मिथिलीन ब्लूचे माइटोकॉन्ड्रियावरील परिणाम मोजणे: ऑक्सिजन, ATP आणि झिल्ली विभव

समजा एखादी प्रयोगशाळा श्वसनक्रिया बाधित झालेल्या माइटोकॉन्ड्रियामध्ये मिथिलीन ब्लू घालते आणि ऑक्सिजनचा वापर वाढताना पाहते. अशावेळी रंजकाने माइटोकॉन्ड्रियाचे कार्य पूर्ववत केले, असे लिहावेसे वाटणे स्वाभाविक आहे. पण ते विधान चुकीचे असू शकते. ऑक्सिजन प्रवाह, ATP संश्लेषण आणि झिल्ली विभव या तीन वेगळ्या संकल्पना आहेत. बॅकअप, सिंक आणि शेअरिंग यांचा संबंध एकाच क्लाउड फोल्डरशी असतो, तसाच या तिन्हींचा संबंध एकाच पेशीअंगकाशी असतो: त्या परस्पर संबंधित असल्या तरी त्यांचे नियम वेगळे आहेत. एकाला दुसरे समजल्यास निष्कर्ष चुकीचा ठरतो, प्रत्येक मोजमाप तांत्रिकदृष्ट्या अचूक असले तरीही.

मिथिलीन ब्लूमुळे असा गोंधळ होण्याची शक्यता वाढते, कारण ज्या प्रणालीचे मोजमाप केले जाते त्यात तो स्वतः सहभागी असतो. तो मार्गाच्या आधीच्या टप्प्यांवर इलेक्ट्रॉन स्वीकारून पुढील टप्प्यांवर देणारा रेडॉक्स चक्रक आहे, ऊर्जित माइटोकॉन्ड्रियामध्ये साठणारा लिपोफिलिक धनायन आहे आणि सामान्य प्रोब ज्या वर्णपट पट्ट्यांमध्ये कार्य करतात त्याच पट्ट्यांमध्ये प्रकाश शोषणारा व उत्सर्जित करणारा गडद निळा संयुग आहे. एकच मोजमाप या सगळ्याचा अर्थ स्पष्ट करू शकत नाही. बुडापेस्टमधील माइटोकॉन्ड्रियल अभ्यासांमध्ये दिसलेली विश्वासार्ह पद्धत म्हणजे ऑक्सिजन प्रवाहासोबत ATP संश्लेषणाचा दर, झिल्ली विभव आणि हायड्रोजन पेरॉक्साइडचे विमोचन मोजणे, आणि प्रत्येक टप्प्यावर रंजकासाठी विशिष्ट नियंत्रणे वापरणे.

रेस्पिरोमेट्री ऑक्सिजन प्रवाह मोजते, ऊर्जा उत्पादन नाही

उच्च-विभेदन रेस्पिरोमेट्री, मग ती Oroboros Oxygraph ने केली असो किंवा Seahorse बाह्यपेशीय प्रवाह विश्लेषकाने, एकच गोष्ट सांगते: ऑक्सिजनचे क्षपण किती वेगाने होत आहे. प्रत्येक इलेक्ट्रॉनमागे किती प्रोटॉन पंप केले गेले, किती प्रवणता टिकवली गेली किंवा ATP सिंथेजने तिचा वापर केला का, हे ती सांगत नाही.

येथील संज्ञा महत्त्वाच्या आहेत. विलग केलेल्या माइटोकॉन्ड्रियामध्ये ADP शिवाय सब्स्ट्रेट दिल्यास गळती-श्वसन मिळते, संपृक्त करणाऱ्या प्रमाणातील ADP सोबत सब्स्ट्रेट दिल्यास ऑक्सिडेटिव्ह फॉस्फोरिलेशनची क्षमता मिळते आणि अनकप्लरचे टायट्रेशन केल्यास कमाल इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण क्षमता मिळते. अखंड पेशींमध्ये Seahorse मधील समतुल्य मोजमापे म्हणजे मूलभूत श्वसन, ऑलिगोमायसिन-संवेदनशील ATP-संबंधित श्वसन, प्रोटॉन गळती, FCCP ने निर्धारित कमाल श्वसन आणि रोटेनोन व अँटिमायसिन यांना प्रतिरोधक असलेला माइटोकॉन्ड्रियाबाहेरील ऑक्सिजन वापर. Seahorse च्या परिणामांना State 3 आणि State 4 म्हणणे म्हणजे नमुन्याच्या तयारीने समर्थित नसलेली अचूकता गृहीत धरणे होय, हे Agilent Mito Stress Test ची चौकट स्पष्ट करते.

