मेथिलीन ब्लूचे साधे रंजन विरुद्ध ग्राम रंजन: प्रत्येक पद्धत काय सिद्ध करू शकते

एक विद्यार्थी E. coli असे लेबल असलेल्या संवर्धनातून स्मिअर तयार करतो, त्यावर एक मिनिट मेथिलीन ब्लू ओततो, धुऊन घेतो आणि ऑइल-इमर्शन भिंगातून पाहतो. संपूर्ण दृश्यक्षेत्रात निळ्या दंडाकार पेशी दिसतात. प्रयोगशाळेच्या अहवालात लिहिले जाते: "ग्राम-ऋण दंडाकार जिवाणूंची E. coli म्हणून ओळख पटली." निरीक्षण बरोबर आहे. पण त्या स्लाइडवरून हा निष्कर्ष काढता येत नाही.

ही चूक तांत्रिक नसून संकल्पनात्मक आहे. विद्यार्थ्याने साध्या रंजनाला विभेदक चाचणी समजले. साधे रंजन आणि ग्राम रंजन वेगवेगळ्या प्रश्नांची उत्तरे देतात, कारण त्यामागील रंजनाच्या संकल्पना वेगळ्या आहेत. पहिली पद्धत विचारते: कोणता आकार दिसतो. दुसरी विचारते: विशिष्ट प्रक्रियेला सामोरे गेल्यावर पेशीभित्तिका कशी वागते. या दोन गोष्टींची गल्लत केली तर योग्य रीतीने रंगवलेल्या स्लाइडवरूनही आधार नसलेला अहवाल तयार होतो.

ही तुलना दोन्ही पद्धतींमधील फरक स्पष्ट ठेवते, प्रत्येक निष्कर्षावरून कोणते विधान करता येते हे दाखवते आणि विद्यार्थी सर्वाधिक विचारतात त्या दोन प्रश्नांची उत्तरे देते: ग्राम रंजनात मेथिलीन ब्लू वापरता येते का, आणि E. coli चे मेथिलीन ब्लू रंजन प्रत्यक्षात काय दाखवते.

थोडक्यात उत्तर

मेथिलीन ब्लूच्या साध्या रंजनात रंग घेऊ शकणारी प्रत्येक पेशी एकाच निळ्या रंगात रंगते. त्यामुळे आकाररचना (दंडाकार, गोलाकार, सर्पिलाकार) आणि मांडणी (एकेकट्या, जोड्यांमध्ये, साखळ्यांमध्ये) दिसते, पण ग्राम वर्गाबद्दल काहीही समजत नाही. ग्राम रंजनात आयोडीन, विरंजनाची पायरी आणि प्रतिरंजक जोडले जातात. त्यामुळे पेशींची आवरणे रंग किती टिकवून ठेवतात यावरून जिवाणू ग्राम-धन (जांभळे) आणि ग्राम-ऋण (गुलाबी किंवा लाल) असे विभागले जातात. मेथिलीन ब्लूनंतर निळ्या दंडाकार पेशी दिसण्याचा अर्थ "दंडाकार पेशी उपस्थित आहेत" एवढाच असतो. संपूर्ण ग्राम प्रक्रियेनंतर गुलाबी दंडाकार पेशी दिसण्याचा अर्थ "ग्राम-ऋण दंडाकार जिवाणू उपस्थित आहेत" असा होतो. दुसरे विधान अधिक ठोस आहे, कारण त्या प्रक्रियेत एक अतिरिक्त चाचणी केली गेली.

हा लेख ज्या एकरंगी जिवाणू रंजन पद्धतींच्या व्यापक गटाशी संबंधित आहे, त्यासाठी सूक्ष्मदर्शकीय रंजनाचा चित्रसंग्रह पाहा.

साधे रंजन: एक रंगद्रव्य, एक प्रश्न

मेथिलीन ब्लू हे क्षारीय (धनायनिक) रंगद्रव्य आहे. त्याच्या रंगीत आयनावर धन प्रभार असतो आणि तो पेशीतील ऋण प्रभार असलेल्या रचनांना, त्यात न्यूक्लिक आम्ले आणि पृष्ठभागावरील आम्लीय गटांचा समावेश होतो, जोडला जातो. त्यामुळे फिकट पार्श्वभूमीवर पेशी निळ्या दिसतात. OpenStax आपल्या रंजनावरील प्रकरणात या धनात्मक रंजनाच्या तत्त्वाचे वर्णन करते. रंगद्रव्याचा धनायन स्वतः एक लहान, सपाट फेनोथायाझीन आयन आहे, ज्याचे सविस्तर वर्णन मेथिलीन ब्लूच्या रसायनशास्त्रीय संदर्भात दिले आहे; क्लोराइड प्रतिआयन रंग देत नाही.

