मिथिलिन ब्लुको अवशोषण स्पेक्ट्रम र मोलर अवशोषकता: अवस्थाहरू खुलाइएको सन्दर्भ

मिथिलिन ब्लुको स्पेक्ट्रमबाट कुनै सङ्ख्या पुनः प्रयोग गर्न नखोज्दासम्म त्यो सरल देखिन्छ। एउटा प्रयोगशालाले मोलर विलुप्ति गुणाङ्क करिब 82,000 भएको बताउँछ। अर्कोले 67,000 बताउँछ। तेस्रोले 100,000 भन्दा बढी बताउँछ। यी तीनै आफ्ना मापनका सही विवरण हुन सक्छन्, तर कुनै पनि यस रङ्गद्रव्यको सार्वभौमिक स्थिराङ्क होइन।

यो अन्योल दुई फरक अवधारणालाई मिसाउँदा उत्पन्न हुन्छ। अवशोषणमान भनेको निश्चित सेलमा राखिएको निश्चित विलयनको मापन हो। मोलर अवशोषकता, जसलाई प्रायः एप्सिलोन लेखिन्छ, त्यो विलयनको मोडेलमा प्रयोग हुने प्राचल हो। मिथिलिन ब्लुको संयोजन अवस्था फेरिँदा मोडेल पनि फेरिन्छ, त्यसैले प्राचल पनि फेरिन्छ। उपयोगी अभ्यास भनेको प्रत्येक गुणाङ्कलाई अवस्थाहरू खुलाइएको मानका रूपमा लिनु हो: तरङ्गदैर्ध्य, विलायक, pH वा बफर, तापक्रम, सान्द्रता दायरा र प्रकाशपथको लम्बाइ सधैँ त्यस सङ्ख्यासँगै उल्लेख गर्नुपर्छ।

पातलो जलीय विलयनमा मोनोमर ब्यान्ड

पातलो जलीय विलयनमा मिथिलिन ब्लु धनायनको प्रमुख ब्यान्ड करिब 664 देखि 665 nm मा हुन्छ। उपकरण र क्यालिब्रेसनको छनोटअनुसार यसलाई सामान्यतया 664 देखि 668 nm भित्र उल्लेख गरिन्छ। अधिकांश रङ्गद्रव्य मोनोमर रूपमा रहने गरी विलयन पर्याप्त पातलो भएको अवस्थामा परिमाण निर्धारणका लागि यही ब्यान्ड उपयुक्त हुन्छ।

साहित्यमा पाइने तीन मानले मुख्य सङ्ख्याभन्दा अवस्थाहरू किन महत्त्वपूर्ण छन् भन्ने देखाउँछन्। 1 cm सेलमा जलीय नमुनाको सान्द्रता करिब 7 micromolar भन्दा तल राखेका माटोका अनुसन्धानकर्ताहरूले 665 nm मा एप्सिलोन करिब 82,000 M-1 cm-1 भएको बताए। अत्यन्त पातला जलीय नमुनाहरूका लागि प्रयोगजन्य क्यालिब्रेसन ढलानका रूपमा यस मानको असाधारण रूपमा राम्रो अभिलेखन गरिएको छ। पछि गरिएको विआयनीकृत पानीमा प्राथमिक क्यालिब्रेसन मा 2.34 देखि 37.52 micromolar र 1 cm प्रकाशपथ प्रयोग गर्दा कुल रङ्गद्रव्यका लागि 665 nm मा करिब 67,100 M-1 cm-1 प्राप्त भयो। यो कम नतिजा अपेक्षित हो, विरोधाभासी होइन, किनभने त्यस क्यालिब्रेसन दायराको माथिल्लो आधा भागमा पहिल्यै उल्लेख्य डाइमर हुन्छ। तेस्रो मान, 664 nm मा करिब 73,460 M-1 cm-1, pH 6.86 र 293 K मा गरिएको कामबाट आएको हो। त्यस कामले अवलोकित स्पेक्ट्रमलाई मोनोमर र डाइमरका भागमा छुट्याएको थियो, जसको सारांश मिथिलिन ब्लुको प्रकाशभौतिकीसम्बन्धी हालैको समालोचनात्मक समीक्षा मा दिइएको छ। त्यो सङ्ख्या विश्लेषणद्वारा छुट्याइएको मोनोमर घटक हो, कुल रङ्गद्रव्यको तुलनामा अवशोषणमानको प्रत्यक्ष ढलान होइन।

