د متیلین بلو د میتوکونډریایي اغېزو اندازه کول: اکسیجن، ATP او غشایي پوتنسیال

فرض کړئ چې یو لابراتوار هغو میتوکونډریاوو ته متیلین بلو ورزیاتوي چې تنفس یې زیانمن شوی وي، او ویني چې د اکسیجن مصرف لوړېږي. په طبیعي ډول به داسې ولیکل شي چې رنګ د میتوکونډریا فعالیت بېرته رغولی دی. دا جمله ښايي ناسمه وي. د اکسیجن بهیر، د ATP جوړېدل او غشایي پوتنسیال درې جلا مفاهیم دي. دوی په یوه حجره‌يي غړي کې داسې ګډ ځای لري لکه شاتړ، همغږي کول او شریکول چې په یوه کلاوډ فولډر کې ګډ ځای لري: سره تړلي دي، خو بېل اصول پرې واکمن دي. که یو د بل پر ځای وګڼئ، تفسیر ناسمېږي، که څه هم هره اندازه‌ګیري له تخنیکي پلوه سمه وي.

متیلین بلو دا ګډوډي ډېر احتمالي کوي، ځکه په هغه سیستم کې خپله برخه اخلي چې اندازه کوي یې. دا د رېډوکس دورې چلوونکی دی چې د مسیر په مخکینۍ برخه کې الکترونونه مني او په وروستنۍ برخه کې یې ورکوي؛ په غوړو کې حل کېدونکی کاتیون دی چې په انرژي لرونکو میتوکونډریاوو کې راټولېږي؛ او یو په شدت آبي مرکب دی چې په هغو طیفي بانډونو کې رڼا جذبوي او خپروي چې عام پروبونه پکې کار کوي. یوه لوستنه دا ټول بار نشي وړلی. د بوډاپېسټ د میتوکونډریایي څېړنو په لړ کې ښودل شوې باوري کړنلاره دا ده چې د اکسیجن بهیر، د ATP د جوړېدو کچه، غشایي پوتنسیال او د هایدروجن پراکسایډ خوشې کېدل یوځای اندازه شي، او په هر پړاو کې د رنګ ځانګړي کنټرولونه وکارول شي.

د تنفس سنجونه د اکسیجن بهیر اندازه کوي، نه د انرژۍ تولید

د لوړ تفکیک تنفس سنجونه، که د Oroboros Oxygraph په وسیله وي یا د Seahorse د حجرې بهر بهیر شنونکي په وسیله، یوازې یو څه ښيي: اکسیجن په څومره چټکۍ راکمېږي. دا نه ښيي چې د هر الکترون په بدل کې څومره پروتونونه پمپ شوي، څومره تدریجي توپیر ساتل شوی، یا دا چې ATP سنتاز ترې ګټه اخیستې ده که نه.

اصطلاحات مهم دي. په جلا شویو میتوکونډریاوو کې، له ADP پرته سبسټریټ د لیک تنفس ورکوي، له اشباع کوونکي ADP سره سبسټریټ د اکسیداتي فاسفوریلېشن ظرفیت ورکوي، او د بېلوونکي ماده تدریجي زیاتول د الکترون لېږد اعظمي ظرفیت ورکوي. په بشپړو حجرو کې د Seahorse اړوند معادلونه بنسټیز تنفس، له ATP سره تړلی او د اولیګومایسین پر وړاندې حساس تنفس، د پروتون لیک، د FCCP په وسیله ټاکل شوی اعظمي تنفس، او د روټینون او انټیمایسین پر وړاندې مقاوم غیرمیتوکونډریایي اکسیجن مصرف دي. د Seahorse پایلو ته State 3 او State 4 ویل داسې دقت ورپورې تړي چې دغه چمتو شوی سیستم یې ملاتړ نه کوي، لکه څنګه چې د Agilent Mito Stress Test چوکاټ روښانه کوي.