अध्यापनातील मानक प्रक्रिया मुद्दाम साधी ठेवलेली असते: पातळ स्मिअर तयार करा, हवेत वाळवा, उष्णतेने स्थिर करा, सुमारे 1% जलीय मेथिलीन ब्लूने साधारण एक मिनिट पूर्ण झाका, पाण्याने हलकेच धुवा, टिपून कोरडे करा आणि ऑइल-इमर्शन पद्धतीने तपासा. LibreTexts मधील अध्यापनाची प्रक्रिया नेमकी हीच 1%, एक मिनिटाची पद्धत देते, तसेच काही प्रयोगशाळा हा वेळ वाढवतात असेही नमूद करते. रंगबंधक नाही, विरंजक नाही, दुसरे रंगद्रव्य नाही. ही अनुपस्थितीच महत्त्वाची आहे. एकच रंगद्रव्य आणि निवडक रंग काढून टाकण्याची पायरी नसल्यामुळे रंगद्रव्याशी बंध तयार करणारी प्रत्येक पेशी शेवटी एकाच रंगाची दिसते.

E. coli साठी अपेक्षित दृश्यक्षेत्रात निळ्या दंडाकार पेशी (बॅसिली) एकेकट्या, जोड्यांमध्ये किंवा लहान समूहांत दिसतात. निळा रंग रंगद्रव्यामुळे येतो. दंडाकार रूप जीवाचे स्वतःचे असते. पण या दोन्हींच्या संयोगावरून जीवाची ओळख पटत नाही, कारण अनेक प्रजाती दंडाकार असतात आणि साध्या रंजनात अनेक दंडाकार पेशी निळ्या रंगतात. ATCC आपल्या सूक्ष्मजीव संवर्धन मार्गदर्शिकेत ही केवळ आकाररचनेपुरती असलेली मर्यादा स्पष्ट करते. योग्य अहवाल असा असतो: "निळ्या दंडाकार पेशी दिसल्या." आकार आणि मांडणीपलीकडील कोणत्याही विधानासाठी अधिक पुरावा आवश्यक असतो.

ग्राम रंजन: चार अभिकर्मके, एक वर्तनाधारित चाचणी

ग्राम रंजन हे विभेदक रंजन आहे. यात सर्व पेशींवर एकच क्रमवार प्रक्रिया केली जाते आणि कोणत्या पेशी पहिले रंगद्रव्य टिकवून ठेवतात व कोणत्या ते गमावतात हे पाहिले जाते. American Society for Microbiology च्या ग्राम रंजन प्रक्रियांमध्ये मानक चार पायऱ्यांचा क्रम दिला आहे: क्रिस्टल व्हायोलेट (प्राथमिक रंजक), ग्राम आयोडीन (रंगबंधक), अल्कोहोल किंवा अॅसिटोन-अल्कोहोल (विरंजक), त्यानंतर सॅफ्रॅनिन (प्रतिरंजक).

अध्यापनातील मानक स्पष्टीकरणानुसार हा फरक पेशीच्या आवरणाच्या रचनेमुळे पडतो. ग्राम-धन पेशींमध्ये जाड पेप्टिडोग्लायकॅन भित्तिका असते. अल्कोहोलने धुताना तिचे निर्जलीकरण होते आणि ती क्रिस्टल व्हायोलेट-आयोडीन संकुल टिकवून ठेवते. ग्राम-ऋण पेशींमध्ये पातळ पेप्टिडोग्लायकॅन थरासोबत लिपिडयुक्त बाह्य पडदा असतो. विरंजक हा पडदा विस्कळीत करते, त्यामुळे संकुल धुऊन निघते आणि नंतर पेशी सॅफ्रॅनिन ग्रहण करतात. NCBI Bookshelf वरील ग्राम रंजनाच्या आढाव्यात हे पेशीभित्तिकेवर आधारित स्पष्टीकरण दिले आहे. तज्ज्ञांच्या मते यामागील संपूर्ण भौतिक-रासायनिक प्रक्रिया केवळ भित्तिकेच्या जाडीपेक्षा अधिक गुंतागुंतीची आहे. तरी प्रयोगशाळेत अर्थ लावताना वर्तनाधारित नियम लागू राहतो: जांभळा म्हणजे रंग टिकवला, गुलाबी म्हणजे पहिला रंग गमावला आणि नंतर प्रतिरंजन झाले.