अधिक ऑक्सिजन म्हणजे अधिक ऊर्जा, हा सहज वाटणारा संबंध मिथिलीन ब्लू मोडतो. विलग केलेल्या मेंदूतील माइटोकॉन्ड्रियावरील अभ्यासानुसार, गिनी पिगच्या मेंदूतील विलग माइटोकॉन्ड्रियामध्ये 100 nM ते 1 uM रंजकाने ग्लुटामेट आणि मॅलेट, सक्सिनेट, तसेच अल्फा-ग्लिसेरोफॉस्फेट या सब्स्ट्रेट्ससह विश्रांतीतील ऑक्सिजन वापर वाढवला; अल्फा-ग्लिसेरोफॉस्फेटवर ही वाढ साधारण 64 टक्के होती. तरीही निरोगी माइटोकॉन्ड्रियामधील ADP-उत्तेजित श्वसन जवळजवळ अपरिवर्तित राहिले. गळती वाढली, पण ADP-उत्तेजित प्रवाह स्थिर राहिल्याने गणिताने काढलेले श्वसन नियंत्रण गुणोत्तर कमी होते. ही घट म्हणजे रंजकाने माइटोकॉन्ड्रियाला नुकसान पोहोचवले असा अर्थ नाही. त्याचा अर्थ असा की रंजकाने सामान्य श्वसनासोबत ऑक्सिजन वापरणारे आणखी एक रेडॉक्स चक्र जोडले. केवळ ही वाढ नोंदवणाऱ्या मिथिलीन ब्लूच्या ऑक्सिजन वापर चाचणीने खरी रासायनिक प्रक्रिया मोजलेली असते, पण ऊर्जा संवर्धनाबद्दल काहीही सांगितलेले नसते.

कार्य पूर्ववत होण्याच्या प्रयोगांमध्ये हेच अंतर मोठ्या प्रमाणावर दिसते. कॉम्प्लेक्स I अवरोधित असताना ऑक्सिजन प्रवाह साधारण तीनपट पूर्ववत झाला, तर ATP संश्लेषण केवळ सुमारे 1.5 पट पूर्ववत झाले. अधिक ऑक्सिजन इलेक्ट्रोडपर्यंत पोहोचला. पण त्यातील कमी हिस्सा ATP निर्मितीसाठी उपयोगी पडला. ऑक्सिडेटिव्ह फॉस्फोरिलेशन सुधारल्याच्या कोणत्याही दाव्यासाठी ATP ची बाजूही मोजणे आवश्यक आहे; शक्यतो ती प्रति ऑक्सिजन ATP या गुणोत्तरात मांडावी आणि छेदासाठी वापरलेली पद्धत स्पष्ट करावी.

ATP चाचण्या संश्लेषणाचा दर मोजतात; एकूण प्रमाण त्याची जागा घेऊ शकत नाही

ATP चाचणी एका वेगळ्या प्रश्नाचे उत्तर देते: प्रति एकक वेळेत किती ATP तयार होते. काही मिनिटे नोंदवलेली काजव्याच्या ल्युसिफेरेजची प्रकाशदीप्ती असो किंवा 340 nm वर वाचली जाणारी हेक्सोकायनेज आणि ग्लुकोज-6-फॉस्फेट डिहायड्रोजनेज यांची युग्मित चाचणी असो, गतिमान मोजमापातून दर मिळतो. शेवटी एकदाच केलेले एकूण ATP चे मोजमाप त्याचे साठलेले प्रमाण देते. हे प्रमाण संश्लेषणातून वापर वजा केल्यावर उरलेली मात्रा दर्शवते आणि स्वतःहून ऑक्सिडेटिव्ह फॉस्फोरिलेशनबद्दल फारसे सांगत नाही.