متیلین بلو د ډېر اکسیجن او ډېرې انرژۍ ترمنځ ظاهراً بدیهی تړاو ماتوي. د ګیني پګ د مغز په جلا شویو میتوکونډریاوو کې، له 100 nM څخه تر 1 uM پورې رنګ د ګلوټامیټ او مالېټ، سوکسینېټ او الفا-ګلیسروفاسفېټ سبسټریټونو په شتون کې د استراحت پر مهال د اکسیجن مصرف لوړ کړ؛ له الفا-ګلیسروفاسفېټ سره زیاتوالی نږدې 64 سلنه و. خو په روغو میتوکونډریاوو کې د ADP له خوا هڅول شوی تنفس په اصل کې بې‌بدلونه پاتې شو، لکه د مغز د جلا شویو میتوکونډریاوو څېړنه چې ښيي. ځکه چې لیک لوړ شو خو د ADP له خوا هڅول شوی بهیر ثابت پاتې شو، محاسبه شوی د تنفسي کنټرول نسبت راټیټېږي. دا کمښت په دې معنا نه دی چې رنګ میتوکونډریاوو ته زیان رسولی دی. معنا یې دا ده چې رنګ پر عادي تنفس سربېره د اکسیجن مصرفوونکې رېډوکس دوره ورزیاته کړې ده. د متیلین بلو د اکسیجن مصرف هغه ازموینه چې یوازې زیاتوالی راپوروي، واقعي کیمیاوي بهیر یې اندازه کړی، خو د انرژۍ د ساتنې په اړه یې هېڅ نه دي ویلي.

د بېرته رغونې تجربې همدا توپیر په لویه کچه ښيي. کله چې کمپلکس I بند شوی و، د اکسیجن بهیر نږدې درې ځله بېرته لوړ شو، خو د ATP جوړېدل یوازې شاوخوا 1.5 ځله بېرته لوړ شول. الکترود ته ډېر اکسیجن ورسېد، خو لږه برخه یې د ATP په جوړېدو ولګېده. د اکسیداتي فاسفوریلېشن د ښه کېدو هره ادعا د ATP اړخ هم غواړي؛ غوره ده چې دا د اکسیجن پر واحد د ATP د نسبت په توګه څرګند شي او د مخرج د ټاکلو دود یې هم روښانه شي.

د ATP ازموینې د جوړېدو کچه اندازه کوي، چې مقدار یې ځای نشي نیولی

د ATP ازموینه یوې بلې پوښتنې ته ځواب ورکوي: په هر وخت واحد کې څومره ATP جوړېږي. یوه حرکتي لوستنه، که د څو دقیقو په اوږدو کې د اورمچ د لوسیفراز رڼا تعقیبول وي یا د هیکسوکیناز او ګلوکوز-6-فاسفېټ ډیهایډروجنیز ګډه ازموینه چې په 340 nm کې لوستل کېږي، د جوړېدو کچه ورکوي. په یوه وروستي وخت‌ټکي کې د ټول ATP اندازه‌ګیري مقدار ښيي، چې د جوړېدو او مصرف ترمنځ توپیر منعکسوي او په یوازې ځان د اکسیداتي فاسفوریلېشن په اړه ډېر لږ معلومات ورکوي.

د بوډاپېسټ ډلې ګډه انزایمي طریقه وکاروله، اډینیلېټ کیناز یې مهار کړی و، او وموندله چې متیلین بلو په 1 تر 2 uM کې په روټینون او انټیمایسین درملل شویو میتوکونډریاوو کې د ATP تولید لږ، خو په احصایوي لحاظ د پام وړ، لوړ کړ. دا رښتینې بېرته رغونه ده، خو جزوي ده. د TEGDMA د زهریت څېړنې په یوه بل ماډل کې هم ورته ډول ځواب ترلاسه کړ: د غاښونو 5 mM مونومر TEGDMA له کمپلکس I سره تړلی تنفس له نږدې 286 څخه 28 بهیر واحدونو ته راټیټ کړ، او 2 uM رنګ هغه بېرته نږدې 86 ته لوړ کړ.

