मिथिलीन ब्लूने गालाच्या पेशींचे रंजन: काय निरीक्षण करावे

एक विद्यार्थिनी काचपट्टीवर गालाच्या पेशींच्या निलंबनाचा एक थेंब ठेवते, सूक्ष्मदर्शकातून पाहते आणि तिला जवळजवळ काहीच दिसत नाही. उजळ दृश्यक्षेत्रात काही फिकट, अस्पष्ट आकृत्या तरंगत असतात. ती फोकस सुधारते, मग प्रकाश वाढवते आणि शेवटी काचपट्टी रिकामी आहे असा निष्कर्ष काढते. काचपट्टी रिकामी नसते. पेशी तिथेच असतात. त्या जवळजवळ पारदर्शक असतात आणि ही पारदर्शकताच दूर करण्यासाठी हे रंजन वापरले जाते.

कार्यपद्धती सुरू करण्यापूर्वी अपेक्षा आणि प्रतिमा यांतील हा फरक स्पष्ट करणे उपयुक्त ठरते. कॅमेऱ्याच्या झूममुळे दूरची पाटी स्पष्ट दिसते, त्याचप्रमाणे सूक्ष्मदर्शक तपशील दाखवेल अशी नवशिक्यांची अपेक्षा असते. उज्ज्वल-क्षेत्र सूक्ष्मदर्शकाचे काम अधिक मर्यादित असते: तो प्रकाशाच्या शोषणातील फरक दाखवतो. रंजन न केलेली गालाची पेशी जवळजवळ प्रकाश शोषतच नाही, त्यामुळे ती जवळजवळ कोणताही फरक निर्माण करत नाही. मिथिलीन ब्लू हा फरक निर्माण करतो. तो पेशीच्या आत असमान प्रमाणात बांधला जातो आणि रचनेला दृश्य विरोधाभास देतो. विद्यार्थ्यांना ही संकल्पना समजल्यानंतर पुढील प्रत्येक पायरी केवळ कृतींची यादी न वाटता त्या संकल्पनेचा परिणाम वाटते.

शालेय प्रयोगशाळेत साधे रंजन दृश्य विरोधाभास कसा वाढवते याची पार्श्वभूमी येथे उपयोगी ठरते आणि रंजनापूर्वी उज्ज्वल-क्षेत्र सूक्ष्मदर्शक तयार करण्याची उजळणी केल्याने निम्म्या अयशस्वी काचपट्ट्या टाळता येतात. या रंगामागील रसायनशास्त्र सूक्ष्मदर्शक निरीक्षणातील मिथिलीन ब्लूच्या परिचयात दिले आहे; प्रयोगशाळेच्या मेजावर हा विशिष्ट रंग पुन्हा पुन्हा का वापरला जातो, हे त्यात स्पष्ट केले आहे.

वर्गातील कार्यपद्धती

खाली दिलेली ओल्या नमुन्याची मांडणी सर्वसाधारण वर्गांसाठी अधिक सोपी मूलभूत पद्धत आहे. तिला ज्योतीची किंवा स्थिरीकरणाच्या पायरीची गरज नाही. काही महाविद्यालयीन प्रयोगपुस्तिकांमध्ये वापरल्या जाणाऱ्या स्थिरीकृत लेपाच्या पद्धतीत हवेत वाळवणे आणि थोडक्यात उष्णतेने स्थिरीकरण करणे या पायऱ्या जोडल्या जातात, जसे Biology LibreTexts द्वारे प्रकाशित North Central Texas College च्या गालाच्या पेशींच्या लेपावरील उपक्रमात केले आहे. मात्र उष्णतेने स्थिरीकरण ही सूक्ष्मजीवशास्त्रातील प्रचलित पद्धत आहे; उपकला पेशी पाहण्यासाठी ती आवश्यक नाही.

