मिथिलीन ब्लू, Nrf2 आणि माइटोकॉन्ड्रियल जैवनिर्मिती: काय मोजले गेले आणि काय अद्याप प्रस्तावित आहे

मिथिलीन ब्लूविषयीच्या लेखनात एक वाक्य वारंवार दिसते: ते Nrf2 सक्रिय करते आणि नवीन माइटोकॉन्ड्रिया तयार करते. हे वाक्य एकच दावा असल्यासारखे वाटते, पण त्यात दोन वेगळ्या संकल्पना आहेत, ज्यांचा वेगवेगळ्या प्रणालींमध्ये आणि वेगवेगळ्या प्रकारच्या पुराव्यांद्वारे अभ्यास झाला आहे. पहिली म्हणजे संकेतप्रक्रियेचा मार्ग—संरक्षणात्मक जनुके सक्रिय करणारा संवेदक. दुसरी म्हणजे निर्मितीचा कार्यक्रम—पेशीने अधिक माइटोकॉन्ड्रियल यंत्रणा तयार करणे. एखादा संकेत निर्मिती सुरू करू शकतो, पण संकेत सक्रिय झाल्याचे दाखवणे म्हणजे बांधकाम पूर्ण झाल्याचे दाखवणे नव्हे; तसेच बांधकामाचे अधिक साहित्य दिसणे म्हणजे ऊर्जापुरवठा अधिक चांगला झाल्याचे दाखवणे नव्हे. हा लेख या तीन गोष्टी वेगळ्या ठेवतो.

Nrf2 ही संकल्पना: संवेदक, ढाल नव्हे

Nrf2 (न्यूक्लिअर फॅक्टर एरिथ्रॉइड 2-रिलेटेड फॅक्टर 2) हा प्रतिलेखन घटक आहे—जनुके सक्रिय करण्याचे काम करणारे प्रथिन. विश्रांतीच्या स्थितीत Keap1 नावाचे संवेदक प्रथिन त्याला पेशीद्रव्यात धरून ठेवते आणि सतत विघटनासाठी पेशीच्या विल्हेवाट यंत्रणेकडे सुपूर्द करते. ऑक्सिडंट किंवा इलेक्ट्रोफाइल Keap1 वरील प्रतिक्रियाशील सिस्टीनमध्ये बदल घडवतात तेव्हा ही विल्हेवाट थांबते. नव्याने तयार झालेले Nrf2 साचते, पेशीकेंद्रकात जाते, लहान Maf प्रथिनांशी जोडते आणि अँटिऑक्सिडंट प्रतिसाद घटक नावाच्या DNA अनुक्रमांना बांधते. या बांधणीमुळे संरक्षणात्मक जनुकांचा एक संच सक्रिय होतो.

या मार्गाचे प्रस्थापित मापननिर्देशक विशिष्ट आहेत. NQO1 (NAD(P)H क्विनोन डिहायड्रोजनेज 1) आणि TrxR1 (थायोरेडॉक्सिन रिडक्टेज 1) ही सर्वाधिक विश्वासार्ह Nrf2 लक्ष्य जनुकांपैकी आहेत. HO-1 (हीम ऑक्सिजनेज-1) ची अभिव्यक्ती मोठ्या प्रमाणात वाढवता येते, पण ते इतर नियामकांनाही प्रतिसाद देते. SOD आणि कॅटालेज यांसारखी एन्झाइमे अँटिऑक्सिडंट यंत्रणेचा भाग आहेत, पण त्यांची पातळी अनेक प्रतिलेखन घटक नियंत्रित करतात. त्यामुळे SOD मधील वाढ एकटीच Nrf2 हे त्याचे कारण असल्याचे सिद्ध करत नाही. संकेतप्रक्रियेच्या घटनेशी सर्वांत जवळचा पुरावा म्हणजे केंद्रकात Nrf2 साचणे, ARE रिपोर्टर सक्रिय होणे किंवा Nrf2 काढून टाकल्यावर नाहीशी होणारी प्रस्थापित लक्ष्य जनुकांच्या अभिव्यक्तीतील वाढ. इतर सर्व गोष्टी—ऑक्सिडंटची कमी पातळी, ताणाच्या परिस्थितीत अधिक चांगले टिकून राहणे, अधिक ग्लुटाथायोन—हे पुढील टप्प्यांतील परिणाम आहेत, जे अनेक मार्गांमुळे घडू शकतात.