له یوه رنګین رېډوکس مرکب سره دوه کنټرولونه حتمي دي. لومړی، اولیګومایسین وکاروئ څو معلومه شي چې د اندازه شوي ATP جوړېدو څومره برخه پر ATP سنتاز پورې تړلې ده. دویم، له حجرو پرته د معلوم مقدار د ورزیاتولو او بېرته موندلو ازموینه ترسره کړئ: معلوم ATP، بشپړ ریجنټ او د رنګ هماغه دقیق غلظتونه وکاروئ چې په ازموینه کې کارول شوي، لږ تر لږه 0، 100 nM، 300 nM، 1 uM او 2 uM. رنګ کولای شي خپره شوې رڼا جذب کړي، د نښې ورکوونکی انزایم مهار کړي، یا د ریجنټ رېډوکس کیمیا بدله کړي. د لوسیفراز د ازموینې عمومي لارښوونې د همدې ډول مداخلې لپاره بیوکیمیاوي مقابلې ازموینې سپارښتنه کوي. دا مه انګېرئ چې 1 uM له اندازه‌ګیريزې تېروتنې پاک دی، یوازې ځکه چې د رڼا کمزوري کول عموماً په لوړو غلظتونو کې شدید وي.

د غشایي پوتنسیال پروبونه د رنګ وېش اندازه کوي، نه بهیر

Safranine O، TMRM او TMRE، rhodamine 123 او JC-1 ټول له غشا تېرېدونکي کاتیونونه دي. دوی د الکتروکیمیاوي تعادل له مخې په منفي چارج لرونکي ماتریکس کې راټولېږي، نو عمومي فلورېسنس په غیرمستقیم ډول، د پروب د ځای له لارې، پوتنسیال ښيي. له دوی څخه هېڅ یو ATP یا د الکترون بهیر نه اندازه کوي.

هر پروب د چمتووالي یو مناسب ډول لري. Safranine O له جلا شویو میتوکونډریاوو او نفوذپذیرو شویو حجرو سره مناسب دی؛ عموماً شاوخوا 2 uM کارول کېږي، د تحریک څپې اوږدوالی یې نږدې 495 nm او د خپرېدو یې نږدې 585 nm وي. دا د فلورېسنس د کمزوري کولو په حالت کې کار کوي، چې پروب دننه اخیستل عمومي فلورېسنس بدلوي. TMRM او TMRE په بشپړو حجرو کې په ټیټ نانومولر بارولو او د فلورېسنس د نه کمزوري کولو حالت کې مناسب دي؛ په دې حالت کې ډیپولرایزېشن رنګ خوشې کوي او د میتوکونډریا فلورېسنس راټیټېږي. په لوړه اندازه بارولو کې د ځان‌کمزوري کولو له امله د سیګنال لوری سرچپه کېدای شي. JC-1 د شین او سور رنګ اسانه نسبت ورکوي، خو پر بارولو او د میتوکونډریاوو پر کتله پورې تړلی دی، چې د کمیتي کار لپاره یې د په دقت کنټرول شوي TMRM په پرتله کمزوری کوي. دا ګټې او محدودیتونه د میتوکونډریایي غشایي پوتنسیال د پروبونو په یوه پراخ کارېدونکې بیاکتنه کې لنډیز شوي دي.

متیلین بلو په هماغو کاري غلظتونو کې نوري مداخله کوي. له 600 څخه تر 665 nm پورې یې د جذب بانډونه د سرو پروبونو له خپرېدونکې رڼا سره پوښښ لري، نو د داخلي فلټر اغېزې، د فلورېسنس کمزوري کول او د تحریک رڼا جذب ټول د پام وړ احتمالات دي. رنګ همدارنګه یو دویم په غوړو کې حل کېدونکی کاتیون دی چې خپل وېش یې له هغه پوتنسیال سره بدلېږي چې اندازه کېږي. د مخنیوي لار څوګونې اندازه‌ګیري او تشې مرجع ازموینې دي: یوازې پروب، یوازې رنګ، پروب د رنګ له هر غلظت سره، د صفر مرجع په توګه د FCCP په وسیله بشپړ ډیپولرایزېشن، او غوره دا چې یو دویم، له نوري پلوه بېل پروب هم وکارول شي. د کمپلکس III د بدیل مسیر څېړنې دا مخینه جوړه کړه: د انټیمایسین او مایکسوتیازول تر مهار وروسته یې د غشایي پوتنسیال بېرته رغونه هم په safranine O او هم په TMRM تکرار کړه، او ورته کیفي رغونه یې ترلاسه کړه. یو نوري راپور ورکوونکی یوازې اشاره ده. دوه خپلواک راپور ورکوونکي شواهد دي.