उदाहरणात्मक चित्रे. पद्धतींच्या तुलनेसाठी शैलीबद्ध रेखाचित्रे; कॅमेऱ्याने घेतलेली सूक्ष्मदर्शकीय छायाचित्रे नाहीत. तर्क समजावण्यासाठी रंग सोपे करून दाखवले आहेत: साध्या रंजनात एक रंग, ग्राम विरंजनानंतर दोन रंग.

ग्राम रंजनात मेथिलीन ब्लू वापरता येते का

या प्रश्नाचे दोन अर्थ असू शकतात आणि त्यांची उत्तरे वेगवेगळी आहेत.

पहिला अर्थ: मेथिलीन ब्लू एकदा ओतून संपूर्ण ग्राम प्रक्रियेची जागा घेता येते का. नाही. आयोडीन, विरंजक आणि प्रतिरंजक नसल्यास विभेदक पायरीच होत नाही, त्यामुळे ग्राम वर्गाची चाचणी होत नाही. फक्त मेथिलीन ब्लूनंतर दिसणारे निळे दृश्यक्षेत्र हे साध्या रंजनाचे निष्पन्न आहे, जरी ती बाटली ग्राम अभिकर्मकांच्या शेजारी ठेवलेली असली तरी. त्याची ग्राम रंजनाचा परिणाम म्हणून नोंद करू नका.

दुसरा अर्थ: पायरी 4 मध्ये प्रतिरंजक म्हणून मेथिलीन ब्लू सॅफ्रॅनिनची जागा घेऊ शकते का. कार्याच्या दृष्टीने ते विरंजित पेशींना रंगवू शकते आणि पाठ्यपुस्तकातील सरावानुसार असा बदल केल्यास ग्राम-धन पेशी जांभळ्या आणि ग्राम-ऋण पेशी निळ्या दिसतील. हा तर्क योग्य आहे, कारण योग्य प्रकारे विरंजित झालेल्या ग्राम-ऋण पेशी जवळजवळ रंगहीन असतात आणि दुसरे धनायनिक रंगद्रव्य ग्रहण करतात. पण ही मानक प्रक्रिया नाही. ASM प्रक्रियांमध्ये सॅफ्रॅनिन वापरण्यास सांगितले आहे; काही प्रकारांमध्ये बेसिक फुक्सिनसारखे मान्य पर्याय आहेत, मेथिलीन ब्लू नाही. याची एक व्यावहारिक अडचणही आहे: जांभळ्या रंगापासून गुलाबी रंग वेगळा ओळखण्यापेक्षा जांभळ्यापासून निळा वेगळा ओळखणे कठीण असते, विशेषतः नवशिक्यांसाठी आणि विशेषतः सूक्ष्मदर्शकाचे दिवे मंदावलेले असताना. अभ्यासक्रमातील कामासाठी आणि कोणत्याही महत्त्वाच्या निष्कर्षासाठी तुमच्या प्रक्रियेत नमूद केलेले प्रतिरंजक वापरा, जे सहसा सॅफ्रॅनिन असते. मेथिलीन ब्लू प्रतिरंजकाला समतुल्य मानक पद्धत न मानता प्रात्यक्षिकासाठीचा पर्यायी प्रकार समजा.

इतर एकरंगी पर्यायांशी मेथिलीन ब्लूची तुलना कशी होते, हा संबंधित प्रश्न जिवाणूंच्या साध्या रंजन पद्धतींच्या तुलनेत चर्चिला आहे.