आवश्यक साहित्य: स्वच्छ काचपट्ट्या आणि आच्छादक काचा, निर्जंतुक एकदाच वापरायचे स्वॅब (शक्यतो हेच वापरावेत) किंवा नवीन सपाट दातकोरण्या, 0.5 ते 1 टक्के जलीय मिथिलीन ब्लूची ड्रॉपर बाटली, ऊर्ध्वपातित किंवा विआयनीकृत पाणी, शोषक कागद, हातमोजे आणि 100x व 400x एकूण वर्धन असलेला संयुक्त सूक्ष्मदर्शक.

1. साध्या पाण्याने तोंड धुवा. यामुळे अन्नकण दूर होतात; अन्यथा ते नंतर गडद रंगतात आणि पेशींपासून लक्ष विचलित करतात.
2. प्रत्येक विद्यार्थ्याने फक्त स्वतःच्या गालाचा नमुना घ्यावा. नवीन निर्जंतुक स्वॅबने गालाची आतील बाजू हलकेच घासा. हलका दाब द्या, खरवडू नका. अस्वस्थता किंवा रक्तस्राव होण्याच्या खूप आधी थांबा.
3. स्वच्छ काचपट्टीच्या मध्यभागी स्वॅब फिरवून पातळ थर पसरवा. निरीक्षणासाठी स्पष्ट काचपट्टी मिळेल की नाही हे ठरवणारा सर्वांत महत्त्वाचा घटक म्हणजे पातळ थर. जाड पांढरा थर रंगल्यानंतर अस्पष्ट निळ्या पुंजक्यात बदलतो.
4. लेपावर मिथिलीन ब्लूचा एक थेंब टाका. तो 1 ते 3 मिनिटे राहू द्या. अनेक महाविद्यालयीन कार्यपद्धतींमध्ये एक मिनिट पुरेसे असते; NCERT इयत्ता IX ची विज्ञान प्रयोगशाळा पुस्तिका तात्पुरत्या मांडणीसाठी सुमारे 3 मिनिटे वापरते. जास्त वेळ म्हणजे चांगला परिणाम असे नाही आणि अतिरंजन ही वेळेसंबंधीची सर्वांत सामान्य चूक आहे.
5. स्थानिक कार्यपद्धतीनुसार ऊर्ध्वपातित पाण्याने हलकेच धुवा किंवा शोषक कागदाने जास्तीचा रंग शोषून घ्या. पार्श्वभूमी फिकट निळी झाली पाहिजे, गडद निळी नाही.
6. आच्छादक काच तिरपी धरून खाली आणा, जेणेकरून आधी तिची एक कड स्पर्श करेल; मग ती हळूहळू खाली बसू द्या. यामुळे हवेचे बुडबुडे अडकत नाहीत.
7. पेशी शोधण्यासाठी कमी वर्धनापासून सुरुवात करा, फोकस आणि मध्यवर्ती स्थान योग्य असल्याची खात्री करा, मग 100x आणि शेवटी 400x वर जा. 400x वर फक्त सूक्ष्म फोकस समायोजन वापरा.

रंगाची सांद्रता एका वाक्यात नेमकी स्पष्ट करणे आवश्यक आहे. शालेय कार्यपद्धतींमध्ये साधारणपणे 1 टक्के जलीय मिथिलीन ब्लू वापरले जाते. अधिक सांद्र मूळ द्रावण किंवा अधिक काळ संपर्क ठेवल्याने केंद्रकापेक्षा पार्श्वभूमी अधिक वेगाने गडद होते आणि हा उपक्रम ज्या दृश्य विरोधाभासावर अवलंबून आहे तो उलटा होतो.

