न्यू मेथिलीन ब्लू आणि रेटिक्युलोसाइट रंगवणे: एक वेगळा रंगद्रव्य आणि जिवंत पेशींची पद्धत

एक विद्यार्थी रेटिक्युलोसाइट मोजणीची तयारी करतो, मेथिलीन ब्लू मागवतो, ते रक्तात मिसळतो आणि त्याला जवळजवळ काहीच दिसत नाही. त्याचा सहाध्यायी न्यू मेथिलीन ब्लू असे लेबल असलेली बाटली वापरतो आणि काही लाल रक्तपेशींमध्ये स्पष्ट निळे तंतू दिसतात. पहिल्या विद्यार्थ्याला वाटते की दुसऱ्या बाटलीतील रंगद्रव्य अधिक ताजे किंवा अधिक सांद्र आहे. प्रत्यक्षात यांपैकी काहीही खरे नसते. त्या बाटलीत वेगळाच रेणू असतो.

या क्षेत्रातील बहुतांश गोंधळामागे हीच संकल्पनात्मक चूक असते. नावावरून न्यू मेथिलीन ब्लू म्हणजे मेथिलीन ब्लूची सुधारित तुकडी असे वाटते. पण रसायनशास्त्र वेगळेच सांगते. न्यू मेथिलीन ब्लू N हे स्वतंत्र फिनोथायाझीन रंगद्रव्य आहे. त्याचा स्वतःचा कलर इंडेक्स क्रमांक, स्वतःची प्रतिस्थापन रचना आणि रक्तविज्ञानातील स्वतःची प्रमाणित भूमिका आहे. हा फरक स्पष्ट झाल्यावर पद्धतीचा उर्वरित भागही सहज समजतो: रंगवताना पेशी जिवंत का असाव्यात, कोणती पेशी रेटिक्युलोसाइट म्हणून मोजावी, हाइन्झ पिंडांचा यात काय संबंध आहे आणि ब्रिलियंट क्रेसिल ब्लूचा वापर कुठे होतो.

थोडक्यात उत्तर

रक्तविज्ञानातील अभिकर्मक न्यू मेथिलीन ब्लू N याची ओळख सामान्यतः न्यू मेथिलीन ब्लूच्या PubChem नोंदीतील Basic Blue 24, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, सूत्र C18H22ClN3S अशी दिली जाते. साधे मेथिलीन ब्लू म्हणजे त्याच्या PubChem नोंदीतील मेथिलथायोनिनियम क्लोराइड, Basic Blue 9, C.I. 52015, CAS 61-73-4, सूत्र C16H18ClN3S. रचनात्मकदृष्ट्या, न्यू मेथिलीन ब्लूमध्ये वलयावर दोन मिथाइल गट आणि एथिलअमिनो पार्श्वसाखळ्या असतात, तर मेथिलीन ब्लूमध्ये डायमिथिलअमिनो गट असतात. या फरकामुळे रंगवण्याचे वर्तन बदलते. रक्तविज्ञानाच्या ग्रंथांमध्ये साधे मेथिलीन ब्लू हे रेटिक्युलोसाइट रंगवण्यासाठी तुलनेने कमकुवत, तर न्यू मेथिलीन ब्लू अधिक गडद आणि एकसमान रंग देणारे असल्याचे वर्णन आहे. या तुलनेचा सारांश ScienceDirect वरील न्यू मेथिलीन ब्लूच्या विषयात दिला आहे.

होय, न्यू मेथिलीन ब्लू हे सुप्राव्हायटल रंगद्रव्य आहे. सुप्राव्हायटल रंगवणे म्हणजे शरीरातून काढलेल्या जिवंत पेशींचे स्थिरीकरण करण्यापूर्वी त्यांना रंगवणे; ही व्याख्या सुप्राव्हायटल रंगवण्याच्या तत्त्वांवरील NCBI आढाव्यात दिली आहे. न्यू मेथिलीन ब्लू आणि ब्रिलियंट क्रेसिल ब्लू ही दोन्ही रंगद्रव्ये या प्रकारात मोडतात, आणि CLSI रेटिक्युलोसाइट मानकात न्यू मेथिलीन ब्लूचा सुप्राव्हायटल रंगद्रव्य म्हणून स्पष्ट समावेश आहे. विद्यार्थी कधीकधी या पद्धतीला स्थिरीकृत स्मिअरच्या रोमानोव्स्की रंगवण्यासोबत एकाच गटात ठेवतात. ही समजूत येथे उपयोगी पडत नाही. आधी स्थिरीकरण केले तर ही पद्धत काम करत नाही.