E. coli चे मेथिलीन ब्लू रंजन काय सिद्ध करते आणि काय सिद्ध करत नाही

E. coli हा ग्राम-ऋण दंडाकार जिवाणू आहे, पण या वाक्यात अनेक पद्धतींमधून मिळालेली तथ्ये एकत्र आहेत: सूक्ष्मदर्शनातून आकाररचना, ग्राम रंजनातून ग्राम प्रतिक्रिया आणि संवर्धनासोबत जैवरासायनिक किंवा आण्विक चाचण्यांतून ओळख. मेथिलीन ब्लू स्मिअर फक्त पहिल्या भागाची माहिती देते. रंगवलेल्या नमुन्यात दंडाकार पेशी उपस्थित आहेत आणि त्यांची मांडणी कशी आहे, हे ते स्थापित करते. त्यावरून ग्राम प्रतिक्रिया स्थापित होत नाही, कारण विरंजनाची चाचणी केलेली नसते. प्रजातीची ओळखही पटत नाही, कारण या विभेदन क्षमतेवर अनेक प्रजातींच्या दंडाकार पेशी सारख्याच दिसतात.

अहवालांमध्ये ठरावीक प्रकारची चूक इथे होते. लेखक पार्श्वभूमीतील माहिती ("हे संवर्धन E. coli चे असणे अपेक्षित आहे आणि E. coli ग्राम-ऋण आहे") निरीक्षणाच्या नोंदीत मिसळतो. त्यामुळे प्रत्यक्षात गृहीत धरलेली गोष्ट स्लाइडने पुष्टी केल्यासारखी दिसते. अधिक स्पष्ट अहवालात हे स्तर वेगळे ठेवले जातात: "मेथिलीन ब्लूचे साधे रंजन: निळ्या दंडाकार पेशी दिसल्या; केवळ आकाररचना, ग्राम वर्गाची चाचणी केलेली नाही." त्यानंतर, नियंत्रण नमुन्यांसह ग्राम रंजन योग्य प्रकारे केले असल्यास: "ग्राम रंजन: गुलाबी दंडाकार पेशी, ग्राम-ऋण जिवाणूंशी सुसंगत." प्रजातीची ओळख नंतर ओळख-निश्चितीच्या कार्यप्रवाहातून मिळते, केवळ रंगावरून नाही.

अर्थ लावण्यासाठी व्यावहारिक मार्गदर्शक

प्रयोगशाळेत हा निर्णयाचा नियम वापरा. सर्व पेशी एकाच रंगाच्या असतील आणि प्रक्रियेत विरंजक न वापरता एकच रंगद्रव्य वापरले असेल, तर तुम्ही साधे रंजन केले आहे. आकार, आकारमानाचा अंदाज आणि मांडणी नोंदवा. तिथेच थांबा. प्रक्रियेत ज्ञात धन आणि ऋण नियंत्रण नमुन्यांसह क्रिस्टल व्हायोलेट, आयोडीन, विरंजक आणि प्रतिरंजक वापरले असतील, तर तुम्ही ग्राम रंजन केले आहे. रंगासोबत आकाररचना नोंदवा: साखळ्यांमधील जांभळ्या गोलाकार पेशी, गुलाबी दंडाकार पेशी इत्यादी.

बहुतेक गोंधळाला तीन चुका कारणीभूत असतात. पहिली, निळ्या दंडाकार पेशींवरून E. coli ची पुष्टी झाल्याचा अतिरेकी निष्कर्ष काढणे. दुसरी, नोंदवहीत मेथिलीन ब्लू स्लाइडची नोंद "ग्राम रंजन" या शीर्षकाखाली करणे, ज्याचा नंतर वाचणारे चुकीचा अर्थ लावतील. तिसरी, प्रतिरंजक सहज बदलणे आणि मग सर्वत्र तेच रंग वापरले असल्यासारखी वेगवेगळ्या प्रयोगशाळांतील रंगांची तुलना करणे. प्रत्येक चुकीवर उपाय एकच आहे: प्रत्यक्षात केलेल्या पद्धतीचे नाव द्या आणि ती पद्धत जे तपासते तेवढेच विधान करा.

साधे रंजन मर्यादित निष्कर्ष देते म्हणूनच त्याला महत्त्व आहे. ते जलद आहे, किरकोळ चुका झाल्या तरी उपयोगी ठरते आणि आकाररचनेचा प्रश्न असेल तेव्हा पुरेसे असते: काही उपस्थित आहे का आणि त्याचा आकार काय आहे. प्रश्न वर्गीकरणाचा असेल, तर विभेदक चाचणी करा. निळी स्लाइड पेशी कशा दिसतात ते सांगते. जांभळी किंवा गुलाबी स्लाइड त्यांच्या भित्तिका कशा वागतात ते सांगते. कोणतीही एक स्लाइड स्वतःहून प्रजाती सांगत नाही.