د مېتیلین بلو په تجربو کې د اکسیجن د غبرګون‌منونکو ډولونو اندازه کول

دوه لابراتوارونه داسې تجربه ترسره کوي چې هر یو یې د مېتیلین بلو د انټي‌اکسیډنټ تجربه بولي. یو راپور ورکوي چې دا رنګ د اکسیجن غبرګون‌منونکي ډولونه کموي. بل راپور ورکوي چې رنګ یې تولیدوي. دواړه د دوز او غبرګون روښانه منحني ګانې وړاندې کوي. دواړه په رښتینولۍ کار کوي. توپیر نه درغلي ده او نه بې‌کفایتي. خبره دا ده چې دواړو ډلو د بېلې رڼا لاندې بېل شیان اندازه کړي، داسې پروبونه یې کارولي چې بېلې پوښتنې ځوابوي، او بیا یې دواړه ځوابونه په یوه کلمه بیان کړي: ROS.

د مېتیلین بلو دقیق اندازه کول ځکه ستونزمن دي چې دا مالیکول په هغه کیمیاوي بهیر کې برخه اخلي چې تمه کېږي وڅارل شي. په تیاره کې الکترونونه د ورکوونکو او منونکو ترمنځ لېږدوي او بېرته خپل لومړني شکل ته راګرځي، څو بیا دا دوره تکرار کړي. د رڼا لاندې د رڼا حساس کوونکی ګرځي او پارېدلي ټرېپلېټ حالت ته رسېږي؛ له هغه حالته اکسیجن ته انرژي سپارلی شي چې سېنګلېټ اکسیجن جوړ کړي، یا الکترونونه لېږدولی شي چې رادیکالونه او هایدروجن پراکسایډ جوړ کړي. هر پروب چې دې سیستم ته ورزیات شي، پخپله د رنګ له خوا اکسیدېدای، احیا کېدای، بې‌رنګېدای یا یې نوري سیګنال پټېدای شي. نو د هرې ROS لوستنې لومړۍ پوښتنه هېڅکله دا نه ده چې شمېره څو ده. پوښتنه دا ده چې ازموینه په حقیقت کې څه کشفوي او رنګ پر ازموینه څه اغېز کوي.

Amplex Red: د هایدروجن پراکسایډ کالیبره شوې ازموینه

د مېتیلین بلو او Amplex Red ترکیب په دې علمي څېړنو کې، که سم برابر شي، تر ټولو د دفاع وړ جوړه ده. کیمیا یې ځانګړې ده: د هارس‌رېډېش پراکسیدېز انزایم هایدروجن پراکسایډ کاروي څو د Amplex سبسټریټ په فلورېسنت محصول، رېزوروفین، واړوي؛ د تعامل سټوکیومېټري نږدې یو پر یو ده. د نمونې پراکسایډ په کشفوونکي کې په فلورېسنس بدلېږي. د ROS د معمولې کورنۍ هېڅ بل غړی دا تعامل په مستقیم ډول نه پر مخ وړي.

فیصله کوونکې ګټه یې کالیبراسیون دی. یو دقیق څېړونکی د پراکسایډ معلوم معیارونه په هماغه بفر کې، د پراکسیدېز او سبسټریټ په هماغو غلظتونو، د انکیوبېشن په هماغه موده او په هماغو نوري تنظیماتو کې ازمويي، بیا د نمونو لوستنې له هغې منحني سره پرتله کوي. د مغز د جلا شوو میتوکندریاوو په هغه څېړنه کې چې د دې میتود بنسټ جوړوي، لیکوالانو همدا کار وکړ: د هر ځل ازموینې په پای کې یې د پراکسایډ معلوم مقدارونه ورزیات کړل، او شمېرې یې د فلورېسنس د اختیاري واحدونو پر ځای په یوه دقیقه کې د پروټین پر هر ملي‌ګرام د پیکومولونو د نرخ په توګه راپور کړې. همدا کار یو ځلا په اندازه کولو بدلوي.