गालाच्या नमुन्यांची सुरक्षित हाताळणी

गालाच्या नमुन्यांमध्ये लाळ आणि तोंडातील नेहमीचे सूक्ष्मजीव असतात. त्यामुळे नमुना देणारे निरोगी वर्गमित्र असले तरी प्रत्येक ताजा लेप संभाव्य संसर्गजन्य पदार्थ म्हणून हाताळा. अध्यापन प्रयोगशाळांसाठी American Society for Microbiology ची जैवसुरक्षा मार्गदर्शक तत्त्वे सर्वसाधारण तत्त्वे सांगतात: सत्रापूर्वी जोखमीचे मूल्यांकन करा, हातमोजे घाला, द्रव उडण्याची शक्यता असेल तेथे डोळ्यांचे संरक्षण करा, नंतर हात धुवा, प्रयोगशाळेचे मेज निर्जंतुक करा आणि दूषित एकदाच वापरायच्या वस्तूंची मान्य जैविक कचरा व्यवस्थापन पद्धतीने विल्हेवाट लावा.

वर्गातील चार नियम बहुतांश जोखीम हाताळतात. प्रत्येक स्वॅब आणि प्रत्येक काचपट्टीसाठी एकच नमुनादाता; ते कधीही सामायिक करू नयेत. फक्त स्वतःचा नमुना घ्यावा, शेजारी बसलेल्या विद्यार्थ्याचा कधीही नाही. एकदाच वापरायचे स्वॅब आणि दातकोरण्या थेट ठरवलेल्या कचरापात्रात टाकाव्यात, पुन्हा मेजावर ठेवू नयेत. मिथिलीन ब्लूमुळे त्वचा आणि कपड्यांवर डाग पडतात आणि डोळ्यांना जळजळ होते, त्यामुळे हातमोजे आणि रंग हाताळतानाची नेहमीची स्वच्छता पाळावी. या उपक्रमाचा विस्तार करून लेपातील कोणत्याही सूक्ष्मजीवांचे संवर्धन करू नका आणि शाळेच्या सुरक्षा कार्यपद्धतीबाहेर ताज्या मानवी नमुन्याचे उष्णतेने स्थिरीकरण करण्यासाठी स्वतःहून पद्धत तयार करू नका.

काय निरीक्षण करावे आणि ते तसे का दिसते

100x वर रुंद, सपाट, फिकट निळ्या पेशी शोधा; त्यांची बाह्यरेषा अनियमित अंडाकृती किंवा बहुभुज असते. त्या स्वतंत्रपणे किंवा सैलपणे एकमेकांवर आच्छादित थरांमध्ये पडलेल्या असतात. प्रत्येक पेशीत सामान्यतः एक गडद निळा ठिपका असतो. तो ठिपका म्हणजे केंद्रक. मांडणीही नोंदवा: शल्की उपकला पेशी या पातळ फरश्यांसारख्या असतात, गोलाकार नसतात. त्यामुळे त्यांच्या कडा गोल फुग्यांपेक्षा तडे गेलेल्या चकचकीत पृष्ठभागासारख्या दिसतात.

400x वर तीन वैशिष्ट्ये स्पष्ट दिसतात. पेशीची सीमा पेशीला वेढणाऱ्या पातळ, तुलनेने गडद रेषेसारखी दिसते. पेशीद्रव्य आतील भागात फिकट, एकसमान निळ्या रंगात दिसते. केंद्रक अधिक गडद आणि घट्ट दिसते; ते अनेकदा अंडाकृती असते आणि सामान्यतः मध्याजवळ असते, पण नेहमीच नाही. विद्यार्थ्यांना या तिन्ही वैशिष्ट्यांसह आकार आणि वर्धन नोंदवायला सांगा, कारण कार्यपत्रिकेत नेमके हेच विचारले आहे.

