L-ispettru tal-assorbiment tal-blu tal-metilen u l-assorbittività molari: referenza bil-kundizzjonijiet indikati

Spettru tal-blu tal-metilen jidher sempliċi sakemm tipprova terġa' tuża numru minnu. Laboratorju wieħed jirrapporta koeffiċjent tal-estinzjoni molari qrib 82,000. Ieħor jirrapporta 67,000. It-tielet jirrapporta aktar minn 100,000. It-tlieta jistgħu jkunu deskrizzjonijiet korretti tal-kejl rispettiv tagħhom, u l-ebda wieħed minnhom ma huwa kostanti universali għaż-żebgħa.

Il-konfużjoni tiġi mit-taħlit ta' żewġ kunċetti distinti. L-assorbanza hija kejl magħmul fuq soluzzjoni speċifika f'ċella speċifika. L-assorbittività molari, spiss miktuba bħala epsilon, hija parametru f'mudell ta' dik is-soluzzjoni. Meta l-blu tal-metilen ibiddel l-istat ta' assoċjazzjoni tiegħu, il-mudell jinbidel, u għalhekk jinbidel ukoll il-parametru. Drawwa utli hija li kull koeffiċjent jitqies bħala valur bil-kundizzjonijiet indikati: it-tul ta' mewġa, is-solvent, il-pH jew il-buffer, it-temperatura, il-medda tal-konċentrazzjoni u t-tul tal-mogħdija ottika għandhom dejjem jakkumpanjaw in-numru.

Il-banda tal-monomeru f'soluzzjoni dilwita fl-ilma

F'soluzzjoni milwiema dilwita, il-banda dominanti tal-katjon tal-blu tal-metilen tinsab qrib 664 sa 665 nm, u komunement tiġi rrappurtata fil-medda ta' 664 sa 668 nm skont l-istrumenti u l-għażliet tal-kalibrazzjoni. Dik il-banda hija l-għażla t-tajba għall-kwantifikazzjoni meta s-soluzzjoni tkun dilwita biżżejjed biex il-biċċa l-kbira taż-żebgħa tkun fil-forma ta' monomeru.

Tliet valuri mil-letteratura juru għaliex il-kundizzjonijiet huma aktar importanti min-numru ewlieni. Riċerkaturi tat-tafal li żammew il-kampjuni milwiema taħt madwar 7 micromolar f'ċelloli ta' 1 cm irrappurtaw epsilon ta' madwar 82,000 M-1 cm-1 f'665 nm. Dak il-valur huwa dokumentat b'mod eċċezzjonalment tajjeb bħala l-pendenza ta' kalibrazzjoni empirika għal kampjuni dilwiti ħafna fl-ilma. Kalibrazzjoni primarja aktar tard f'ilma dejonizzat, li użat 2.34 sa 37.52 micromolar u mogħdija ta' 1 cm, tat madwar 67,100 M-1 cm-1 f'665 nm għaż-żebgħa totali. Ir-riżultat aktar baxx huwa mistenni, mhux kontradittorju, għax in-nofs ta' fuq ta' dik il-medda tal-kalibrazzjoni diġà fih ammont sinifikanti ta' dimeru. It-tielet valur, madwar 73,460 M-1 cm-1 f'664 nm, ġej minn xogħol f'pH 6.86 u 293 K li ssepara l-ispettru osservat f'partijiet tal-monomeru u tad-dimeru, kif miġbur f'reviżjoni kritika reċenti tal-fotofiżika tal-blu tal-metilen. Dak in-numru jirrappreżenta komponent tal-monomeru separat permezz tad-dekonvoluzzjoni, mhux pendenza diretta tal-assorbanza kontra ż-żebgħa totali.

Il-punt prattiku: agħżel il-koeffiċjent li l-kundizzjonijiet tiegħu jaqblu mal-kampjuni tiegħek, jew agħmel il-kalibrazzjoni tiegħek stess. Tużax 82,000 f'analiżi b'buffer tal-fosfat ta' 30 micromolar u tassumi li l-linearità għadha tapplika.

L-ispalla f'tul ta' mewġa qasir hija taħlita

Hekk kif tiżdied il-konċentrazzjoni, spalla qrib 600 sa 615 nm tikber relattivament għall-quċċata ta' 664 nm. Ix-xogħol modern normalment iqiegħed il-kontribut tad-dimeru tat-tip H qrib 605 sa 610 nm. L-analiżi spettrali globali tal-blu tal-metilen fl-ilma tiddistingwi massimu tad-dimeru f'607 nm u massimu ta' aggregat ta' ordni ogħla f'600 nm, b'komponenti tar-reżonanza tal-monomeru f'664 u 650 nm. It-test sħiħ tagħha huwa disponibbli permezz tar-rekord b'aċċess miftuħ għal PMID 33251415.