या संदर्भातील मिथिलीन ब्लूचा सर्वांत सुरुवातीचा निष्कर्ष या निकषपट्टीच्या संकेतप्रक्रियेजवळच्या टोकाशी बसतो. nanomolar प्रमाणातील मिथिलीन ब्लूच्या संपर्कात आलेल्या फायब्रोब्लास्टमध्ये पेशीय वार्धक्य उशिरा आले; त्याचबरोबर कॉम्प्लेक्स IV चे प्रमाण आणि ऑक्सिजनचा वापर वाढला, तसेच फेज-2 एन्झाइमे TrxR1 आणि NQO1 यांच्या अभिव्यक्तीत वाढ झाली. हे मिथिलीन ब्लूचा माइटोकॉन्ड्रियातील वाढ आणि पेशीय वार्धक्याला विलंब यांच्याशी प्रथम संबंध जोडणाऱ्या अभ्यासात नोंदवले आहे. TrxR1 आणि NQO1 ही नेमकी तीच प्रस्थापित Nrf2 लक्ष्ये आहेत, ज्यांचा पुरावा जागरूक वाचकाला पाहायचा असतो. मात्र या अभ्यासाने प्रत्यक्ष संकेतप्रक्रियेची घटना दाखवली नाही: केंद्रकातील Nrf2 चे मापन नव्हते, ARE रिपोर्टर नव्हता आणि Nrf2 नॉकआउट नियंत्रणही नव्हते. त्यामुळे अचूक अर्थ असा की या प्रणालीमध्ये मिथिलीन ब्लू ज्ञात Nrf2 लक्ष्य जनुकांची अभिव्यक्ती वाढवते. हे Nrf2 सक्रिय होण्याशी सुसंगत आहे, पण Nrf2 हेच कारण असल्याचे वेगळे करून दाखवत नाही. लक्ष्य जनुकाची अभिव्यक्ती वाढणे हा स्विचनंतरचा एक टप्पा आहे.

जैवनिर्मिती ही संकल्पना: तीन तपासणी टप्प्यांचा कार्यक्रम

माइटोकॉन्ड्रियल जैवनिर्मिती हा असा कार्यक्रम आहे, ज्याद्वारे पेशी अधिक माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता तयार करते. पाठ्यपुस्तकातील त्याची क्रमवार रचना तीन तपासणी टप्प्यांतून जाते. प्रथम, सह-सक्रियक PGC-1alpha हा कार्यक्रम सुरू करतो. दुसरे, केंद्रकातील प्रतिलेखन घटक माइटोकॉन्ड्रियल जनुकांची अभिव्यक्ती घडवतात. यात माइटोकॉन्ड्रियल DNA टिकवणाऱ्या आणि त्याच्या प्रतिकृती तयार करणाऱ्या TFAM चाही समावेश आहे. या घटकांपैकी एकाचे नाव गोंधळात टाकणारे आहे: NRF1, म्हणजे न्यूक्लिअर रेस्पिरेटरी फॅक्टर 1; हे Nrf2 पेक्षा वेगळे प्रथिन आहे. तिसरे, अखेरीस पेशीत अधिक माइटोकॉन्ड्रियल जनुकीय संच आणि अधिक श्वसन यंत्रणा तयार होते. हे mtDNA प्रतींची संख्या, सायट्रेट सिंथेज क्रियाशीलता किंवा श्वसन कॉम्प्लेक्सचे प्रमाण आणि क्रियाशीलता यांद्वारे मोजता येते.