येथे अचूकतेचा एक मुद्दा महत्त्वाचा आहे आणि अनेक कार्यपत्रिकांत तो चुकीचा दिलेला असतो. दिसणारी सीमा प्रद्रव्यपटलाच्या भागाशी संबंधित असते, पण प्रत्यक्ष पटल हा सुमारे 7 ते 10 नॅनोमीटर जाडीचा लिपिडचा दुहेरी थर असल्याने शालेय सूक्ष्मदर्शकाच्या विभेदनक्षमतेपेक्षा खूपच लहान असतो. विद्यार्थ्यांना दिसते ती पेशीची प्रकाशीय कड आणि तिथे साचलेला रंग. पेशीअंगकांबाबतही हीच खबरदारी लागू होते. तंतुकणिका, अंतर्द्रव्य जालिका, गॉल्जी संकुल आणि रायबोसोम या नमुन्यात दिसत नाहीत. चांगल्या परिस्थितीत पारंपरिक प्रकाश सूक्ष्मदर्शकाची विभेदनमर्यादा सुमारे 0.2 मायक्रोमीटर असते, असे सूक्ष्मदर्शक साधनांवरील NCBI ची पेशीजीवशास्त्राची पार्श्वभूमी स्पष्ट करते; बहुतांश अतिसूक्ष्म रचना या मर्यादेपेक्षा लहान किंवा तिच्या जवळ असतात. अधिक पण तपशील न वाढवणारे वर्धन प्रतिमा मोठी करते, मात्र अतिरिक्त तपशील दाखवत नाही.

केंद्रक सर्वांत गडद का रंगते? मिथिलीन ब्लू हा धनायनिक रंग आहे; द्रावणात त्यावर धन विद्युतभार असतो आणि तो पेशीतील ऋण विद्युतभार असलेल्या पदार्थांशी, विशेषतः न्यूक्लिक आम्लांशी, संबंधित होतो. क्रोमॅटिनमुळे DNA केंद्रकात एकवटलेले असते, त्यामुळे केंद्रकात सर्वाधिक रंग जमा होतो. पेशीद्रव्यात RNA आणि इतर विद्युतभारित रेणू असतात, त्यामुळे तेही रंगते, पण अधिक विखुरलेल्या स्वरूपात आणि फिकट. महत्त्वाची अट अशी: मिथिलीन ब्लू हा DNA-साठी विशिष्ट रंग नाही. केंद्रकीय प्रतिमांकनातील मिथिलीन ब्लूच्या वितरणावरील संशोधनात हा धनायन न्यूक्लिक आम्लांनी समृद्ध भागांशी संबंधित होत असल्याचे वर्णन आहे आणि पेशींच्या नमुन्यांमध्ये मिथिलीन ब्लूच्या बंधनावरील जुन्या परिमाणात्मक संशोधनात बांधलेल्या रंगाचा बहुतांश भाग न्यूक्लिक आम्लांशी संबंधित असल्याचे आढळले. त्यामुळे गडद केंद्रक आणि फिकट पेशीद्रव्य हा दृश्य विरोधाभासाचा नमुना आहे, आण्विक चाचणी नाही.

विद्यार्थी करतील त्या चुका आणि त्यांचा अर्थ कसा लावावा

जवळजवळ प्रत्येक अयशस्वी काचपट्टी पाचपैकी एका प्रकारात बसते. विद्यार्थ्यांना आंधळेपणाने पुन्हा प्रयोग करण्याऐवजी काचपट्टीतील समस्या ओळखायला शिकवा.