बुडापेस्टच्या गटाने अॅडेनिलेट कायनेज दडपून युग्मित एन्झायमीय पद्धत वापरली. त्यांना आढळले की 1 ते 2 uM मिथिलीन ब्लूने रोटेनोन-उपचारित आणि अँटिमायसिन-उपचारित माइटोकॉन्ड्रियामध्ये ATP उत्पादन थोडे, पण सांख्यिकीयदृष्ट्या लक्षणीय प्रमाणात वाढवले. हे खरे कार्य-पुनर्स्थापन आहे, आणि ते आंशिक आहे. TEGDMA विषारीपणाच्या अभ्यासात वेगळ्या मॉडेलमध्येही अशाच स्वरूपाचे उत्तर मिळाले: 5 mM दंत मोनोमर TEGDMA मुळे कॉम्प्लेक्स I-संबंधित श्वसन साधारण 286 वरून 28 प्रवाह एककांपर्यंत घसरले आणि 2 uM रंजकाने ते साधारण 86 पर्यंत पूर्ववत केले.

रंगीत रेडॉक्स संयुग वापरताना दोन नियंत्रणे अपरिहार्य आहेत. पहिले, मोजलेल्या ATP संश्लेषणाचा किती भाग ATP सिंथेजवर अवलंबून आहे हे ठरवण्यासाठी ऑलिगोमायसिन वापरा. दुसरे, ज्ञात प्रमाणातील ATP, सर्व अभिकर्मके आणि प्रयोगात वापरलेल्या रंजकाच्या तंतोतंत सांद्रतांसह पेशीविरहित स्पाइक रिकव्हरी चाचणी करा; किमान 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM आणि 2 uM वापरा. रंजक उत्सर्जित प्रकाश शोषू शकतो, निर्देशक एन्झाइम रोखू शकतो किंवा अभिकर्मकांचे रेडॉक्स रसायन बदलू शकतो. सामान्य ल्युसिफेरेज चाचणी मार्गदर्शनात याच प्रकारचा हस्तक्षेप तपासण्यासाठी जैवरासायनिक प्रतिपडताळणी चाचण्या सुचवल्या आहेत. जास्त सांद्रतेवर प्रकाशशमन साधारणपणे अधिक तीव्र असते म्हणून 1 uM वर मोजमापातील कृत्रिम विकृती नसतील असे गृहीत धरू नका.

झिल्ली-विभव प्रोब रंजकाचे वितरण मोजतात, प्रवाह नाही

सॅफ्रॅनिन O, TMRM आणि TMRE, रोडामाइन 123 आणि JC-1 हे सर्व झिल्लीपार जाऊ शकणारे धनायन आहेत. विद्युतरासायनिक समतोलानुसार ते ऋणभारित मॅट्रिक्समध्ये साठतात. त्यामुळे एकूण प्रतिदीप्ती प्रोब कुठे आहे यावरून अप्रत्यक्षपणे विभव दर्शवते. यांपैकी कोणताही प्रोब ATP किंवा इलेक्ट्रॉन प्रवाह मोजत नाही.