درې چمتو شوي سیستمونه، درې بېلې پوښتنې

جلا شوې میتوکونډریاوې، نفوذپذیرې شوې حجرې او بشپړې حجرې د یوې ازموینې د حساسیت یو د بل پر ځای کارېدونکي تنظیمات نه دي. دا بېل مفاهیم دي چې بېل عملیاتي اصول لري.

جلا شوې میتوکونډریاوې د الکترون لېږد ځنځیر، داخلي غشا او د ماتریکس ماشینري ساتي، خو پلازمايي غشا، سایټوسول او شبکه‌يي جوړښت لرې کوي. همدا لرې کول یې موخه ده: سبسټریټونه، ADP، مهاروونکي او د رنګ غلظتونه په دقیق ډول ټاکل کېږي، نو یو مسیر مشخصېدای شي. بیه یې د طبیعي سبسټریټ رسونې، سیګنال ورکولو او تقاضا له لاسه ورکول دي.

نفوذپذیرې شوې حجرې میتوکونډریاوې د خپل حجره‌يي جوړښت په ډېره برخه کې دننه ساتي، خو له پرانیستل شوې پلازمايي غشا څخه بهرني سبسټریټونه او ADP پرېږدي چې تېر شي. دا په حجره‌يي چاپېریال کې د سبسټریټ-مسیر د نیمګړتیا د ټاکلو لپاره مناسبې وسیلې دي. تر اندازې زیات نفوذپذیر کول بهرنۍ غشا زیانمنوي، او سایټوسولي تنظیم د مینځلو پر مهال له منځه ځي.

بشپړې حجرې هر څه ساتي: د پلازمايي غشا خنډ، سایټوسولي راکموونکي مواد، د داخلي سبسټریټ لېږد، میتوکونډریایي شبکه او د ATP تقاضا. دوی فزیولوژۍ ته تر ټولو نږدې او د میکانیزم جلا کولو ته تر ټولو لرې دي، ځکه د رنګ دننه اخیستل، راکمېدل او په ځانګړو برخو کې ساتل ټول میتوکونډریا ته د رنګ اغېزمن رسېدل ټاکي.

د TEGDMA څېړنې درې واړه کچې په قصدي ډول وکارولې: د مغز جلا شوې میتوکونډریاوې د رنګ په وسیله د اکسیدېشن او پوتنسیال د بېرته رغونې لپاره؛ د غاښ د پالپ نفوذپذیرې شوې بنسټیزې حجرې تر ډېره د دې لپاره چې د زیان ځای له کمپلکس I سره تړلي سبسټریټ اکسیدېشن ته منسوب کړي؛ او بشپړې بنسټیزې حجرې د کم شوي اکسیجن مصرف پر وړاندې د 2 uM رنګ د ټولیز فزیولوژیکي اغېز لپاره. هغو لوستونکو ته چې په بېلابېلو چمتو شویو سیستمونو کې میتوکونډریایي لوستنې پرتله کوي، ملګری تشریحي مطلب چې متیلین بلو څنګه د تنفسي ځنځیر له لارې الکترونونه لېږدوي د مسیر شالید وړاندې کوي، او د متیلین بلو د تنفسي څېړنو د لوستلو لارښود د مقدار او مهاروونکو منطق تشریح کوي.

هغه کنټرولونه چې یو رېډوکس-فعال رنګ یې غواړي

د رېډوکس دورې چلوونکی د یوه عادي مهاروونکي په پرتله اوږد کنټرولي لېست غواړي، ځکه یوازې د رنګ کیمیاوي بهیر د بیولوژۍ په څېر پایلې ښودلای شي.