समान वाटणाऱ्या रंगद्रव्यांच्या नावांचा मागोवा घेणाऱ्या वाचकांसाठी, मिथाइल ब्लू विरुद्ध मेथिलीन ब्लू हा लेख ऋणायनिक ट्रायअरिलमेथेन रंगद्रव्य आणि धनायनिक फिनोथायाझीन परिवार यांतील वेगळा आणि अधिक व्यापक गोंधळ स्पष्ट करतो. प्रयोगशाळेतील रंगवण्याच्या पद्धतींचा आढावा स्थिरीकृत स्मिअरच्या पद्धतींसोबत सुप्राव्हायटल पद्धतीचे स्थान स्पष्ट करतो, तर रक्तपेशींच्या आकाररचनेचे मार्गदर्शन व्यापक विभेदक मोजणीत रेटिक्युलोसाइट मूल्यमापन कुठे बसते ते दाखवते.

उत्पादन-सूचीबाबत एक खबरदारी: न्यू मेथिलीन ब्लूचे स्वतंत्र झिंक क्लोराइड दुहेरी लवणरूप CAS 6586-05-6 अंतर्गत उपलब्ध आहे. त्यामुळे पद्धतीच्या विभागात केवळ सर्वसाधारण नाव न देता लवणाचा प्रकार आणि पुरवठादाराचे नावही नमूद करावे.

सुप्राव्हायटल रंगवण्याने प्रत्यक्षात काय होते

रेटिक्युलोसाइट ही एक तरुण लाल रक्तपेशी असते. तिचे केंद्रक नष्ट झालेले असते, पण उरलेला रिबोसोमल RNA तिच्यात असतो. न रंगवलेल्या ओल्या नमुन्यात हा RNA दिसत नाही. सुप्राव्हायटल रंगद्रव्य जिवंत पेशीत प्रवेश करते आणि त्या RNA चे अवक्षेपण किंवा एकत्रीकरण करून निळे कण आणि तंतू तयार करते. तेल-निमज्जनाखाली दिसणारा जाळीसारखा तंतुमय पदार्थ हाच असतो. त्यामुळे हे जाळे रंगवण्याच्या प्रक्रियेतून तयार झालेले असते; रंग मिळण्याची वाट पाहणारा आधीपासून तयार सांगाडा नसतो. म्हणूनच कार्यपद्धतीतील चल घटक—रंगद्रव्याची सांद्रता, बफर, रक्त व रंगद्रव्याचे गुणोत्तर, तापमान आणि वेळ—रंगद्रव्याच्या नावाइतकेच महत्त्वाचे असतात.

प्रत्यक्ष कामात याचा अर्थ टप्प्यांचा क्रम काटेकोरपणे पाळणे: प्रथम रक्त गोठण्यास प्रतिबंधक मिसळलेले रक्त रंगद्रव्यात मिसळा, ठरावीक काळ ठेवा, नंतर स्मिअर तयार करा आणि स्थिरीकरण किंवा प्रतिरंग न करता त्यांची तपासणी करा. रंगवण्यापूर्वी स्थिरीकरण केल्यास किंवा फिकट तंतू झाकून टाकणारा प्रतिरंग वापरल्यास मोजणीसाठी आवश्यक माहिती नष्ट होते.

न्यू मेथिलीन ब्लूसह रेटिक्युलोसाइट तपासणीची कार्यपद्धती

सर्वत्र वापरले जाणारे एकच मिश्रण नाही, त्यामुळे वापरलेल्या मिश्रणाची नोंद करा. दस्तऐवजीकरण केलेले तीन प्रकार यातील विविधता दाखवतात.

पारंपरिक ब्रेकर प्रकारच्या पद्धतीत पोटॅशियम ऑक्झलेटसह सुमारे 0.5 percent न्यू मेथिलीन ब्लू वापरले जाते. ते नीट मिसळलेल्या EDTA रक्तात समान आयतनात मिसळून खोलीच्या तापमानावर सुमारे 10 ते 15 मिनिटे ठेवले जाते. हलक्या हाताने पुन्हा मिसळल्यानंतर पातळ पाचरीच्या आकाराचे स्मिअर तयार केले जातात, हवेत वाळवले जातात आणि स्थिरीकरण न करता 100x तेल-निमज्जन वस्तुभिंगाखाली तपासले जातात. रेटिक्युलोसाइट मोजणीची NCBI कार्यपद्धती या प्रक्रियेचे आणि तिच्यासोबत वापरल्या जाणाऱ्या मोजणीच्या चौकटीचे वर्णन करते.