प्रत्येक तपासणी टप्प्याने मागील टप्प्याच्या तुलनेत कमी किंवा अधिक ठोस दावा करता येतो. PGC-1alpha किंवा TFAM संदेशवाहक RNA ची वाढलेली पातळी कार्यक्रम सुरू करण्याची सूचना दिली गेल्याचे दाखवते, तो पूर्ण झाल्याचे नाही. अधिक mtDNA किंवा अधिक कॉम्प्लेक्स IV प्रथिन म्हणजे अधिक घटकद्रव्य, पण पुनर्रचना झालेल्या माइटोकॉन्ड्रियामध्येही असेच चित्र दिसू शकते. अधिक चांगले श्वसन, ऑक्सिजनचा वाढलेला वापर किंवा कॉम्प्लेक्सची वाढलेली क्रियाशीलता कार्य बदलल्याचे दाखवते; पण नवीन माइटोकॉन्ड्रिया अजिबात तयार न होताही कार्य सुधारू शकते. जैवनिर्मितीचा ठोस दावा या तिन्हींचा समावेश करतो: नियामक, घटकांचे प्रमाण आणि कार्य.

फायब्रोब्लास्टवरील पुढील अभ्यासाने या साखळीतील बहुतेक टप्पे तपासले. 100 nanomolar मिथिलीन ब्लू दिलेल्या मानवी IMR90 पेशींमध्ये NAD ते NADH गुणोत्तर 15 मिनिटांच्या आत तात्पुरते वाढले आणि एका दिवसाच्या आत मूळ पातळीवर परतले. या तात्पुरत्या ऊर्जा संकेतानंतर ऊर्जा संवेदक AMPK चे तात्पुरते फॉस्फोरिलेशन झाले. त्यानंतर PGC-1alpha आणि कार्यक्षम कॉम्प्लेक्स IV ची जुळणी करण्यासाठी आवश्यक असलेल्या SURF1 प्रथिनाच्या अभिव्यक्तीत वाढ झाली. कॉम्प्लेक्स IV ची क्रियाशीलता जवळपास दुप्पट झाली, पेशींतील ऑक्सिडंट सुमारे 28 टक्क्यांनी कमी झाले आणि टेलोमिअरचे क्षरण अधिक हळूहळू झाले. हा संपूर्ण क्रम मिथिलीन ब्लूच्या रेडॉक्स क्रियाशीलतेचा AMPK आणि माइटोकॉन्ड्रियल जैवनिर्मितीशी संबंध जोडणाऱ्या संशोधनपत्रात मांडला आहे.

त्या संशोधनपत्रातील दोन तपशिलांकडे लक्ष देणे आवश्यक आहे, कारण अशा प्रकारचे तपशील सहसा गाळले जातात. पहिले, सक्रियता आहे की नाही यापेक्षा तिचा कालक्रम अधिक महत्त्वाचा होता: मिथिलीन ब्लूने AMPK तात्पुरते सक्रिय केले, तर तुलनेसाठी वापरलेल्या AICAR औषधाने ते दीर्घकाळ सक्रिय ठेवले. तात्पुरते सक्रिय करणाऱ्या पदार्थाने पेशीय वार्धक्याला सुमारे आठ पट अधिक प्रभावीपणे विलंब केला. त्यामुळे “मिथिलीन ब्लू AMPK सक्रिय करते” अशा स्वरूपाचा दावा अपुरा आहे; महत्त्वाचा दावा असा आहे की ते AMPK तात्पुरते सक्रिय करते, आणि या तुलनेतून दीर्घकाळची सक्रियता तेच काम करत नाही असे सुचते. दुसरे, मिथिलीन ब्लूने पेशीचक्र बदलले नाही. त्यामुळे सर्वांत साधे पर्यायी स्पष्टीकरण बाद होते: पेशी केवळ अधिक हळूहळू विभाजित झाल्या आणि म्हणून तुलनेने तरुण दिसल्या, असे नव्हते.