व्यावहारिक निष्कर्ष: तपाईंका नमुनासँग अवस्थाहरू मिल्ने गुणाङ्क छान्नुहोस्, वा आफ्नै क्यालिब्रेसन गर्नुहोस्। 30 micromolar फस्फेट बफर परीक्षणमा 82,000 प्रयोग गरेर रैखिकता अझै कायम छ भन्ने अनुमान नगर्नुहोस्।

छोटो तरङ्गदैर्ध्यको शोल्डर मिश्रित योगदान हो

सान्द्रता बढ्दै जाँदा 664 nm को शिखरको तुलनामा करिब 600 देखि 615 nm मा रहेको शोल्डर बढ्छ। आधुनिक अध्ययनहरूले सामान्यतया H प्रकारको डाइमरको योगदान करिब 605 देखि 610 nm मा राख्छन्। पानीमा मिथिलिन ब्लुको समग्र स्पेक्ट्रल विश्लेषण ले 607 nm मा डाइमरको अधिकतम र 600 nm मा उच्चतर समुच्चयको अधिकतम छुट्याउँछ, साथै 664 र 650 nm मा मोनोमर अनुनाद घटकहरू देखाउँछ। यसको पूर्ण पाठ PMID 33251415 को खुला पहुँच अभिलेख मार्फत उपलब्ध छ।

त्यो शोल्डरलाई शुद्ध डाइमर अवशोषणमान भन्नु हुँदैन। मोनोमरको कम्पन-इलेक्ट्रोनिक संरचनाले पनि सोही क्षेत्रमा योगदान गर्छ, त्यसैले मापन गरिएको उचाइ धेरै योगदानको अध्यारोपण हो। एउटा समग्र फिटमा मोनोमर र डाइमर मात्र समावेश गरिएको मोडेल पूरै 1.1 micromolar देखि 3.4 millimolar दायरामा असफल भयो, तर टेट्रामर थप्दा सबैभन्दा राम्रो फिट प्राप्त भयो। टेट्रामरको सङ्केत 34 micromolar भन्दा तल पनि पहिचान गर्न सकिन्थ्यो। फिट गरिएका घटकहरूको अवशोषकता उच्च थियो: मुख्य मोनोमर घटकका लागि 664 nm मा करिब 107,800 M-1 cm-1, डाइमरका लागि 607 nm मा करिब 101,400, र टेट्रामरका लागि 600 nm मा करिब 138,500। यी मानहरू बफर नराखिएको विआयनीकृत पानीमा, सोडियम क्लोराइड 0 देखि 0.15 M र तापक्रम 282 देखि 333 K हुँदा प्राप्त भएका थिए। ती मोडेलद्वारा छुट्याइएका भागहरू हुन्, त्यसैले तिनलाई प्रयोगजन्य बियर ल्याम्बर्ट ढलानको सट्टा प्रयोग गर्नु हुँदैन।

डाइमरीकरणको तीव्रता प्रत्यक्ष रूपमा परिमाणित गरिएको छ। pH 6.86 र 293 K मा एउटा अध्ययनले डाइमरीकरण स्थिराङ्क करिब 3,900 M-1 प्राप्त गर्‍यो। यस परिमाणले 5 micromolar कार्यशील विलयन लगभग रैखिक रूपमा व्यवहार गर्दा 50 micromolar स्टक विलयनले किन त्यसो गर्दैन भन्ने बुझाउँछ। विधि विकास गर्दा उपयोगी जाँच भनेको करिब 610 nm को अवशोषणमान र करिब 665 nm को अवशोषणमानको अनुपात हो। सान्द्रतासँगै त्यो अनुपात बढ्दा 664 nm को एप्सिलोनले अब एउटै अपरिवर्तित रासायनिक रूपको वर्णन गर्दैन।