د هغې څېړنې درې جزئیات د پیروي وړ دي. لومړی، لیکوالانو سیګنال د کاتالېز په وسیله تایید کړ، چې پراکسایډ تجزیه کوي. د مېتیلین بلو له امله د فلورېسنس زیاتوالی د کاتالېز له ورزیاتولو سره ودرېد؛ دې تایید کړه چې سیګنال د پراکسایډ و، نه یو نوري مصنوعي اغېز. دویم، هغوی د پاروونکې رڼا د وړانګې په محدودولو سره د رڼا اغېز مستقیم وازمایه، څو نمونو ته د عادي رڼا دوز اتمه برخه ورسېږي؛ سیګنال یوازې نهه سلنه راکم شو. د راپور شوي پراکسایډ له نوي سلنې ډېره برخه د اندازه کولو له رڼا څخه خپلواکه وه. درېیم، هغوی د پراکسایډ له منځه تګ په جلا توګه په الکترود اندازه کړ او وموندله چې رنګ هم تولید زیاتوي او هم لرې کېدل ورو کوي. هغه پروب چې یوازې خالص فلورېسنس راپوروي، دا دواړه اغېزې به سره ګډې کړې وای.

ازموینه بیا هم د ناسمو پایلو د رامنځته کېدو لارې لري، او مېتیلین بلو له څو داسې لارو اغېز پرې کوي. رنګ د طیف په هماغه سره سیمه کې په پراخه کچه رڼا جذبوي چې رېزوروفین پکې رڼا خپروي؛ نو د رنګ په لوړو غلظتونو کې نمونه د داخلي فلټر د اغېزو له لارې خپل سیګنال پټولی شي. له همدې امله معیارونه باید د نمونو په شان د رنګ غلظت ولري. Amplex Red پخپله هم د رڼا له امله اکسیدېدای شي، او محصول یې، رېزوروفین، د رڼا په وسیله د اکسیدېشن او احیا دورو ته ننوتلی شي چې سوپراکسایډ او پراکسایډ تولیدوي. دا هغه وخت ډېر مهم دي چې تجربه د رڼا حساس کوونکی هم روښانوي. عملي حل دا دی چې لومړی د مېتیلین بلو نمونې تر وړانګو لاندې ونیول شي، بیا د نمونو جلا شوې برخې په تیاره کې د Amplex له معرفونو سره وازمویل شي، نه دا چې رنګ او پروب یوځای روښانه شي. په پای کې، سوپراکسایډ ډیسمیوټېز یوازې د Amplex سیګنال نه کموي: په پراکسایډ د سوپراکسایډ بدلول یې زیاتولی شي. د SOD هغه کنټرول چې فلورېسنس زیاتوي، ناکام شوی نه دی. هغه سوپراکسایډ د بهیر د مخکیني ډول په توګه پېژندلی دی.

DCFDA: د غیرځانګړي اکسیدېشن شاخص

د مېتیلین بلو او DCFDA جوړه د ډېری ګډوډۍ سرچینه ده. DCFH-DA یو مخکینی مرکب دی چې حجرې ته داخلېږي. د حجرې دننه اېسټرازونه یې د اسېټېټ ډلې لرې کوي او غیر فلورېسنت DCFH پاتې کېږي؛ د DCFH اکسیدېشن بیا فلورېسنت DCF جوړوي. هغه مواد چې دا اکسیدوي، اوږد لېست لري: هایدروکسیل رادیکالونه، د پراکسیدېز او هیم منځني مرکبات، نایتروجن ډای‌اکسایډ، هایپوکلوروس اسید او له پراکسي‌نایټرایټ څخه رامنځته شوي رادیکالونه. یوازې هایدروجن پراکسایډ دا په مستقیم ډول په کوم ګټور سرعت نه اکسیدوي؛ پر پراکسایډ پورې تړلی فلورېسنس عموماً په بهیر کې اوسپنې، هیم پروټینونو یا د پراکسیدېز کیمیا ته اړتیا لري.