उंदरांमधील शाखा: वर्तन, जनुकीय संच आणि मुद्दाम विरोधाभासी उद्दीपक

मध्यमवयीन उंदरांचा अभ्यास करणाऱ्या एका गटाने पेशी-संवर्धनातील हे संशोधन प्राण्यांपर्यंत नेले. 60 दिवस तोंडावाटे मिथिलीन ब्लू दिल्यानंतर, उपचार मिळालेल्या उंदरांची शारीरिक सहनशक्ती आणि परिसराचा शोध घेण्याची प्रवृत्ती अधिक टिकून राहिली; तसेच उपचार न मिळालेल्या वृद्ध उंदरांच्या तुलनेत त्यांच्यात चिंतेसदृश वर्तन कमी दिसले. मेंदूच्या ऊतींमध्ये वृद्धत्वामुळे कमी झालेली NRF1, TFAM, SOD2 आणि कॉम्प्लेक्स IV चा उपघटक COX1 यांची जनुक-अभिव्यक्ती प्रौढ अवस्थेतील पातळीकडे परतली आणि mtDNA प्रतींची संख्या वाढली. वर्तन, नियामक आणि जनुकीय संचांचे प्रमाण यांचा समावेश असलेले हे निष्कर्ष मिथिलीन ब्लू आणि मेंदूतील माइटोकॉन्ड्रियल जैवनिर्मितीवरील मध्यमवयीन उंदरांच्या अभ्यासात नोंदवले आहेत.

प्रस्तावित उद्दीपक हा यातला रोचक भाग आहे, कारण मिथिलीन ब्लू हे अँटिऑक्सिडंट आहे या सोप्या कथनाच्या तो विरुद्ध जातो. उपचार मिळालेल्या उंदरांच्या मेंदूतील माइटोकॉन्ड्रियामध्ये प्रतिक्रियाशील ऑक्सिजन प्रजातींची, विशेषतः हायड्रोजन पेरॉक्साइडची, निर्मिती वाढलेली दिसली. लेखकांचा प्रस्ताव असा आहे: सौम्य पेरॉक्साइड संकेत Nrf2 मार्ग सक्रिय करतो आणि मग हा मार्ग जैवनिर्मितीचा कार्यक्रम चालवतो. या मॉडेलमध्ये मिथिलीन ब्लू उद्दीपनाच्या टप्प्यावर प्रो-ऑक्सिडंट असते आणि परिणामाच्या टप्प्यावर अँटिऑक्सिडंट. या पद्धतीला औषधशास्त्रज्ञ हॉरमेसिस म्हणतात; यात लहानसा ताण स्वतःपेक्षा मोठा संरक्षणात्मक प्रतिसाद घडवतो. पेरॉक्साइडमधील त्या वाढीमुळे प्रत्यक्षात Nrf2 सक्रिय होते का, हे थेट तपासले गेले नाही; तो प्रस्तावित दुवा आहे, मोजलेला संबंध नाही.