Dik l-ispalla m'għandhiex tiġi deskritta bħala assorbanza tad-dimeru biss. L-istruttura vibronika tal-monomeru tikkontribwixxi wkoll fl-istess reġjun, għalhekk l-għoli mkejjel huwa sovrappożizzjoni. Aġġustament globali wieħed sab li mudell b'monomeru u dimeru ma rnexxilux jiddeskrivi l-medda sħiħa minn 1.1 micromolar sa 3.4 millimolar, filwaqt li ż-żieda ta' tetrameru tat l-aħjar aġġustament, bis-sinjal tat-tetrameru diġà osservabbli taħt 34 micromolar. L-intensitajiet tal-komponenti miksuba mill-aġġustament kienu kbar: madwar 107,800 M-1 cm-1 f'664 nm għall-komponent ewlieni tal-monomeru, madwar 101,400 għad-dimeru f'607 nm, u madwar 138,500 għat-tetrameru f'600 nm, f'ilma dejonizzat mingħajr buffer bi klorur tas-sodju minn 0 sa 0.15 M u temperaturi minn 282 sa 333 K. Dawn huma partijiet distinti permezz tal-mudell, għalhekk m'għandhomx jintużaw minflok pendenza empirika ta' Beer Lambert.

Is-saħħa tad-dimerizzazzjoni ġiet ikkwantifikata direttament. F'pH 6.86 u 293 K, studju wieħed kiseb kostanti tad-dimerizzazzjoni qrib 3,900 M-1. Dik il-kobor tispjega għaliex soluzzjoni ta' ħidma ta' 5 micromolar iġġib ruħha kważi b'mod lineari filwaqt li soluzzjoni stokk ta' 50 micromolar ma tagħmilx hekk. Verifika utli waqt l-iżvilupp tal-metodu hija l-proporzjon tal-assorbanza qrib 610 nm mal-assorbanza qrib 665 nm. Meta dak il-proporzjon jiżdied mal-konċentrazzjoni, epsilon f'664 nm ma jibqax jiddeskrivi speċi waħda invarjanti.

F'intervall ta' konċentrazzjoni ddominat minn par wieħed ta' speċi li jinbidlu waħda fl-oħra, l-ispettri jistgħu jaqsmu punt isosbestiku, osservat sperimentalment qrib 625 nm f'serje milwiema. Punt stazzjonarju ċar huwa konsistenti ma' żewġ speċi dominanti. Meta l-punt jiċċaqlaq jew jisparixxi hekk kif tiżdied il-konċentrazzjoni, qisu bħala twissija li daħlu aggregati ta' ordni ogħla jew ekwilibriji li qed jinbidlu, mhux bħala żball tal-istrument.

Is-solvent, il-pH u t-temperatura jċaqilqu l-ispettru

L-ilma jiffavorixxi l-assoċjazzjoni. Iż-żieda ta' dimetil sulfossidu trażżan id-dimerizzazzjoni, iċċaqlaq il-massimi tal-assorbiment u tal-fluworexxenza lejn tul ta' mewġa itwal, u żżid ir-rendiment kwantiku tal-fluworexxenza madwar erba' darbiet, skont l-istudju tas-solvent tal-blu tal-metilen f'taħlitiet ta' ilma u DMSO, indiċjat bħala PMID 30933781. Dak ix-xogħol jittratta l-ispettri milwiema bħala ekwilibriju bejn monomeru u dimeru, b'assorbanza tal-monomeru qrib 650 sa 670 nm u assorbanza tad-dimeru qrib 580 sa 615 nm, u jiddeduċi l-kostanti tad-dimerizzazzjoni mill-ispettri f'293.15 K.

L-alkoħolijiet ibiddlu kemm il-pożizzjoni kif ukoll l-intensità apparenti, iżda ma jeliminawx l-aggregazzjoni. F'paragun primarju wieħed f'31.3 micromolar u f'temperatura ambjentali, irrappurtat f'studju dwar is-solventi tal-blu tal-metilen, il-massimu f'tul ta' mewġa twil kien 665 nm fl-ilma iżda 655 nm fil-metanol, b'valuri apparenti għas-soluzzjoni totali qrib 37,100 fl-ilma u 60,800 fil-metanol. Validazzjoni separata f'etanol assolut f'298 K tat massimu f'655 nm b'epsilon qrib 68,000.