هغه نقد چې د هرې مقالې د میتودونو برخه یې باید حواله کړي، د کالیانارامان او همکارانو له خوا د پروب په توګه د DCFH له شننې څخه راځي، لکه څنګه چې د مغز د میتوکندریاوو په هغې څېړنه کې لنډیز شوی چې د همدې دلیل له امله یې DCFDA رد کړ. هغوی وښودله چې دا رنګ ورو تعامل کوي، د تعامل سټوکیومېټري یې نه ده مشخصه شوې، معتبر کالیبراسیون نه لري او له هغو مرکباتو سره هم تعامل کوي چې ROS نه دي. پروب هغه څه هم پیاوړي کوي چې اندازه کوي یې: د DCFH یو-الکتروني اکسیدېشن د DCF رادیکال جوړوي، چې له اکسیجن سره تعامل کوي او سوپراکسایډ جوړوي؛ سوپراکسایډ بیا د ډیسمیوټېشن له لارې اضافي پراکسایډ تولیدوي. په دې توګه، لوستنه تر یوه حده هغه کیمیا پخپله رامنځته کوي چې راپوروي یې.

له دې ټولو څخه هېڅ یو DCFDA بې‌ګټې نه ګرځوي. دا یې د لومړنۍ پلټنې وسیله ګرځوي، نه د پېژندنې وسیله. د DCF د فلورېسنس زیاتوالی معنا لري چې پر اکسیدوونکي پورې تړلی د پروب اکسیدېشن زیات شوی. دا معنا نه لري چې پراکسایډ زیات شوی، او خامخا دا معنا هم نه لري چې ټول ROS زیات شوي؛ داسې ټولیز مقدار هېڅ یو پروب نه اندازه کوي. د مېتیلین بلو پخوانیو څېړنو چې له یوه مایکرومولار څخه پورته یې د DCF پر اکسیدېشن تکیه کوله، اکسیدېشن‌پاروونکې اغېزې راپور کړې، حال دا چې د هماغې دورې نورو سیستمونو د پراکسایډ له امله د حجرې د مړینې پر وړاندې ساتنه راپور کړه. دواړه مشاهدې په بېلو اکسیدېشن-احیا شرایطو کې د هماغه رنګ لپاره سمې کېدای شي، او یوازې د DCF پایله نه شي ویلای چې کوم اکسیدوونکي سیګنال رامنځته کړی و. د مغز د میتوکندریاوو د پخوانۍ څېړنې اهمیت په دې کې دی چې دې لومړنۍ پلټنې ته یې د پراکسایډ کالیبره شوې اندازه‌ګیري بدیله کړه او اغېز یې په مستقیم ډول وموند: حتی سل نانومولار رنګ هم په هر ازمویل شوي سبسټریټ او تنفسي حالت کې د پراکسایډ خوشې کېدل څو چنده زیات کړل.

DCFDA د مېتیلین بلو اړوند یوه بله ځانګړې دام هم لري. رنګ ډېر څرګند رنګین او د اکسیدېشن او احیا له پلوه فعال دی؛ نو کولای شي فلورېسنس بې‌رنګه کړي، د رڼا خپرېدل کم کړي، یا د حجروي ROS څخه خپلواک د پروب کیمیا اکسید کړي. بې‌حجرو کنټرول چې رنګ او پروب ولري خو حجرې پکې نه وي، اختیاري سینګار نه دی. دا هغه تجربه ده چې درته وایي ایا رنګ له پروب سره تعامل کوي که نه.