प्रत्येक प्रोबसाठी काही नमुना-तयारी अधिक योग्य असते. सॅफ्रॅनिन O विलग माइटोकॉन्ड्रिया आणि पारगम्य केलेल्या पेशींसाठी योग्य आहे. साधारणपणे तो 2 uM जवळ, उत्तेजन सुमारे 495 nm आणि उत्सर्जन सुमारे 585 nm ठेवून वापरला जातो. तो प्रकाशशमन पद्धतीत कार्य करतो, ज्यात त्याच्या अंतर्ग्रहणाने एकूण प्रतिदीप्ती बदलते. TMRM आणि TMRE अखंड पेशींमध्ये कमी नॅनोमोलर प्रमाणात, प्रकाशशमन न होणाऱ्या पद्धतीत वापरण्यास योग्य आहेत. त्यात विध्रुवीकरणामुळे रंजक बाहेर पडतो आणि माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिदीप्ती कमी होते; जास्त प्रमाणात रंजक भरल्यास स्वयं-प्रकाशशमनामुळे संकेताची दिशा उलटू शकते. JC-1 सोयीस्कर हिरवा-ते-लाल गुणोत्तर देतो, पण तो रंजक भरण्याच्या प्रमाणावर आणि माइटोकॉन्ड्रियाच्या एकूण मात्रेवर अवलंबून असतो. त्यामुळे काळजीपूर्वक नियंत्रित TMRM पेक्षा तो परिमाणात्मक कामासाठी कमी सक्षम ठरतो. हे फायदे आणि मर्यादा मोठ्या प्रमाणावर वापरल्या जाणाऱ्या माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली-विभव प्रोबच्या आढाव्यात दिले आहेत.

मिथिलीन ब्लू नेमक्या प्रयोगात वापरल्या जाणाऱ्या सांद्रतांवर प्रकाशीय हस्तक्षेप करतो. सुमारे 600 ते 665 nm मधील त्याचे शोषण पट्टे लाल प्रोबच्या उत्सर्जनाशी जुळतात. त्यामुळे अंतर्गत-गाळणी परिणाम, प्रकाशशमन आणि उत्तेजक प्रकाशाचे शोषण या तिन्ही शक्यता विचारात घ्याव्या लागतात. रंजक हा दुसरा लिपोफिलिक धनायनही आहे, आणि त्याचे स्वतःचे वितरण मोजल्या जाणाऱ्या विभवानुसार बदलते. यावर उपाय म्हणजे एकापेक्षा अधिक पद्धती आणि ब्लँक नियंत्रणे: फक्त प्रोब, फक्त रंजक, प्रोबासोबत रंजकाची प्रत्येक सांद्रता, शून्य संदर्भासाठी FCCP ने पूर्ण विध्रुवीकरण आणि शक्य असल्यास प्रकाशीयदृष्ट्या वेगळा दुसरा प्रोब. कॉम्प्लेक्स III वळसा-अभ्यासाने याचे उदाहरण दिले: अँटिमायसिन आणि मायक्सोथायाझोलच्या अवरोधानंतर झिल्ली विभव पूर्ववत होण्याची चाचणी सॅफ्रॅनिन O आणि TMRM या दोन्हींसह पुन्हा केली आणि गुणात्मकदृष्ट्या समान पुनर्स्थापन मिळाले. एक प्रकाशीय निर्देशक सूचक ठरतो. दोन स्वतंत्र निर्देशक पुरावा देतात.

तीन नमुना-तयारी, तीन वेगळे प्रश्न

विलग माइटोकॉन्ड्रिया, पारगम्य केलेल्या पेशी आणि अखंड पेशी हे एकाच चाचणीतील परस्पर बदलता येणारे संवेदनशीलतेचे पर्याय नाहीत. या वेगवेगळ्या संकल्पना आहेत आणि त्यांची कार्यतत्त्वे वेगळी आहेत.

विलग माइटोकॉन्ड्रियामध्ये इलेक्ट्रॉन वाहतूक साखळी, आतील झिल्ली आणि मॅट्रिक्सची यंत्रणा टिकून राहते, तर पेशीझिल्ली, सायटोसोल आणि जाळ्याची रचना काढली जाते. हे काढून टाकणे हाच उद्देश असतो: सब्स्ट्रेट्स, ADP, अवरोधक आणि रंजकाच्या सांद्रता तंतोतंत निश्चित करता येतात, त्यामुळे मार्ग ओळखता येतो. याची किंमत म्हणजे नैसर्गिक सब्स्ट्रेट पुरवठा, संकेतप्रणाली आणि ऊर्जा मागणी गमावली जाते.