डेसी आणि लुईस प्रकारात सायट्रेट सलाइनमधील 1.0 percent न्यू मेथिलीन ब्लू वापरले जाते. ते रक्ताच्या 2 ते 4 पट आयतनात मिसळले जाते आणि स्मिअर तयार करण्यापूर्वी 37 C वर 15 ते 20 मिनिटे ठेवले जाते. CLSI H44 पद्धतीच्या अलीकडील सुसंगतीकरण अंमलबजावणीत pH 7.4 असलेल्या फॉस्फेट-बफर्ड सलाइनमधील अधिक विरळ, 0.1 percent द्रावण वापरले गेले. नमुना 20 C वर 10 मिनिटे ठेवला गेला आणि स्थिरीकरण केले गेले नाही, असे 2026 मधील NMB सुसंगतीकरण अभ्यासात नोंदवले आहे.

सर्व प्रकारांत मोजणीचे नियम समान आहेत. एखाद्या पेशीत निळा रंग घेतलेले किमान दोन स्वतंत्र कण किंवा तंतूंचे भाग असतील, तर ती रेटिक्युलोसाइट म्हणून मोजा. यामुळे रंगद्रव्याचा एकटा साठा मोजणीतून वगळला जातो. नियमित कामात किमान 1,000 लाल रक्तपेशी मोजा आणि रेटिक्युलोसाइटचे प्रमाण टक्केवारीत नोंदवा. प्रमाण कमी असताना सांख्यिकीय गरजांनुसार अधिक पेशी मोजाव्या लागतात. CLSI H44 पद्धतीच्या आढाव्यानुसार, रेटिक्युलोसाइटचे प्रमाण जवळपास 1 percent असताना मोजणीतील चलनशीलता 5 percent पर्यंत आणण्यासाठी सुमारे 4,400 पेशी आवश्यक असतात; हे De Gruyter वरील CLSI H44 आढाव्यात नमूद आहे. मिलर नेत्रिक चकतीमुळे मोठ्या संख्येने पेशी मोजणे व्यवहार्य होते. रंगद्रव्य गाळून घ्या किंवा ताजे तयार करा, कारण त्याचा अवक्षेप पेशींतील दाणेदार समावेशांसारखा दिसू शकतो.

त्याच नमुन्यातील हाइन्झ पिंड

त्याच सुप्राव्हायटल स्मिअरमध्ये हाइन्झ पिंडही दिसू शकतात. हे अवशिष्ट RNA नसून ऑक्सिडीकरण झालेल्या आणि विकृत झालेल्या हिमोग्लोबिनचे समूह असतात. न्यू मेथिलीन ब्लूने रंगवलेल्या नमुन्यांत ते गोल पिंड म्हणून दिसतात. ते बहुतेकदा एकटे आणि पेशीपटलाजवळ असतात, तसेच जाळीसारख्या तंतुमय पदार्थापेक्षा फिकट निळा रंग घेतात. स्थिरीकरण आणि प्रतिरंग देताना ते नीट टिकून राहत नाहीत, त्यामुळे स्थिरीकरण न केलेल्या स्मिअरची तपासणी करा. अलीकडील एका कार्यपद्धतीत 20 microliters EDTA रक्तासोबत 20 microliters 1 percent न्यू मेथिलीन ब्लू वापरून नमुना 15 मिनिटे ठेवला आणि 250 लाल रक्तपेशींमधील हाइन्झ पिंड असलेल्या पेशींची मोजणी केली. ही कार्यपद्धती त्या पद्धतीची नोंद करणाऱ्या PMC अभ्यासात दिली आहे.

दोन फरक लक्षात ठेवल्यास चुकीचे निष्कर्ष टाळता येतात. प्रथम, मिथाइल व्हायोलेट आणि क्रिस्टल व्हायोलेट ही रंगद्रव्ये न्यू मेथिलीन ब्लूपेक्षा हाइन्झ पिंडांना अधिक गडद रंग देतात, असे ScienceDirect वरील हाइन्झ पिंडांच्या विषयात नमूद आहे. रेटिक्युलोसाइट आणि हाइन्झ पिंड यांचे एकत्र मूल्यमापन करायचे असल्यास न्यू मेथिलीन ब्लू हा सोयीचा पर्याय आहे; मात्र तो खास हाइन्झ पिंडांसाठी सर्वाधिक तीव्र रंग देणारा रंगद्रव्य नाही. दुसरे म्हणजे, अल्फा थॅलेसेमिया गुणधर्मातील HbH समावेश सुप्राव्हायटल रंगवल्यानंतर पेशीभर असंख्य बारीक ठिपके निर्माण करतात. याउलट, नेहमीचे हाइन्झ पिंड संख्येने कमी, आकाराने मोठे आणि बहुतेकदा पेशीपटलाशी संबंधित असतात. रंगद्रव्याचा साठा हा तिसरा भासमान पर्याय आहे: तो पेशींच्या फोकल प्रतलाबाहेर असतो आणि वेगवेगळ्या दृश्यक्षेत्रांत बदलतो.