د سپین نیونه او د اکسیجن مصرف: پېژندنه او بهیر

چېرې چې فلورېسنت پروبونه راپور ورکوي چې یو اکسیدېدونکی شی راڅرګند شوی، د سپین نیوونکو په کارولو د الکتروني سپین رېزونانس هغه څه ته نږدې معلومات ورکوي چې دا شی په حقیقت کې څه و. د مېتیلین بلو د رڼا-کیمیا کلاسیکې څېړنې ESR وکاراوه څو له رنګ، اسکوربېټ او رڼا څخه د اسکوربېټ رادیکال کشف کړي، بیا یې د اکسیجن د مصرف په تجربو کې د پراکسایډ جوړېدل او د سپین نیونې په ازموینو کې د اوسپنې په کتلېز د هایدروکسیل رادیکال جوړېدل وښودل. هر تخنیک هغه پوښتنه ځواب کړه چې نورو نه شوای ځوابولی: ESR د رادیکال پېژندنه وکړه، د اکسیجن مصرف د هر ډول فلورېسنت پروب څخه خپلواک د تعامل بهیر وښود، او ګډو پایلو وښودله چې د سېنګلېټ اکسیجن او رادیکال دواړه لارې په هماغه روښانه شوي سیستم کې فعالې وې.

د 1984 هغه پایله لا هم د خبرداري د نښې په څېر لوستل کېږي. د رڼا او احیا کوونکي په شتون کې رنګ پراکسایډ تولید کړ، او د اوسپنې په شتون کې سیستم د هایدروکسیل رادیکال تولید کړ، چې د دې ډلې تر ټولو غبرګون‌منونکی ډول دی. لیکوالانو دا د سترګې له اسکوربېټ سره وتاړه او په سترګو کې یې بې‌احتیاطه کارول تر پوښتنې لاندې راوستل. د نن ورځې لوستونکي باید شرایط په پام کې ونیسي: رڼا جمع احیا کوونکی جمع اوسپنه. له دې څخه هر یو لرې کړئ، لاره کمزورې کېږي یا له منځه ځي.

د اکسیجن الکترودونه په بېل ډول خپل ارزښت ثابتوي. د کلارک ډوله الکترود د اکسیجن خالص مصرف اندازه کوي؛ دا ثابتوي چې د رنګ له خوا پرمخ وړل کېدونکې د اکسیدېشن او احیا کیمیا مالیکولي اکسیجن مصرفوي او د تعامل د سرعت داسې معلومات ورکوي چې هېڅ نوري مصنوعي اغېز یې نه شي جعل کولای. خو محصول نه پېژني. د پراکسایډ، سوپراکسایډ او اوبو جوړېدل، او د سېنګلېټ اکسیجن د زوال بهیر، ټول اکسیجن مصرفوي. بې له پېژندنې د بهیر اندازه دومره نیمګړې ده لکه بې له بهیره پېژندنه؛ له همدې امله پیاوړې مقالې الکترود د پراکسایډ له کالیبره شوې ازموینې یا یوه نیوونکي سره یوځای کاروي.

ولې د انټي‌اکسیډنټ پایلې سره ټکر لري

دا درې لوستنې څنګ په څنګ کېږدئ؛ د مېتیلین بلو په علمي څېړنو کې ظاهري تضادونه د میتودونو په توپیرونو او دریو بیولوژیکي واقعیتونو بدلېږي.

لومړی، رنګ هم د الکترون لېږدوونکی دی او هم د پراکسایډ سرچینه. د هغو تنفسي ځایونو څخه د الکترونونو په اړولو سره، چې که داسې ونه شي اکسیجن به پکې په سوپراکسایډ بدل شي، کولای شي د ROS یو ډول کم کړي؛ په عین وخت کې یې احیا شوی شکل اکسیجن په مستقیم ډول په پراکسایډ احیا کوي او بل ډول زیاتوي. نو هغه لابراتوار چې له میتوکندریایي اکسیدېشن-احیا کیمیا او په بدیله لاره د الکترونونو په لېږد کې د رنګ له رول سره کار کوي، باید پر پروب پورې تړلو ځوابونو ته تمه ولري: په هماغه کیوېټ کې د سوپراکسایډ حساسه لوستنه کمېږي، خو د پراکسایډ لوستنه زیاتېږي.