पारगम्य केलेल्या पेशींमध्ये माइटोकॉन्ड्रिया त्यांच्या पेशीय रचनेच्या मोठ्या भागातच राहतात, तर उघडलेल्या पेशीझिल्लीतून बाहेरून दिलेले सब्स्ट्रेट्स आणि ADP आत जाऊ शकतात. पेशीय संदर्भात सब्स्ट्रेट-मार्गातील दोष निश्चित करण्यासाठी हे योग्य साधन आहे. अतिपारगम्यीकरणामुळे बाह्य माइटोकॉन्ड्रियल झिल्लीला नुकसान होते आणि सायटोसोलमधील नियमन धुऊन निघून जाते.

अखंड पेशींमध्ये सर्व काही टिकून राहते: पेशीझिल्लीचा अडथळा, सायटोसोलमधील क्षपणकारक, अंतर्जात सब्स्ट्रेट वाहतूक, माइटोकॉन्ड्रियाचे जाळे आणि ATP ची मागणी. त्या शरीरक्रियाशास्त्रीय स्थितीच्या सर्वात जवळ आणि यंत्रणेच्या स्पष्टीकरणापासून सर्वात दूर असतात, कारण रंजकाचे अंतर्ग्रहण, क्षपण आणि वेगळ्या कप्प्यांत साठवण या सर्व गोष्टी माइटोकॉन्ड्रियाला प्रत्यक्ष किती रंजकाचा संपर्क होतो हे ठरवतात.

TEGDMA अभ्यासाने हे तिन्ही स्तर जाणीवपूर्वक वापरले: ऑक्सिडेशन आणि विभव रंजकाने पूर्ववत होतात का हे पाहण्यासाठी विलग मेंदू-माइटोकॉन्ड्रिया, दोष मुख्यतः कॉम्प्लेक्स I-संबंधित सब्स्ट्रेट ऑक्सिडेशनमध्ये आहे हे निश्चित करण्यासाठी पारगम्य केलेल्या दंत पल्प मूलपेशी आणि दडपलेल्या ऑक्सिजन वापरावर 2 uM रंजकाचा शरीरक्रियाशास्त्रीय निव्वळ परिणाम पाहण्यासाठी अखंड मूलपेशी. वेगवेगळ्या नमुना-तयारींमधील माइटोकॉन्ड्रियल मोजमापांची तुलना करणाऱ्या वाचकांसाठी, मिथिलीन ब्लू श्वसन साखळीतून इलेक्ट्रॉन कसे हलवतो यावरील सोबतचा स्पष्टीकरणात्मक लेख मार्गाची पार्श्वभूमी देतो, तर मिथिलीन ब्लूच्या श्वसन-अभ्यासांचे वाचन कसे करावे यावरील मार्गदर्शक मात्रा आणि अवरोधकांमागील तर्क स्पष्ट करतो.

रेडॉक्स-सक्रिय रंजकासाठी आवश्यक नियंत्रणे

रेडॉक्स चक्रकासाठी सामान्य अवरोधकापेक्षा नियंत्रणांची मोठी यादी लागते, कारण केवळ रंजकाची रासायनिक प्रक्रिया जैविक प्रक्रियेसारखी भासू शकते.

रेस्पिरोमेट्रीसाठी मोजमापातील सरकाव तपासण्याकरिता फक्त बफर असलेला कक्ष, जैविक सामग्री नसलेला बफर आणि रंजकाचा कक्ष, रंजकासोबत चाचणीत उपस्थित असलेला कोणताही बाह्यपेशीय क्षपणकारक आणि अखंड पेशींमधील माइटोकॉन्ड्रियाबाहेरील ऑक्सिजन वापर निश्चित करण्यासाठी शेवटी रोटेनोन आणि अँटिमायसिन वापरा. लक्षात ठेवा की क्षपित रंजक ऑक्सिजनला इलेक्ट्रॉन देऊन पुन्हा ऑक्सिडित होतो आणि हायड्रोजन पेरॉक्साइड तयार करतो. त्यामुळे इलेक्ट्रॉनदाता नसलेले फक्त रंजकाचे ब्लँक नियंत्रण, NADH किंवा NADPH उपलब्ध झाल्यावर दिसणाऱ्या पेशीविरहित ऑक्सिजन वापराचा कमी अंदाज देते.