आपसमा रूपान्तरण हुने एउटा जोडीको प्रभुत्व रहेको सान्द्रता अन्तरालमा स्पेक्ट्रमहरूले साझा आइसोस्बेस्टिक बिन्दु देखाउन सक्छन्; जलीय शृङ्खलाहरूमा यो प्रयोगात्मक रूपमा करिब 625 nm मा देखिन्छ। स्पष्ट र स्थिर बिन्दु हुनु दुई प्रमुख रासायनिक रूपसँग मेल खान्छ। सान्द्रता बढ्दा त्यो बिन्दु सर्छ वा हराउँछ भने त्यसलाई उपकरणको त्रुटि नभई उच्चतर समुच्चय वा बदलिँदो सन्तुलन सक्रिय भएको चेतावनीका रूपमा लिनुहोस्।

विलायक, pH र तापक्रमले स्पेक्ट्रम सार्छन्

पानीले संयोजनलाई अनुकूल बनाउँछ। पानी र DMSO मिश्रणहरूमा मिथिलिन ब्लुको विलायक अध्ययन, जुन PMID 30933781 का रूपमा सूचीकृत छ, अनुसार डाइमिथाइल सल्फोक्साइड थप्दा डाइमरीकरण दबिन्छ, अवशोषण र प्रतिदीप्तिका अधिकतम बिन्दुहरू लामो तरङ्गदैर्ध्यतर्फ सर्छन्, र प्रतिदीप्तिको क्वान्टम उपज करिब चार गुणा बढ्छ। त्यस अध्ययनले जलीय स्पेक्ट्रमलाई मोनोमर–डाइमर सन्तुलनका रूपमा लिन्छ, जसमा मोनोमरको अवशोषणमान करिब 650 देखि 670 nm र डाइमरको अवशोषणमान करिब 580 देखि 615 nm मा हुन्छ। त्यसले 293.15 K मा प्राप्त स्पेक्ट्रमबाट डाइमरीकरण स्थिराङ्कहरू निकाल्छ।

अल्कोहलहरूले स्थान र देखिने अवशोषकता दुवै बदल्छन्, तर समुच्चयन हटाउँदैनन्। मिथिलिन ब्लुको एउटा विलायक अध्ययन मा रिपोर्ट गरिएको 31.3 micromolar र कोठाको तापक्रममा गरिएको एउटा प्राथमिक तुलनामा लामो तरङ्गदैर्ध्यको अधिकतम बिन्दु पानीमा 665 nm तर मिथानोलमा 655 nm थियो। कुल विलयनका देखिने मानहरू पानीमा करिब 37,100 र मिथानोलमा 60,800 थिए। 298 K मा निरपेक्ष इथानोलमा गरिएको छुट्टै प्रमाणीकरणले 655 nm मा अधिकतम बिन्दु र करिब 68,000 एप्सिलोन प्राप्त गर्‍यो।

सामान्य pH परिवर्तनले धेरै कार्यविधिहरूले अनुमान गरेभन्दा कम मात्र स्पेक्ट्रम सार्छ। माथि उद्धृत समालोचनात्मक समीक्षाले करिब pH 2 देखि pH 12 सम्म अधिकतम बिन्दु करिब 665 nm मै रहेको र pH 11 सम्म अवशोषकतामा साना परिवर्तन मात्र भएको बताउँछ। बफरको प्रकार र आयनिक बलले नाममात्रको pH जत्तिकै नतिजा बदल्न सक्छन्, त्यसैले pH मिटरको पठन मात्र नभई वास्तवमा प्रयोग गरिएको बफर र लवण पनि अभिलेख गर्नुहोस्। प्रबल अम्ल वा प्रबल क्षारको अवस्था फरक हो, किनभने रङ्गद्रव्यमा उल्टाउन सकिने संयोजनको सट्टा रासायनिक परिवर्तन हुन सक्छ। तापक्रम र लवणले पनि सन्तुलन बदल्छन्, त्यसैले 2020 को पानीसम्बन्धी अध्ययनमा दुवैलाई जानाजानी परिवर्तन गरिएको थियो।

सङ्ख्या मान्य रहने गरी मापन गर्ने

परिमाणात्मक काम बियर ल्याम्बर्ट सम्बन्धमा आधारित हुन्छ: अवशोषणमान बराबर एप्सिलोन गुणा सान्द्रता गुणा प्रकाशपथको लम्बाइ। साथै, तपाईंका अवस्थाहरूमा रैखिक अन्तराल वास्तवमै कायम छ भन्ने प्रमाण पनि आवश्यक हुन्छ।