त्याच गटाच्या एका पूरक अभ्यासाने या प्रस्तावाच्या सुरक्षिततेची बाजू कठोरपणे तपासली. विलग केलेल्या मेंदूतील माइटोकॉन्ड्रियामध्ये मिथिलीन ब्लूने अगदी 50 nanomolar इतक्या कमी सांद्रतेपासूनही हायड्रोजन पेरॉक्साइडची निर्मिती वाढवली, तरी उपचारात्मक सांद्रतेमुळे माइटोकॉन्ड्रियल DNA चे आढळण्याजोगे नुकसान झाले नाही. उपचारात्मक पातळीपेक्षा खूप अधिक असलेल्या 100 micromolar सांद्रतेवरच निवडक mtDNA तुकड्यांमध्ये नुकसान दिसले. तसेच 20 micromolar रंगद्रव्य आणि लाल प्रकाश यांच्या संयोगामुळे सिंग्लेट ऑक्सिजन तयार झाला, ज्याने mtDNA चे व्यापक नुकसान केले. हा अंधारातील औषधशास्त्रीय परिणाम नसून रंगद्रव्याचा ज्ञात प्रकाशसंवेदक म्हणून होणारा प्रतिसाद आहे. पूर्वउपचारामुळे तर मध्यमेंदूच्या अधर भागातील माइटोकॉन्ड्रियाचे रोटेनोनमुळे होणाऱ्या mtDNA हानीपासून संरक्षणही झाले. मात्रेनुसार प्रतिसाद आणि जनुकविषारीपणासंबंधीची नियंत्रण चाचणी यांचा तपशील मिथिलीन ब्लूमुळे जनुकविषारी परिणामांशिवाय होणाऱ्या पेरॉक्साइड निर्मितीच्या अभ्यासात दिला आहे.

मोजलेले विरुद्ध प्रस्तावित: आकृती समजून घेणे

मजकुरात केलेला फरक स्पष्ट राखण्यासाठी खालील मार्ग-आकृती या लेखासाठी तयार केली आहे. सलग किनार असलेल्या चौकटी मिथिलीन ब्लूवरील संशोधन साहित्यात थेट प्रयोगात्मक आधार असलेले टप्पे दाखवतात: NAD/NADH बदलणारे रेडॉक्स चक्रण, AMPK चे तात्पुरते फॉस्फोरिलेशन, PGC-1alpha आणि SURF1 यांच्या अभिव्यक्तीत वाढ, कॉम्प्लेक्स IV ची अधिक क्रियाशीलता, NQO1 आणि TrxR1 यांच्या अभिव्यक्तीत वाढ, उंदरांच्या मेंदूत पूर्ववत झालेली जैवनिर्मिती जनुकांची अभिव्यक्ती आणि mtDNA प्रतींची संख्या, तसेच उपचारात्मक मात्रांवर mtDNA चे नुकसान न होता पेरॉक्साइडची वाढ. तुटक किनार असलेल्या चौकटी प्रस्तावित दुवे दाखवतात: Keap1 ने पेरॉक्साइड संकेत ओळखणे, केंद्रकात Nrf2 साचल्याने संरक्षणात्मक जनुके सक्रिय होणे आणि Nrf2 सक्रियतेपासून जैवनिर्मितीच्या कार्यक्रमाकडे जाणारा कारणसंबंध दाखवणारा बाण. हे तुटक टप्पे शक्य, आकडेवारीशी सुसंगत आणि पाठ्यपुस्तकातील प्रस्थापित जीवशास्त्राचा भाग आहेत. मात्र या संशोधनपत्रांमध्ये त्यांना सलग चौकटीचा दर्जा देण्यासाठी आवश्यक नियंत्रण चाचण्यांसह—केंद्रकातील Nrf2, ARE रिपोर्टर, Nrf2 नॉकआउट—त्यांचे मापन केले गेले नाही.

