندڙ ماپ لاءِ، لڳ ڀڳ 5 کان 7 micromolar جي ويجهو يا ان کان هيٺ رهڻ، ڏهاڪن micromolar تائين ڪيلبريشن ڪرڻ کان وڌيڪ محفوظ آهي. وڌيڪ ڪنسنٽريشن وارن اسٽاڪ محلولن لاءِ، 1 کان گهڻو مٿي جذب مقدار قبول ڪرڻ بدران نوري رستو ننڍو ڪريو.

بلينڪ لاءِ ساڳي پسمنظر واري ترڪيب استعمال ڪريو: ساڳئي گريڊ جو پاڻي، گڏيل محلل جو ساڳيو حصو، ساڳيو بفر ۽ ساڳيا لوڻ، پر رنگ کان سواءِ. ڪيلبريشن جا معيار به ساڳي ترڪيب ۾، ساڳئي گرمي پد تي تيار ڪريو. طريقي جي تياري دوران، رڳو هڪ موج جي ڊيگهه پڙهڻ بدران پوري ڏسڻ لائق حد اسڪين ڪريو، بهتر طور لڳ ڀڳ 550 کان 750 nm. رڳو اوچائي نه، شڪل به ڏسو. جيڪڏهن مرحليوار رقيق ڪرڻ سان نارملائيز ڪيل شڪل بدلجي ٿي، ته نظام ڪيميائي طور ڪنسنٽريشن تي دارومدار رکي ٿو. هڪ مستحڪم وڌ ۾ وڌ چوٽي ۽ 610 کان 665 nm جو مستحڪم تناسب، رڳو وڏي R اسڪوائر قدر جي ڀيٽ ۾، قابلِ قبول حد لاءِ وڌيڪ مضبوط ثبوت آهن.

ري ايجنٽ جي صورت دستاويز ڪريو. تجارتي مواد پاڻيءَ کان پاڪ ميٿيلٿائونينيم ڪلورائيڊ يا ٽراءِهائيڊريٽ جهڙو هائيڊريٽ ٿي سگهي ٿو، تنهنڪري اسٽاڪ جي حسابن لاءِ استعمال ٿيندڙ مولر ماس اصل بوتل جي مواد سان ملڻ گهرجي. هي قدم اڪيلو ئي مختلف ليبارٽرين جي ڄاڻايل مولر ڪنسنٽريشنن ۾ اختلاف جو ڪجهه حصو سمجهائي ٿو. اهڙي ئي پابندي تڏهن به لاڳو ٿئي ٿي، جڏهن نتيجا مقداري جاچ جي حسابن ۾ استعمال ٿين، جڏهن طيف فارموليشن جي استحڪام جي جاچ کي سهارو ڏين، ۽ جڏهن ناخالصين جي پروفائلن لاءِ خالصيت ۽ مقرر معيارن جو جائزو گهربل هجي.

شرطن سان نشان لڳل خلاصو

هن جدول کي ليبارٽري رڪارڊ لاءِ شروعاتي نموني طور استعمال ڪريو، نه هڪ ٻئي جي جاءِ تي استعمال ٿيندڙ مستقلن جي ذريعي طور.

تنهنڪري ميٿيلين بلو جي جذب واري موج جي ڊيگهه هڪ مختصر جواب آهي، پر ان سان ڊگهو وضاحتي نوٽ جڙيل آهي. جيڪا چوٽي توهان ماپي، جنهن محلول ۾ ماپي، ۽ جنهن ڪنسنٽريشن تي ماپي، اهي سڀ ڄاڻايو. اها عادت گهٽ ڪنسنٽريشن واري آبي محلول ۾ 664 nm جي ويجهو هڪ قدر کي غلط آفاقي مستقل بڻجڻ کان روڪي ٿي.