हायड्रोजन पेरॉक्साइडसाठी, निवडक नसलेल्या DCFDA रंजकांपेक्षा अंशांकित Amplex UltraRed आणि हॉर्सरॅडिश पेरॉक्सिडेजला प्राधान्य द्या, कॅटालेजने पडताळणी करा आणि प्रकाशावर अवलंबित्व तपासा, कारण रंजक प्रकाशसंवेदक आहे. मेंदू-माइटोकॉन्ड्रिया अभ्यासात केवळ 100 nM रंजकावर पेरॉक्साइडचा भार चारपटीहून अधिक वाढला आणि त्याचे निर्मूलन मंदावले असे आढळले; सुपरऑक्साइडचा मध्यवर्ती टप्पा न येता क्षपित रंजकाने थेट पेरॉक्साइड तयार केले. प्रोबची निवड आणि प्रकाश नियंत्रणे यांचे तपशील रंजकाच्या प्रयोगांमध्ये प्रतिक्रियाशील ऑक्सिजन प्रजाती मोजणे या सोबतच्या लेखात आहेत. पेरॉक्साइड कधी संकेत म्हणून आणि कधी भार म्हणून कार्य करतो हा व्यापक प्रश्न पेशीय रेडॉक्स संतुलन आणि अँटिऑक्सिडंट दावे यांसोबत चर्चिला आहे.

मार्गांबद्दलच्या दाव्यांसाठी कॉम्प्लेक्स III च्या दोन्ही अवरोधक स्थळांची चाचणी करा: Qi स्थळावर अँटिमायसिन A आणि Qo स्थळावर मायक्सोथायाझोल, तसेच सायनाइडने कॉम्प्लेक्स IV चा अंतिम बिंदू तपासा. उंदराच्या मेंदूवरील आधीच्या अभ्यासात रोटेनोनने अवरोधित श्वसन रंजकाने पूर्ववत झाल्याचे, पण अँटिमायसिनने अवरोधित श्वसन पूर्ववत न झाल्याचे नोंदवले होते. नंतरच्या तीन प्रजातींच्या अभ्यासात मात्र दोन्ही अवरोधकांसह आंशिक पुनर्स्थापन आणि सायटोक्रोम c च्या थेट क्षपणाचे पुरावे मिळाले. हा वळसा निश्चित सिद्ध झाला आहे असे न मानता, तो नव्या आकडेवारीशी सुसंगत आहे असे माना, कारण रंजकाची सांद्रता, अवरोधकाचे स्थळ, सब्स्ट्रेटची स्थिती आणि रंजकाचे वितरण या सर्वांमुळे दिसणारा मार्ग बदलतो.

चाचणी-निवड तक्ता

प्रश्नानुसार मोजमाप निवडण्यासाठी हा तक्ता वापरा; मोजमापानुसार प्रश्न निवडू नका.

किमान विश्वासार्ह दाव्यासाठी रंजकाच्या त्याच सांद्रता—100 nM, 300 nM, 1 uM आणि 2 uM—वापरून गळती, ADP, ऑलिगोमायसिन आणि अनकप्लर या स्थितींतील ऑक्सिजन प्रवाह, ATP संश्लेषण दर, शक्यतो दोन प्रोबसह झिल्ली विभव आणि कॅटालेज व पेशीविरहित नियंत्रणांसह अंशांकित पेरॉक्साइड विमोचन मोजावे लागते. परस्पर जोडलेला संच नोंदवा: ऑक्सिजन प्रवाह, ATP दर, प्रति ऑक्सिजन ATP, विभव आणि पेरॉक्साइड. यांपैकी कोणताही एक आकडा स्वतंत्रपणे म्हणजे अर्थाच्या शोधात असलेले मोजमाप आहे.