आकृती समोर आल्यावर तीन गोंधळ स्पष्ट दिसतात. पहिले, NRF1 आणि Nrf2 ही जवळपास सारखी नावे असलेली वेगवेगळी प्रथिने आहेत. उंदरांच्या अभ्यासात जैवनिर्मितीचा नियामक असलेला न्यूक्लिअर रेस्पिरेटरी फॅक्टर 1 मोजला गेला, अँटिऑक्सिडंट प्रतिलेखन घटक नव्हे. दोन्ही एकच मानल्यास संपूर्ण आकृती एका बिंदूत संकुचित होते. दुसरे, जनुक-अभिव्यक्ती ही प्रक्रियेची सुरुवात आहे, शेवट नाही. पूर्ववत झालेले TFAM किंवा COX1 संदेशवाहक RNA जैवनिर्मितीची सूचना दिली गेल्याला आधार देतात, तर mtDNA प्रतींची संख्या आणि कॉम्प्लेक्स IV ची क्रियाशीलता ही सूचना प्रत्यक्ष पूर्ण झाल्याचा पुरावा आहेत. तिसरे, अँटिऑक्सिडंट परिणाम Nrf2 मार्ग सिद्ध करत नाही. फायब्रोब्लास्टमधील ऑक्सिडंटची 28 टक्के घट आणि उंदरांमधील रोटेनोनपासूनचे संरक्षण हे पुढील टप्प्यांतील प्रत्यक्ष परिणाम आहेत, पण अनेक मार्ग हे परिणाम घडवू शकतात.

तुटक चौकट सलग करण्यासाठी काय आवश्यक आहे

अजून न केलेले प्रयोग हे नेहमीचेच आहेत. मिथिलीन ब्लूच्या संपर्कानंतर केंद्रकातील Nrf2 प्रथिनाचे मापन, तात्पुरत्या AMPK संकेताशी जुळणाऱ्या कालक्रमात केल्यास, समकालिक सक्रियतेच्या गृहीतकानुसार या दोन्ही शाखा खरोखर एकत्र सक्रिय होतात का, हे तपासता येईल. ARE-द्वारे चालणारा रिपोर्टर लक्ष्य जनुकांवरून अनुमान काढण्याऐवजी प्रतिलेखन क्रियाशीलतेची पुष्टी करेल. Nrf2 कमी करून किंवा पूर्णपणे निष्क्रिय करून जैवनिर्मितीची मापने पुन्हा केल्यास कारणसंबंध दर्शवणाऱ्या बाणाची थेट चाचणी होईल: Nrf2 शिवायही कॉम्प्लेक्स IV मधील वाढ आणि mtDNA मधील वाढ टिकून राहिली, तर जोडणारा दुवा चुकीचा आहे आणि AMPK शाखा एकटीच हा परिणाम घडवते. प्राण्यांच्या बाबतीत, नियामक, घटकांचे प्रमाण आणि कार्य या त्याच तीन तपासणी टप्प्यांचा समावेश असलेला दीर्घकाळ मात्रा देण्याचा अभ्यास कार्यक्रम सुरू राहतो की अनुकूलन होते, हे तपासेल. तोपर्यंत ऊर्जा आणि संरक्षण मार्गांची समकालिक सक्रियता तिच्या लेखकांनी म्हटल्याप्रमाणेच राहते: संभाव्य महत्त्वाचा घटक, प्रस्थापित यंत्रणा नव्हे.

व्यापक औषधशास्त्राच्या संदर्भातून येणाऱ्या वाचकांना आसपासचा संदर्भ जाणून घ्यायचा असेल: मिथिलीन ब्लू माइटोकॉन्ड्रियल पातळीवर इलेक्ट्रॉनचे वहन कसे करते, माइटोकॉन्ड्रिया आणि पेशीय ऊर्जेवर त्याचे आणखी कोणते परिणाम होतात, पेशीय वार्धक्यावरील निष्कर्ष वृद्धत्वाच्या संशोधनात कुठे बसतात, जैवनिर्मितीचे दावे संज्ञानात्मक कामगिरीशी कसे संबंधित आहेत आणि मात्रेविषयीच्या प्रत्येक चर्चेला मर्यादा घालणाऱ्या सुरक्षिततेच्या नोंदी काय आहेत. यांपैकी प्रत्येक स्वतंत्र संकल्पना आहे आणि प्रत्येकाचा स्वतःचा पुरावा आहे. या लेखाने Nrf2 साठी केले तसेच मोजलेले आणि प्रस्तावित यांच्यातील भेद राखून प्रत्येकाचा विचार करणे आवश्यक आहे.