دویم، پراکسایډ په ټیټو دوزونو کې یو سیګنال دی، نه یوازې زیان. د موږک د مغز د میتوکندریاوو هغې څېړنې چې له پخواني کار وروسته ترسره شوه، له یوازې پنځوس نانومولار رنګ څخه د پراکسایډ تولید وموند، په داسې حال کې چې په درملیزو کچو کې د میتوکندریایي DNA زیانونه نه وو؛ د مخکینۍ درملنې وروسته د روټېنون له امله د رامنځته شوو زیانونو پر وړاندې ساتنه هم موجوده وه. یوازې په سل مایکرومولار کې، چې له درملیز حد څخه ډېر لوړ دی، رنګ د DNA ټاکلو ټوټو ته زیان ورساوه؛ او سرې رڼا له شل مایکرومولار رنګ سره سېنګلېټ اکسیجن تولید کړ چې ټولو ازمویل شوو ټوټو ته یې زیان ورساوه. وړاندیز شوی میکانیزم هورمېټیک دی: د پراکسایډ لږ تولید له Nrf2 سره تړلي انټي‌اکسیډنټ دفاعي بهیرونه او د میتوکندریاوو نوې جوړېدنه راپاروي؛ نو لنډمهاله اکسیدېشن‌پاروونکې لوستنه له اوږدمهاله انټي‌اکسیډنټ پایلې مخکې راځي. یوه ازموینه چې په یوه ساعت کې لوستل کېږي او بله چې په یوه ورځ کې لوستل کېږي، سره مخالفې پایلې ورکولای شي، ځکه د دواړو ترمنځ بیولوژیکي حالت بدل شوی وي.

درېیم، رڼا ټاکي چې اصلاً کوم مالیکول موجود دی. رڼا د رنګ مېتیل ډلې لرې کوي او هغه د Azure B او اړوندو محصولاتو پر لور بدلوي؛ پر یوه لوښي د مایکروسکوپ څراغ هم کافي دی چې رنګ د رڼا حساس کوونکی کړي. په تیاره او رڼا کې تجربې بېلې تجربې دي، او د هر پروتوکول د رڼا او د رنګ د سمبالولو کنټرولونو برخه باید همداسې چلند ورسره وکړي.

د کنټرولونو لږ تر لږه ټولګه، او د هرې ادعا د لوستلو څرنګوالی

لاندې پرتله د دې مقالې اصلي مرجع جدول دی. مخکې له دې چې د مېتیلین بلو د ROS کومه پایله ومنئ، وګورئ چې لیکوالانو کوم قطار بشپړ کړی او کوم یې پرېښی دی.

له دې څخه د لوستلو یوه عملي قاعده راوتلې ده. Amplex چې له پراکسیدېز سره وي، کالیبره شوی وي او د کاتالېز په وسیله تایید شوی وي، د پراکسایډ په اړه شواهد دي. DCFDA د پروب د غیرځانګړي اکسیدېشن په اړه شواهد دي او تر دې زیات څه نه دي. د رادیکالونو د خنثی کوونکو له کنټرولونو سره د سپین نیونه د رادیکال د پېژندنې په اړه شواهد دي. د اکسیجن مصرف د بهیر په اړه شواهد دي. هغه جمله چې د خپلې ازموینې له ملاتړ څخه زیاته ادعا کوي، که په هر څومره ډاډ لیکل شوې وي، د پروب په اړه جمله ده، نه د رنګ په اړه. پر دوز د تړاو او هورمېټیک حد، د میتوکندریایي الکترونونو د بهیر، په رنګ شوو نمونو کې د ازموینې د مداخلې او په مایکروسکوپي کتنه کې د رڼا د مصنوعي اغېزو اړوند بحثونه د دغو ټکو هر یو لا پسې غځوي، او هر یو یې د خپلې موقتي حوالې له بدلولو وروسته هم معتبر پاتې کېږي.