د تنفس سنجونې لپاره، د اندازې د تدریجي انحراف د معلومولو په موخه یوازې له بفر څخه ډکه خونه وازمویئ؛ له بیولوژیکي موادو پرته د بفر او رنګ خونه؛ رنګ له هر هغه حجرې بهر راکموونکي ماده سره چې په ازموینه کې شته؛ او په پای کې روټینون او انټیمایسین، څو په بشپړو حجرو کې غیرمیتوکونډریایي اکسیجن مصرف وټاکل شي. پام وکړئ چې راکم شوی رنګ اکسیجن ته د الکترونونو په لېږدولو سره بیا اکسیدېږي او هایدروجن پراکسایډ جوړوي. نو د الکترون ورکوونکي پرته یوازې د رنګ تشه مرجع ازموینه هغه بې‌حجروي اکسیجن مصرف کم اټکلوي چې د NADH یا NADPH له شتون سره څرګندېږي.

د هایدروجن پراکسایډ لپاره، د غیرانتخابي DCFDA رنګونو پر ځای کالیبره شوی Amplex UltraRed له horseradish peroxidase سره غوره کړئ، په کاتالاز یې تایید کړئ او پر روښانتیا یې تړاو وازمویئ، ځکه رنګ د رڼا حساس کوونکی دی. د مغز د میتوکونډریاوو څېړنې وموندله چې یوازې په 100 nM رنګ کې د پراکسایډ بار تر څلور ځله زیات لوړ شو، په داسې حال کې چې لرې کېدل یې ورو شول؛ پراکسایډ د راکم شوي رنګ له خوا نېغ په نېغه، له سوپراکسایډ منځګړي پرته، جوړېده. د پروب د ټاکنې او د رڼا د کنټرولونو جزییات د رنګونو په تجربو کې د اکسیجن د غبرګون‌منونکو ډولونو د اندازه کولو په ملګري مطلب کې دي، او دا پراخه پوښتنه چې پراکسایډ کله د سیګنال او کله د بار په توګه عمل کوي، د حجره‌يي رېډوکس توازن او د انټي‌اکسیدان ادعاوو ترڅنګ څېړل شوې ده.

د مسیر په اړه د ادعاوو لپاره، د کمپلکس III د مهار دواړه ځایونه وازمویئ: په Qi ځای کې انټیمایسین A او په Qo ځای کې مایکسوتیازول، او ورسره د سیانایډ په کارولو د کمپلکس IV وروستی کنټرول. د موږک د مغز یوې پخوانۍ څېړنې راپور ورکړی و چې رنګ د روټینون په وسیله بند شوی تنفس بېرته رغولی، خو د انټیمایسین په وسیله بند شوی تنفس یې نه و رغولی. وروسته په درې ډولونو ژوو کې شوې څېړنې له دواړو مهاروونکو سره جزوي رغونه او د سایتوکروم c د مستقیم راکمېدو شواهد وموندل. بدیل مسیر له نویو معلوماتو سره سازګار وبولئ، نه په قطعي ډول ثابت شوی؛ ځکه د رنګ غلظت، د مهاروونکي ځای، د سبسټریټ حالت او د رنګ وېش ټول لیدل شوی مسیر بدلوي.

د ازموینې د ټاکنې جدول

دا جدول وکاروئ څو د پوښتنې له مخې اندازه‌ګیري وټاکئ، نه برعکس.

د یوې قانع کوونکې ادعا لږ تر لږه اړتیا دا ده چې د رنګ هماغه غلظتونه، 100 nM، 300 nM، 1 uM او 2 uM، په دې ټولو کې وازمویل شي: د لیک، ADP، اولیګومایسین او بېلوونکي ماده په شرایطو کې د اکسیجن بهیر؛ د ATP د جوړېدو کچه؛ غشایي پوتنسیال، غوره ده چې په دوو پروبونو؛ او له کاتالاز او بې‌حجروي کنټرولونو سره د پراکسایډ کالیبره شوې خوشې کېدنه. تړلې ټولګه راپور کړئ: د اکسیجن بهیر، د ATP د جوړېدو کچه، د اکسیجن پر واحد ATP، پوتنسیال او پراکسایډ. له دغو شمېرو څخه هره یوه په یوازې ځان داسې اندازه‌ګیري ده چې لا د خپلې معنا په لټه کې ده.