अतिरंजनामुळे पेशी आणि पार्श्वभूमी एकसारख्या गडद होतात, त्यामुळे केंद्रक दृश्यक्षेत्रात हरवते. रंजनाचा वेळ कमी करून किंवा अधिक नीट धुवून हे सुधारा. अपुऱ्या रंजनामुळे अस्पष्ट आकृत्या दिसतात आणि प्रकाश वाढवल्यावर त्या अदृश्य होतात; रंजनाचा वेळ तीस-तीस सेकंदांनी वाढवा. जाड लेपामुळे एकमेकांवर आच्छादित दाट पुंजके तयार होतात आणि त्यात कोणतीही बाह्यरेषा ओळखता येत नाही; यासाठीची सुधारणा प्रत्यक्ष नमुना पसरवण्यात आहे—पुढच्या वेळी अधिक पातळ थर पसरवा, कारण कितीही धुतले तरी पेशींचा ढीग स्पष्ट होत नाही. हवेचे बुडबुडे ठळक गडद कडा असलेल्या अचूक वर्तुळांसारखे दिसतात आणि त्यांना पेशीरचना समजणाऱ्या नवशिक्यांचे लक्ष विचलित करतात; आच्छादक काच पुन्हा तिरपी धरून हळूहळू ठेवा. पेशींवर किंवा त्यांच्या आसपास विखुरलेले सूक्ष्म गडद ठिपके हे सामान्यतः तोंडातील नेहमीचे जीवाणू असतात, असे Ingrid Science ची गालाच्या पेशींची कार्यपद्धती यांसारख्या शालेय कार्यपद्धतींमध्ये नमूद केले आहे. ते तोंडात सूक्ष्मजीव राहतात याची खात्री देतात; ही गोष्ट विद्यार्थ्यांच्या लक्षात राहू शकते. मात्र या उपक्रमातून त्यांची प्रजाती ओळखता येत नाही आणि त्यांना पेशीचे भाग म्हणून रेखाटू नये. अन्नाचे अवशेष आणि श्लेष्माचे धागे अनियमितपणे व गडद रंगतात; सुरुवातीला तोंड धुण्याचा उद्देश त्यांचे प्रमाण कमी करणे हा आहे.

या उपक्रमातून काय करता येत नाही

हे शैक्षणिक निरीक्षण आहे, निदान चाचणी नाही. वर्गातील रंजनात दिसणाऱ्या पेशींच्या स्वरूपावरून संसर्ग, कर्करोग किंवा कोणत्याही रोगाचे निदान करता येत नाही आणि हा लेख त्याउलट काही सुचवतो असा अर्थ घेऊ नये. हा नमुना दोन वर्धनांवर आकार, सीमा, पेशीद्रव्य आणि केंद्रक दाखवतो. तो पटलाची अतिसूक्ष्म रचना, पेशीअंगकांचे तपशील किंवा आण्विक ओळख दाखवत नाही. ही मर्यादा स्पष्टपणे सांगितल्याने विज्ञान आणि विद्यार्थी दोघांचेही संरक्षण होते: योग्य नामनिर्देशन केलेले रेखाचित्र, त्यासोबत वर्धन आणि वापरलेल्या रंगाची नोंद हा चांगला परिणाम आहे; आरोग्याबद्दलचा निष्कर्ष नाही.

विद्यार्थ्यांची कार्यपत्रिका आणि नामनिर्देशित सूक्ष्मछायाचित्रे

या पानासाठीची दोन प्रकल्पसाधने म्हणजे वरचे नामनिर्देशित सूक्ष्मछायाचित्र आणि खालील कार्यपत्रिका. प्रत्येक विद्यार्थ्यासाठी कार्यपत्रिकेची एक प्रत छापा किंवा ती पडद्यावर दाखवून विद्यार्थ्यांना तिच्यातील चौकटी वहीत उतरवायला सांगा.

45 मिनिटांच्या सत्रात ती कशी वापरावी: सुरक्षा सूचना आणि नमुना घेण्यासाठी दहा मिनिटे, रंजन व नमुना मांडणीसाठी दहा मिनिटे, दोन्ही वर्धनांवर निरीक्षण आणि रेखाटनासाठी पंधरा मिनिटे, तपासणीसूची आणि नामनिर्देशित सूक्ष्मछायाचित्राशी तुलना करण्यासाठी दहा मिनिटे. तपासणीसूचीतील मुद्दे जाणीवपूर्वक कृतींवर आधारित आहेत. पातळ लेप, रंजनाचा योग्य वेळ, पेशीद्रव्यापेक्षा गडद केंद्रक, वर्धनाची नोंद. या चारही गोष्टी पूर्ण झाल्याची खात्री करू शकणाऱ्या विद्यार्थ्याला या धड्याचा मुख्य उद्देश समजला आहे: सूक्ष्मदर्शक फरक दाखवतात आणि रंजनामुळे दाखवण्याजोगे फरक निर्माण होतात.