Bidliet ordinarji fil-pH iċaqilqu l-ispettru inqas milli jassumu ħafna protokolli. Ir-reviżjoni kritika ċċitata hawn fuq tirrapporta li minn madwar pH 2 sa pH 12, il-massimu baqa' qrib 665 nm, b'bidliet żgħar biss fl-intensità sa pH 11. L-identità tal-buffer u l-qawwa jonika jistgħu jbiddlu r-riżultati daqs il-pH nominali, għalhekk irreġistra l-buffer u l-melħ li ntużaw fil-fatt, mhux biss il-qari tal-miter tal-pH. Aċidu qawwi jew alkali qawwi huma każ separat għax iż-żebgħa tista' tgħaddi minn bidla kimika aktar milli minn assoċjazzjoni riversibbli. It-temperatura u l-melħ ukoll ibiddlu l-ekwilibriju, u għalhekk l-istudju tal-2020 dwar l-ilma varja t-tnejn apposta.

Kejl li jżomm in-numru validu

Ix-xogħol kwantitattiv jistrieħ fuq ir-relazzjoni ta' Beer Lambert, fejn l-assorbanza hija ugwali għal epsilon immultiplikat bil-konċentrazzjoni u bit-tul tal-mogħdija ottika, flimkien ma' prova li l-intervall lineari fil-fatt japplika fil-kundizzjonijiet tiegħek.

Uża ċella ta' 1 cm għal xogħol f'konċentrazzjonijiet baxxi fil-medda micromolar. B'epsilon qrib 82,000, 5 micromolar jagħti assorbanza qrib 0.41 u 10 micromolar jagħti madwar 0.82. Għal kejl iffukat fuq il-monomeru f'ilma biss, li tibqa' qrib jew taħt madwar 5 sa 7 micromolar huwa aktar sigur milli tikkalibra sew fil-medda ta' għexieren ta' micromolar. Għal soluzzjonijiet stokk ikkonċentrati, qassar il-mogħdija ottika minflok taċċetta assorbanza ferm ogħla minn 1.

Uża blank b'matriċi identika: l-istess grad ta' ilma, l-istess frazzjoni ta' kosolvent, l-istess buffer u melħ, iżda mingħajr iż-żebgħa. Ipprepara l-istandards tal-kalibrazzjoni f'dik l-istess matriċi u fl-istess temperatura. Waqt l-iżvilupp, skennja l-medda viżibbli kollha, idealment madwar 550 sa 750 nm, minflok taqra tul ta' mewġa wieħed biss. Segwi l-forma, mhux biss l-għoli. Jekk dilwizzjoni serjali tbiddel il-forma normalizzata, is-sistema tiddependi kimikament fuq il-konċentrazzjoni. Massimu stabbli u proporzjon stabbli bejn 610 u 665 nm huma evidenza aktar b'saħħitha ta' medda aċċettabbli minn valur għoli ta' R kwadrat waħdu.

Iddokumenta l-forma tar-reaġent. Il-materjal kummerċjali jista' jkun klorur tal-metiltioninju anidru jew idrat bħat-triidrat, għalhekk il-massa molari użata għall-kalkoli tas-soluzzjoni stokk trid taqbel mal-kontenut attwali tal-flixkun. Dan il-pass waħdu jispjega parti mid-diskrepanza bejn il-konċentrazzjonijiet molari nominali f'laboratorji differenti. Dixxiplina simili tapplika meta r-riżultati jintużaw f'kalkoli ta' analiżi kwantitattiva, meta l-ispettri jappoġġaw verifiki tal-istabbiltà tal-formulazzjoni, u meta l-profili tal-impuritajiet jeħtieġu reviżjoni tal-purità u tal-ispeċifikazzjonijiet.

Sommarju bil-kundizzjonijiet indikati

Uża din it-tabella bħala mudell inizjali għal rekord tal-laboratorju, mhux bħala sors ta' kostanti interkambjabbli.

It-tul ta' mewġa tal-assorbanza tal-blu tal-metilen għalhekk huwa tweġiba qasira b'nota twila f'qiegħ il-paġna. Irrapporta l-quċċata li kejilt, fis-soluzzjoni li kejilt, fil-konċentrazzjoni li kejilt. Dik id-drawwa żżomm valur wieħed għal soluzzjoni milwiema dilwita qrib 664 nm milli jinbidel f'kostanti universali falza.