ब्रिलियंट क्रेसिल ब्लू विरुद्ध न्यू मेथिलीन ब्लू

दोन्ही रंगद्रव्ये रेटिक्युलोसाइटसाठी सुप्राव्हायटल रंगद्रव्ये आहेत, पण प्रमाणीकरणात त्यांपैकी एकाला प्राधान्य दिले जाते. इंटरनॅशनल कौन्सिल फॉर स्टँडर्डायझेशन इन हिमॅटॉलॉजीसोबत संयुक्तपणे विकसित केलेली आणि CLSI H44 मानकाच्या पृष्ठावर नमूद केलेली CLSI H44-A2 रेटिक्युलोसाइट पद्धत, EDTA रक्ताला न्यू मेथिलीन ब्लूने रंगवण्याला हस्तचालित तुलनात्मक पद्धत म्हणून निश्चित करते. पारंपरिक रक्तविज्ञान शिक्षणातही दिसण्याबाबत हेच सांगितले जाते: न्यू मेथिलीन ब्लू तंतूंना अधिक गडद आणि एकसमान रंग देते, तर ब्रिलियंट क्रेसिल ब्लूमध्ये उत्पादनाच्या तुकड्यांनुसार आणि नमुन्यांनुसार अधिक फरक दिसतो.

या स्थानासोबत एक मर्यादाही स्पष्ट करणे आवश्यक आहे. ICSH विश्लेषक मूल्यमापन मार्गदर्शक तत्त्वे न्यू मेथिलीन ब्लू वापरून केलेली हस्तचालित सूक्ष्मदर्शकीय तपासणी संदर्भ तुलनात्मक पद्धत म्हणून स्वीकारतात; मात्र ती व्यक्तिनिष्ठ आणि तुलनेने कमी परिशुद्ध असल्याचे सांगतात. उपलब्ध असल्यास फ्लो सायटोमेट्रीच्या संदर्भ पद्धतींना प्राधान्य दिले जाते. 2022 मधील 100 नमुन्यांच्या तुलनेत, वापरलेल्या विश्लेषकाच्या तुलनेत न्यू मेथिलीन ब्लूपेक्षा ब्रिलियंट क्रेसिल ब्लूचा पद्धतशीर विचलन कमी आढळला, असे रंगवण्याच्या पद्धतींची तुलना करणाऱ्या PMC अभ्यासात नोंदवले आहे. विद्यार्थ्यांसाठी समर्थनीय सारांश असा: प्रमाणित हस्तचालित तुलनात्मक पद्धतीसाठी न्यू मेथिलीन ब्लू वापरा, कोणतीही स्थानिक ब्रिलियंट क्रेसिल ब्लू पद्धत त्याच्याशी किंवा स्वयंचलित पद्धतीशी पडताळून पाहा आणि कोणत्याही हस्तचालित सूक्ष्मदर्शकीय पद्धतीत परिणाम अधिक विखुरलेले असण्याची अपेक्षा ठेवा. जुन्या प्रमाणीकरणविषयक साहित्यात व्यावसायिक रंगद्रव्यांच्या तुकड्यांमध्ये फरक असल्याने रासायनिकदृष्ट्या अधिक शुद्ध पर्याय म्हणून शुद्धीकृत Azure B चे समर्थनही केले होते. हे Azure B वरील मार्शल अभ्यासात दिसते आणि पद्धतींच्या चर्चेत अभिकर्मकाचा दर्जा अजूनही का नमूद केला जातो हे स्पष्ट करते.

नेहमीच्या चुका टाळणे

बहुतांश अयशस्वी नमुना-तयारीमागे चार चुका असतात. न्यू मेथिलीन ब्लू N ऐवजी साधे मेथिलीन ब्लू मागवल्यास रंग कमकुवत येतो; त्याचे कारण तंत्र नसून रसायनशास्त्र असते. निरीक्षणापूर्वी स्थिरीकरण किंवा प्रतिरंग दिल्यास सुप्राव्हायटल संकेत नष्ट होतो. रंगद्रव्याचा अवक्षेप कण म्हणून मोजल्यास निकाल वाढून दिसतो; दोन कणांचा नियम आणि गाळलेले रंगद्रव्य ही चूक टाळतात. रेटिक्युलोसाइटची टक्केवारी कमी असताना खूप कमी पेशी मोजल्यास आकडा अचूक वाटतो, पण त्याच्या विश्वासमर्यादा विस्तृत असतात. प्रत्येक चुकीचे स्वरूप सारखेच असते: अभिकर्मकाच्या टप्प्यात ठरलेल्या परिणामासाठी सूक्ष्मदर्शक वापरणारा व्यक्ती सूक्ष्मदर्शकालाच दोष देतो.