कम micromolar सान्द्रतामा काम गर्दा 1 cm सेल प्रयोग गर्नुहोस्। एप्सिलोन करिब 82,000 हुँदा 5 micromolar ले करिब 0.41 र 10 micromolar ले करिब 0.82 अवशोषणमान दिन्छ। साधारण पानीमा मोनोमरमा केन्द्रित मापनका लागि सान्द्रता करिब 5 देखि 7 micromolar वा त्यसभन्दा तल राख्नु, क्यालिब्रेसनलाई दसौँ micromolar सम्म पुर्‍याउनुभन्दा सुरक्षित हुन्छ। सान्द्र स्टक विलयनका लागि 1 भन्दा धेरै माथिको अवशोषणमान स्वीकार गर्नुको सट्टा प्रकाशपथ छोट्याउनुहोस्।

ब्ल्याङ्कका लागि उही म्याट्रिक्स प्रयोग गर्नुहोस्: पानीको उही गुणस्तर, सह-विलायकको उही अंश, उही बफर र लवण, तर रङ्गद्रव्यबिना। क्यालिब्रेसन मानकहरू सोही म्याट्रिक्समा र उही तापक्रममा तयार गर्नुहोस्। विधि विकास गर्दा एउटै तरङ्गदैर्ध्य मात्र पढ्नुको सट्टा पूरा दृश्य दायरा स्क्यान गर्नुहोस्, आदर्श रूपमा करिब 550 देखि 750 nm। उचाइ मात्र होइन, आकार पनि अनुगमन गर्नुहोस्। क्रमिक तनुकरणले सामान्यीकृत आकार बदल्छ भने प्रणाली रासायनिक रूपमा सान्द्रतामा निर्भर छ। स्थिर अधिकतम बिन्दु र स्थिर 610 देखि 665 nm अनुपात स्वीकार्य दायराका लागि उच्च R को वर्ग मात्रभन्दा बलिया प्रमाण हुन्।

अभिकर्मकको रूप अभिलेख गर्नुहोस्। व्यावसायिक सामग्री निर्जल मिथाइलथायोनिनियम क्लोराइड वा ट्राइहाइड्रेटजस्तो हाइड्रेट हुन सक्छ, त्यसैले स्टक विलयनको गणनामा प्रयोग गरिने मोलर द्रव्यमान वास्तविक बोतलको सामग्रीसँग मिल्नुपर्छ। यो एउटा कदमले मात्र पनि प्रयोगशालाहरूबीच नाममात्रका मोलर सान्द्रतामा देखिने भिन्नताको केही अंश बुझाउँछ। नतिजा परिमाणात्मक परीक्षणका गणनामा प्रयोग हुँदा, स्पेक्ट्रमले सूत्रीकरणको स्थिरता जाँचलाई समर्थन गर्दा, र अशुद्धता प्रोफाइलका कारण शुद्धता तथा विनिर्देशको समीक्षा आवश्यक हुँदा पनि यस्तै अनुशासन लागू हुन्छ।

अवस्थाहरू खुलाइएको सारांश

यस तालिकालाई प्रयोगशालाको अभिलेखका लागि प्रारम्भिक ढाँचाका रूपमा प्रयोग गर्नुहोस्, एकअर्काको सट्टा प्रयोग गर्न मिल्ने स्थिराङ्कहरूको स्रोतका रूपमा होइन।

त्यसैले मिथिलिन ब्लुको अवशोषणमानको तरङ्गदैर्ध्य छोटो उत्तर भए पनि त्यसलाई लामो स्पष्टीकरण चाहिन्छ। तपाईंले जुन विलयनमा, जुन सान्द्रतामा शिखर मापन गर्नुभएको हो, त्यही विवरणसहित रिपोर्ट गर्नुहोस्। यस अभ्यासले पातलो जलीय विलयनमा करिब 664 nm नजिकको एउटा मानलाई गलत सार्वभौमिक स्थिराङ्क बन्नबाट रोक्छ।